專利名稱：蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及退化食用菌菌株的復(fù)壯，具體的講是一種蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法。

背景技術(shù)：
栽培食用菌，需要獲得高產(chǎn)，菌株是關(guān)鍵。蛹蟲草為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌 科、蟲草屬的模式種。學(xué)名為Cordyc印smiIi taris，又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草，是冬蟲夏草 的同屬近緣種，其有效組分與冬蟲夏草類似，含有核苷類、多糖類、留醇類以及S 0 D酶等， 且蟲草素含量更是高于冬蟲夏草，具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、防衰老、保護(hù)心肺組織、鎮(zhèn) 靜催眠等多種藥理作用。因此，蛹蟲草作為冬蟲夏草替代品用在保健藥品和食品上，市場需 求量大。近些年來，我國人工栽培蛹蟲草的關(guān)鍵技術(shù)得以突破，使得大規(guī)模人工培養(yǎng)蛹蟲草 得以現(xiàn)實(shí)。然而在生產(chǎn)栽培和實(shí)踐過程中，必然會遇到菌種的衰退或退化問題，使菌種的優(yōu) 良性狀在一定程度上衰退或喪失。蛹蟲草菌株的衰退主要表現(xiàn)在，菌絲生長速度減慢，菌絲 稀疏，子實(shí)體產(chǎn)生率低或子實(shí)體個體矮小，畸變，發(fā)酵過程中，所需代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量大幅降 低等現(xiàn)象。導(dǎo)致微生物菌株的衰退是多方面原因引起，可以是由自發(fā)突變的量變到質(zhì)變的產(chǎn) 生，可以是由環(huán)境因素不適宜導(dǎo)致發(fā)生變異，或者是由它種微生物的侵襲所導(dǎo)致，或者保藏 方式不當(dāng)，一味的移接、傳代，而使群體中的負(fù)變異不斷擴(kuò)大等諸方面原因所造成。微生物菌株衰退后，需要采取復(fù)壯的方法來恢復(fù)其原有的優(yōu)良性狀，通常采用的 方法是進(jìn)行純種分離后測定其典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù) 尚未退化的個體，或通過其它的實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行復(fù)壯，使退化菌株恢復(fù)原有優(yōu)良性狀的相應(yīng) 措施。現(xiàn)階段，食用菌的復(fù)壯主要方法有以下幾種
1.組織分離是將退化菌株出菇后，選擇相對出菇時間早，子實(shí)體外觀健壯，抗病 能力強(qiáng)等性狀的子實(shí)體采摘下來，在無菌條件下用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行組織分離。分離獲得的 菌株，經(jīng)生物學(xué)性能測定，選擇出優(yōu)良性狀的菌株，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，若出菇后的子實(shí)體能恢 復(fù)原有性狀，將其分離后的菌株可作為后續(xù)栽培原種使用；若出菇后的子實(shí)體還未回復(fù)原 有性狀，則必須再次進(jìn)行組織分離復(fù)壯。2.菌絲純化與尖端菌絲分離挑取健壯的菌絲體頂端部分，進(jìn)行純化培養(yǎng)，使菌 絲恢復(fù)以保持菌種的純度，是菌種恢復(fù)原來生活力和優(yōu)良性狀，達(dá)到復(fù)壯的目的。3.有性孢子分離篩選選擇形態(tài)好，生長勢健壯的八成熟的子實(shí)體，采用孢子收 集器收集有性孢子，進(jìn)行多孢或單孢分離培養(yǎng)。獲得的單核菌絲，還需和另一可親和的單核 菌絲雜交后形成雙核菌絲，再進(jìn)行出菇培養(yǎng)。孢子分離需要反復(fù)試驗(yàn)，出菇性能好的，才能 作為優(yōu)良菌株投入生產(chǎn)栽培中。在蛹蟲草工廠化栽培的過程中如何解決菌種衰退，菌絲體生長速度減慢，菌絲稀 疏，粉孢子量增多，子實(shí)體形成率降低或子實(shí)體個體矮小，畸形以及發(fā)酵過程中，所需代謝 產(chǎn)物的產(chǎn)量大幅降低等問題，已經(jīng)成為蛹蟲草工廠化栽培的關(guān)鍵問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，以達(dá)到解決由于反復(fù)傳代而 導(dǎo)致蛹蟲草菌株出現(xiàn)退化等問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的蛹蟲草菌株復(fù)壯的方法，主要包括以下步驟
a)將退化的蛹蟲草菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，25°C進(jìn)行活化培養(yǎng)； PDA斜面培養(yǎng)基為土豆200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L, pH 7.0
b)將活化后的蛹蟲草菌株接種于含有一種或兩種抗生素的的PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng) 3-5 d ；
c)將經(jīng)過第一次復(fù)壯后的菌株，再次接種于含有一種或兩種抗生素的PDA培養(yǎng)基上， 25 °C 培養(yǎng) 3-5 d ；
d)將第二次復(fù)壯后的菌株接種于PDA斜面上，作為栽培原種使用。所述的抗生素為氨基糖苷類抗生素和青霉素類抗生素。氨基糖苷類抗生素是指 鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、核糖霉素、小諾霉素。青霉素類抗生 素是指氨芐青霉素、頭孢拉定、先鋒IV、先鋒V號。采用兩種抗生素時，所用的抗生素應(yīng)分別是氨基糖苷類抗生素和青霉素類抗生素 中的一種。兩種抗菌素之間按任意比例復(fù)合配制，復(fù)配后抗生素在PDA培養(yǎng)基中的終濃度 為 0. 02 2mg/ml。采用本發(fā)明所述的方法，適用于由于反復(fù)傳代而導(dǎo)致菌種退化的菌株復(fù)壯。退化 具體表現(xiàn)為出現(xiàn)菌絲稀疏、生長速度變慢、粉孢子增多、子實(shí)體形成率低、畸形量多、代謝 產(chǎn)物蟲草素的含量降低等現(xiàn)象。本發(fā)明突破了傳統(tǒng)的菌株復(fù)壯方法，采用抗生素法對菌株進(jìn)行復(fù)壯，此方法操作 容易，簡單易行，且效果顯著。經(jīng)過此種方法復(fù)壯后的菌株，其菌絲粗壯，致密，生長速度相 較于復(fù)壯前有了較大的提高，在固體栽培中，子實(shí)體形成率大幅提高，個體大小較均勻，畸 形率降低，，在液體發(fā)酵中，發(fā)酵液的蟲草素的產(chǎn)量也大幅度提高，約為復(fù)壯前的8倍。相較 于傳統(tǒng)復(fù)壯方法而言，此方法更加有效簡單易于操作，實(shí)用性強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1
蛹蟲草(Cbr辦ce/zswi/iiaris)菌株，由教育部工業(yè)微生物工程中心免費(fèi)提供。1)蛹蟲草Ubrdyc^psmilitaris)菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，25°C進(jìn)行活化； PDA斜面培養(yǎng)基為土豆200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L, pH 7.0
2)將活化后的蛹蟲草(Cbr辦c印^iBteris)菌株接種于含有0.lmg/ml氨芐青霉素的 PDA平板上，25 °C復(fù)壯培養(yǎng)3d ；
3)將經(jīng)過第一次復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦c印^iBteri1S)菌株再次接種于含有0.3mg/ ml氨芐青霉素的PDA平板上，25 °C復(fù)壯培養(yǎng)3d ；
4)將復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦⑶/Zs^Viteris)菌株接種于PDA斜面上，用于菌種保存。
4
5)對復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦ce/zs^Viiaris)菌株進(jìn)行菌絲生長速度，產(chǎn)子實(shí)體能 力以及產(chǎn)蟲草素能力的檢測。6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)壯后的菌株，其菌絲生長速度較復(fù)壯前大幅提高，菌絲體粗 壯，致密；復(fù)壯后的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，子實(shí)體形成率大幅提高，個體大小較均勻，畸 形率降低；發(fā)酵液中蟲草素含量約為復(fù)壯前的7. 5-8. 0倍。實(shí)施例2
蛹蟲草(Cbr辦ce/zswi/iiaris)菌株，由教育部工業(yè)微生物工程中心提供。1)蛹蟲草(Cbr辦ce/zs^Viiaris)菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，25°C進(jìn)行活化培 養(yǎng)；
2)將活化后的蛹蟲草(Cbr辦ce/zswi/iiaris)菌株接種于各含有0.2mg/ml卡那霉素和 氨芐青霉素的PDA平板上，25°C復(fù)壯培養(yǎng)3d ；
3)將經(jīng)過一次復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦ce/zswi/iiaris)菌株再次接種于含有l(wèi)mg/ml鏈 霉素的PDA平板上，25 °C復(fù)壯培養(yǎng)3d
4)將復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦⑶/Zs^Viteris)菌株接種于PDA斜面上，用于菌種保存。5)對復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦ce/zs^Viiaris)菌株進(jìn)行菌絲生長速度、產(chǎn)子實(shí)體能 力以及產(chǎn)蟲草素能力的測定。6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)壯后菌株的菌絲生長速度較復(fù)壯前大幅提高，菌絲體粗壯，致 密；將復(fù)壯后的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，子實(shí)體形成率大幅度提高，子實(shí)體大小較均勻， 畸形率降低；發(fā)酵液中蟲草素含量約為復(fù)壯前的7. 3-7. 7倍。實(shí)施例3
蛹蟲草(Cordycepsmili taris )菌株由教育部工業(yè)微生物工程中心提供。1)蛹蟲草Wordyc^psmilitaris)菌株接種于PDA斜面中，25°C進(jìn)行活化；
2)將活化后的蛹蟲草(Cbr辦c印^iBiari1S)菌株接種于各含有0.025mg/ml小諾霉素 和頭孢霉素IV的PDA平板上，25°C復(fù)壯培養(yǎng)3d
3)將經(jīng)過第一次復(fù)壯后的菌株再次接種于含有卡那霉素1.Omg/ml +0. 3mg/ml氨芐青 霉素的PDA平板上，25°C進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)3d ；
4)將復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦⑶/Zs^Viteris)菌株接種于PDA斜面上，用于菌種保存。5)將復(fù)壯后的蛹蟲草(Cbr辦ce/zs^Viiaris)菌株進(jìn)行菌絲生長速度、產(chǎn)子實(shí)體能 力以及產(chǎn)蟲草素能力的測定。6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)壯后菌株的菌絲生長速度較復(fù)壯前大幅提高，菌絲體粗壯、致 密；將復(fù)壯后菌株接種于固體培養(yǎng)基上，其子實(shí)體形成率大幅提高，子實(shí)體大小較均勻，畸 形率降低；發(fā)酵液中蟲草素含量約為復(fù)壯前的8. O 8. 5倍。以上是結(jié)合具體實(shí)施例子對本發(fā)明所做的進(jìn)一步描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了 解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理， 在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都 落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
1.一種蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，主要包括蛹蟲草菌株活化培養(yǎng)、蛹蟲草菌株復(fù)壯和蛹 蟲草菌株保種，其特征是所述的復(fù)壯培養(yǎng)是指將活化后的蛹蟲草菌株接種于含有一種或者 多種抗生素復(fù)配的PDA平板上進(jìn)行第一次復(fù)壯培養(yǎng)，再將經(jīng)過第一次復(fù)壯培養(yǎng)后的菌株， 再次接種于含有一種或者多種抗生素復(fù)配的PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行第二次復(fù)壯培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，其特征在于所述的抗生素為氨基 糖苷類抗生素和青霉素類抗生素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，其特征在于所述的氨基糖苷類抗生 素是指鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、核糖霉素、小諾霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，其特征在于所述的青霉素類抗生素 是指氨芐青霉素、頭孢拉定、先鋒IV、先鋒V號。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，其特征在于所述的復(fù)配抗生素 是指一種或者多種上述抗生素按一定比例的復(fù)合配制，復(fù)配后抗生素在PDA培養(yǎng)基中的終 濃度為0. 02 2mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，其特征在于所述的復(fù)壯培養(yǎng)，是用 PDA培養(yǎng)基，25°C條件下進(jìn)行的，培養(yǎng)時間3 5d。
全文摘要
本發(fā)明涉及退化食用菌菌株的復(fù)壯，具體的講是一種蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法，主要包括蛹蟲草菌株活化培養(yǎng)、蛹蟲草菌株復(fù)壯和蛹蟲草菌株保種，其特征是所述的復(fù)壯培養(yǎng)是指將活化后的蛹蟲草菌株接種于含有一種或者多種抗生素復(fù)配的PDA平板上進(jìn)行第一次復(fù)壯培養(yǎng)，再將經(jīng)過第一次復(fù)壯培養(yǎng)后的菌株，再次接種于含一種或者多種抗生素復(fù)配的PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行第二次復(fù)壯培養(yǎng)。本發(fā)明突破了傳統(tǒng)的菌株復(fù)壯方法，采用抗生素法對菌株進(jìn)行復(fù)壯，此方法操作容易，簡單易行，且效果顯著。經(jīng)過此種方法復(fù)壯后的菌株，其菌絲粗壯，致密，生長速度相較于復(fù)壯前有了較大的提高，約為復(fù)壯前的8倍。
文檔編號A01G1/04GK102090270SQ201110005899
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者柯軼, 毛寧 申請人:福建師范大學(xué)