專利名稱：一種新型生根方法在大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因大豆再生苗生根方法，屬于大豆組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用外源基因進(jìn)行作物遺傳改良已成為植物育種的重要手段之一。目前，外源基因的導(dǎo)入方法多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法，特別是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其方法簡(jiǎn)單、 效率高、拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)已成為單、雙子葉植物轉(zhuǎn)基因育種的首選方法[Horsh R B]。大豆是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化的植物，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究中廣泛應(yīng)用，但是這兩個(gè)系統(tǒng)獲得的抗性芽存在生根困難的問(wèn)題，經(jīng)生根和煉苗兩個(gè)階段后移栽成活率非常低，分別為20%和10%左右，嚴(yán)重制約了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究和發(fā)展。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系中，需要用抗生素抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但是抗生素在抑制農(nóng)桿菌的同時(shí)也不可避免地對(duì)大豆外植體的生長(zhǎng)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，導(dǎo)致叢生芽生長(zhǎng)緩慢及再生苗生根困難。在子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中為了提高再生苗的生根率一般采用逐漸降低抗生素濃度或去除抗生素的方法，但是往往造成轉(zhuǎn)化植株生根率低和農(nóng)桿菌再次生長(zhǎng)污染轉(zhuǎn)化植株的問(wèn)題，難以從根本上解決抗生素等抑菌劑對(duì)轉(zhuǎn)植株生根的影響。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行大豆子葉節(jié)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的摸索，首次采用了一種新型生根培養(yǎng)方式，即使用雙層生根培養(yǎng)基，上層含有抗生素，而下層不含抗生素，這樣既能保證抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，又能大大降低抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因再生植株的不利影響，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的植株移栽成活率分別達(dá)90. 70%和88. 10%。該方法的應(yīng)用對(duì)提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要意義，在其他植物的轉(zhuǎn)化中也有很好的借鑒作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一套應(yīng)用雙層培養(yǎng)培養(yǎng)方式提高轉(zhuǎn)基因大豆生根效率的方法。其特征為在子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，在生根階段采用上層附加抑菌劑， 下層不加抑菌劑的培養(yǎng)基，獲得了 90. 70%和88. 10%的轉(zhuǎn)化苗再生率。本發(fā)明主要技術(shù)方案如下1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)，然后接種到萌發(fā)培養(yǎng)基中4-6天，切取子葉節(jié)外植體，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染子葉節(jié)，共培養(yǎng)3-5天，將外植體接種到分化篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，不定芽長(zhǎng)到2. 0-3. Ocm時(shí)切下接種到雙層生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)，無(wú)菌水浸泡過(guò)夜，切取胚尖，去除真葉，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染胚尖，共培養(yǎng)3-5天，將外植體用含有抑菌劑的無(wú)菌水沖洗后接種到分化篩選培養(yǎng)基上，不定芽長(zhǎng)到2. 0-3. Ocm時(shí)切下接種到雙層生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；3)雙層生根培養(yǎng)基下層的制備首先配制1/2MS+0. 4g/L MES+30g/L蔗糖+植物凝膠2g/L+pH 5. 8培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA，將培養(yǎng)基分裝于IOOmL三角瓶中，每瓶50mL左右，室溫冷卻使其凝固，下層制作完成；4)雙層生根培養(yǎng)基上層的制備首先配制1/2MS+0. 4g/L MES+蔗糖30g/L+植物凝膠2g/L+pH 5. 8培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA+200mg/L頭孢霉素+100mg/L 羧芐青霉素，緩慢倒入3所制備的下層培養(yǎng)基上，使其形成2-3mm薄層，室溫冷卻，上層制作完成；5)不定芽的生根培養(yǎng)切取1和2中長(zhǎng)到2. 0-3. Ocm的不定芽，對(duì)距離底部0.5cm 以下表皮進(jìn)行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養(yǎng)基中，劃傷部位全部進(jìn)入下層培養(yǎng)基；6)煉苗移栽15天左右對(duì)長(zhǎng)出根的小苗進(jìn)行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到裝有蛭石的培養(yǎng)缽里，用hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果如下大豆是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化的植物，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究中廣泛應(yīng)用，但是這兩個(gè)系統(tǒng)獲得的抗性芽存在生根困難的問(wèn)題，以常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為例，前者的生根率一般在20%左右，而后者則只有10%左右。針對(duì)大豆轉(zhuǎn)化植株生根困難、移栽成活率低這個(gè)限制因素， 近年來(lái)有人采用嫁接法獲得了較高的成活率，但該方法要求同時(shí)培養(yǎng)適齡實(shí)生苗以及操作要求技術(shù)性強(qiáng)，這無(wú)疑增加了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的工作量，而且難以普及應(yīng)用。而本項(xiàng)發(fā)明，應(yīng)用雙層培養(yǎng)的方法，將不同來(lái)源的轉(zhuǎn)化不定芽接種到雙層生根培養(yǎng)基中，獲得了較高的植株生根率，成功克服了大豆遺傳轉(zhuǎn)化中抗性芽不易生根的難題。應(yīng)用雙層生根培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)非常明顯首先，提高了轉(zhuǎn)化植株的成活率。應(yīng)用雙層培養(yǎng)基進(jìn)行生根的不定芽，生根率一般在90%左右，且根系發(fā)達(dá)須根多，不老化，移栽成活率接近100%，這與子葉節(jié)系統(tǒng)低于20%胚尖系統(tǒng)低于10%的成活率相比有大幅度的提高；其次，采用本方法獲得的生根植株，移栽后恢復(fù)生長(zhǎng)迅速，不用經(jīng)過(guò)黑暗避光期，所以縮短了轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)周期，且簡(jiǎn)化了管理過(guò)程，降低了轉(zhuǎn)化成本。總之，應(yīng)用雙層培養(yǎng)基進(jìn)行生根的技術(shù)，方法簡(jiǎn)單易行，克服了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中轉(zhuǎn)化植株生根困難的技術(shù)難題，大大提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化植株生根率，為進(jìn)一步提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率提供了的技術(shù)支持。另外，本方法對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的其他植物的遺傳轉(zhuǎn)化也有很高的借鑒作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一利用子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的不定芽采用雙層培養(yǎng)基生根法獲得再生植株1-應(yīng)用材料1)植物材料大豆品種為冀豆16，由河北省農(nóng)科院糧油作物所購(gòu)買；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株為EHA105 (市場(chǎng)購(gòu)買)，載體為pCAMBIA3301 (市場(chǎng)購(gòu)買)，篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因；
2-不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)；2)無(wú)菌大豆種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基中B5+30g/L蔗糖+7. Og/L瓊脂+0. 4g/L MES, pH5.8，23°C，光照培養(yǎng)5天；3)子葉節(jié)外植體的獲得待子葉變綠時(shí)用手術(shù)刀將其子葉分開，去除真葉，保留 0. 5cm左右的下胚軸，然后順著脈絡(luò)方向輕劃5-7刀，約3-4mm長(zhǎng)，0. 5mm深；4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)從農(nóng)桿菌EHA105平板中挑取單菌落接種到50mL YEB培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)24-30h,待菌液0D600值達(dá)0. 8-1. 0時(shí)，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；幻制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養(yǎng)基重懸，1/10B5+3. 9g/ L MES+0.25mg/LGA3+l. 67mg/L 6_BAP+20g/L 蔗糖 +400mg/L Lysteine+154. 2mg/L DTT+200 μ mol/L 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；6)侵染及共培養(yǎng)取切好的子葉節(jié)放入侵染液中，黑暗侵染30分鐘，然后接種到固體共培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)5-7天；7)誘導(dǎo)芽分化共培養(yǎng)結(jié)束后將子葉節(jié)接種到分化培養(yǎng)基中，B5+30g/L蔗糖 +7. Og/L 瓊脂 +0. 4g/L MES+1. 67mg/L 6-BAP+O. 2mg/L IBA, pH 5. 8，23°C，光照培養(yǎng) 14 天， 在此期間切除早期分化的不定芽；8)不定芽的篩選將子葉節(jié)轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，B5+30g/L蔗糖 +7. Og/L 瓊月旨 +0. 4g/L MES+0. 5mg/L GA3+1. Omg/L ZT+0. lmg/L IAA+50mg/L Asn+50mg/ LGln+400mg/L Cef+lOOmg/L Cb+0. 6mg/L Basta, pH 5. 8，每?jī)芍芾^代一次；9)生根當(dāng)不定芽長(zhǎng)至2_3cm即可切下接種到雙層生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；3-不定芽生根及其生根苗移栽1)切下2-3cm的健壯不定芽，對(duì)距離底部0. 5cm以下表皮進(jìn)行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養(yǎng)基中，劃傷部位全部進(jìn)入下層培養(yǎng)基；2)煉苗移栽對(duì)培養(yǎng)15天左右長(zhǎng)出根的小苗進(jìn)行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到裝有蛭石的培養(yǎng)缽里，用hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至土壤中。4-結(jié)果1)共選取43個(gè)不定芽進(jìn)行生根，有39株生長(zhǎng)出發(fā)達(dá)根系，移栽后成活39株，生根率達(dá)到90. 70%，移栽成活率達(dá)到100% ；2)雙層培養(yǎng)基生根技術(shù)明顯提高了不定芽的生根率及移栽成活率，克服了子葉節(jié)系統(tǒng)生根難的問(wèn)題；3)應(yīng)用本技術(shù)可以明顯縮短轉(zhuǎn)化周期，移栽后不用經(jīng)過(guò)避光培養(yǎng)，移栽苗恢復(fù)生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)旺盛；4)提取轉(zhuǎn)化材料TO代以及TI代幼嫩葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步證明外源基因已整合到大豆基因組中。實(shí)施例二 利用胚尖轉(zhuǎn)化的不定芽采用雙層培養(yǎng)基生根法獲得再生植株I-應(yīng)用材料1)植物材料大豆品種為五星2號(hào)，由河北省農(nóng)科院糧油作物所購(gòu)買；
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2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株為GV3101 (市場(chǎng)購(gòu)買)，載體為pCAMBIA1300 (市場(chǎng)購(gòu)買)，篩選標(biāo)記基因?yàn)閔pt基因；2-不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)；2)外植體的獲得取滅菌后的大豆種子用無(wú)菌水浸泡過(guò)夜，去掉子葉，將真葉去除干凈，收集胚尖，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，MS+30g/L蔗糖+0. 4g/L MES+3. 5mg/L 6-BAP+7.0% 瓊脂，23°C光照，預(yù)培養(yǎng)30h;3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)從農(nóng)桿菌GV3101平板中挑取單菌落接種到50mL YEB培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)24-30h,待菌液0D600值達(dá)0. 8-1. 0時(shí)，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；4)制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養(yǎng)基重懸，l/2MS+20g/L蔗糖+0. Sg/ LMES+6mg/L 6-BAP+200 μ mol 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；5)外植體侵染及共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后變綠的胚尖放進(jìn)侵染液中，黑暗培養(yǎng)15小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基中，黑暗條件下培養(yǎng)3-5天；6)恢復(fù)培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的胚尖用含有抗生素的無(wú)菌水清洗后接種到恢復(fù)培養(yǎng)基中，MS+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/L Cb+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES，pH 5. 8，培養(yǎng) 5-7 天；7)芽伸長(zhǎng)轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基:MS+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/LCb+6mg/L hyg+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES, pH 5. 8，每 10-15 天繼代一次；8)當(dāng)不定芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，進(jìn)行生根；3-不定芽生根及其生根苗移栽1)切下2-3cm的健壯不定芽，對(duì)距離底部0. 5cm以下表皮進(jìn)行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養(yǎng)基中，劃傷部位全部進(jìn)入下層培養(yǎng)基；2)煉苗移栽對(duì)培養(yǎng)15天左右長(zhǎng)出根的小苗進(jìn)行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到裝有蛭石的培養(yǎng)缽里，用hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。4-結(jié)果1)共選取42個(gè)不定芽進(jìn)行生根，有37株生長(zhǎng)出發(fā)達(dá)根系，移栽后成活36株，生根率達(dá)到88. 10%，移栽成活率達(dá)到97. 30% ；2)雙層培養(yǎng)基生根技術(shù)明顯提高了不定芽的生根率及移栽成活率，克服了胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生根難的問(wèn)題；3)應(yīng)用本技術(shù)可以明顯縮短轉(zhuǎn)化周期，移栽后不用經(jīng)過(guò)避光培養(yǎng)，移栽苗恢復(fù)生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)旺盛；4)提取轉(zhuǎn)化材料TO代以及TI代幼嫩葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步證明外源基因
已整合到大豆基因組中。
權(quán)利要求
1.一種新型生根方法在大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，其特征是主要步驟如下1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)，然后接種到萌發(fā)培養(yǎng)基中4-6天，切取子葉節(jié)外植體，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染子葉節(jié)，共培養(yǎng)3-5天，將外植體接種到分化篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，不定芽長(zhǎng)到2. 0-3. Ocm時(shí)切下接種到雙層生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆胚尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)，無(wú)菌水浸泡過(guò)夜，切取胚尖，去除真葉，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染胚尖， 共培養(yǎng)3-5天，將外植體用含有抑菌劑的無(wú)菌水沖洗后接種到分化篩選培養(yǎng)基上，不定芽長(zhǎng)到2. 0-3. Ocm時(shí)切下接種到雙層生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；3)雙層生根培養(yǎng)基下層的制備首先配制l/2MS+0.4g/LMES+30g/L蔗糖+植物凝膠 2g/L+pH 5. 8培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA，將培養(yǎng)基分裝于IOOmL三角瓶中， 每瓶50mL左右，室溫冷卻使其凝固，下層制作完成；4)雙層生根培養(yǎng)基上層的制備首先配制1/2MS+0.4g/L MES+蔗糖30g/L+植物凝膠 2g/L+pH 5. 8培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA+200mg/L頭孢霉素+100mg/L羧芐青霉素，緩慢倒入3所制備的下層培養(yǎng)基上，使其形成2-3mm薄層，室溫冷卻，上層制作完成；5)不定芽的生根培養(yǎng)切取1和2中長(zhǎng)到2.0-3. Ocm的不定芽，對(duì)距離底部0. 5cm以下表皮進(jìn)行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養(yǎng)基中，劃傷部位全部進(jìn)入下層培養(yǎng)基；6)煉苗移栽15天左右對(duì)長(zhǎng)出根的小苗進(jìn)行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養(yǎng)基， 移栽到裝有蛭石的培養(yǎng)缽里，用hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。
2.按權(quán)利要求1所述的一種新型生根方法在大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，其特征是利用子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的不定芽采用雙層培養(yǎng)基生根法獲得再生植株，具體步驟如下應(yīng)用材料1)植物材料大豆品種為冀豆16，由河北省農(nóng)科院糧油作物所購(gòu)買；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株為EHA105(市場(chǎng)購(gòu)買)，載體為pCAMBIA3301 (市場(chǎng)購(gòu)買)， 篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因；不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)；2)無(wú)菌大豆種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基中B5+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂+0.4g/LMES, pH5.8，23°C，光照培養(yǎng)5天；3)子葉節(jié)外植體的獲得待子葉變綠時(shí)用手術(shù)刀將其子葉分開，去除真葉，保留0.5cm 左右的下胚軸，然后順著脈絡(luò)方向輕劃5-7刀，約3-4mm長(zhǎng)，0. 5mm深；4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)從農(nóng)桿菌EHA105平板中挑取單菌落接種到50mLYEB培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24-30h,待菌液0D600值達(dá)0. 8-1. 0時(shí)，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；5)制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養(yǎng)基重懸，l/10B5+3.9g/LMES+0. 25mg/ LGA3+1. 67mg/L 6_BAP+20g/L蔗糖+400mg/L Lysteine+154. 2mg/L DTT+200 μ mol/L 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；6)侵染及共培養(yǎng)取切好的子葉節(jié)放入侵染液中，黑暗侵染30分鐘，然后接種到固體共培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)5-7天；.7)誘導(dǎo)芽分化共培養(yǎng)結(jié)束后將子葉節(jié)接種到分化培養(yǎng)基中，B5+30g/L蔗糖+7.Og/L 瓊脂+0. 4g/L MES+1. 67mg/L6-BAP+0. 2mg/L IBA, pH 5. 8，23°C，光照培養(yǎng) 14 天，在此期間切除早期分化的不定芽；.8)不定芽的篩選將子葉節(jié)轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，B5+30g/L蔗糖+7.Og/L瓊脂 +0. 4g/L MES+0. 5mg/L GA3+1. Omg/L ZT+0. lmg/L IAA+50mg/L Asn+50mg/LGln+400mg/L Cef+lOOmg/L Cb+0. 6mg/L Basta, pH 5. 8，每?jī)芍芾^代一次；.9)生根當(dāng)不定芽長(zhǎng)至2-3cm即可切下接種到雙層生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根；不定芽生根及其生根苗移栽.1)切下2-3cm的健壯不定芽，對(duì)距離底部0.5cm以下表皮進(jìn)行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養(yǎng)基中，劃傷部位全部進(jìn)入下層培養(yǎng)基；.2)煉苗移栽對(duì)培養(yǎng)15天左右長(zhǎng)出根的小苗進(jìn)行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到裝有蛭石的培養(yǎng)缽里，用hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至土壤中。
3.按權(quán)利要求1所述的一種新型培養(yǎng)方法在大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，其特征是利用胚尖轉(zhuǎn)化的不定芽采用雙層培養(yǎng)基生根法獲得再生植株，具體步驟如下應(yīng)用材料1)植物材料大豆品種為五星2號(hào)，由河北省農(nóng)科院糧油作物所購(gòu)買；2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株為GV3101(市場(chǎng)購(gòu)買)，載體為pCAMBIA1300 (市場(chǎng)購(gòu)買)， 篩選標(biāo)記基因?yàn)閔pt基因；不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無(wú)裂痕的大豆種子進(jìn)行氯氣熏蒸滅菌16-20小時(shí)；2)外植體的獲得取滅菌后的大豆種子用無(wú)菌水浸泡過(guò)夜，去掉子葉，將真葉去除干凈，收集胚尖，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，MS+30g/L蔗糖+0. 4g/L MES+3. 5mg/L 6-BAP+7. 0%瓊脂， 23 °C光照，預(yù)培養(yǎng)30h;3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)從農(nóng)桿菌GV3101平板中挑取單菌落接種到50mLYEB培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24-30h,待菌液0D600值達(dá)0. 8-1. 0時(shí)，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；4)制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養(yǎng)基重懸，l/2MS+20g/L蔗糖+0.Sg/ LMES+6mg/L 6-BAP+200 μ mol 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；5)外植體侵染及共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)后變綠的胚尖放進(jìn)侵染液中，黑暗培養(yǎng)15小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基中，黑暗條件下培養(yǎng)3-5天；6)恢復(fù)培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的胚尖用含有抗生素的無(wú)菌水清洗后接種到恢復(fù)培養(yǎng)基中， MS+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/L Cb+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES, pH 5. 8，培養(yǎng) 5-7 天；7)芽伸長(zhǎng)轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基MS+0.2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/ LCb+6mg/L hyg+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES, pH 5. 8，每 10-15 天繼代一次；8)當(dāng)不定芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，進(jìn)行生根；不定芽生根及其生根苗移栽1)切下2-3cm的健壯不定芽，對(duì)距離底部0. 5cm以下表皮進(jìn)行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養(yǎng)基中，劃傷部位全部進(jìn)入下層培養(yǎng)基；2)煉苗移栽對(duì)培養(yǎng)15天左右長(zhǎng)出根的小苗進(jìn)行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養(yǎng)基，移栽到裝有蛭石的培養(yǎng)缽里，用hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因大豆再生苗生根方法，屬于大豆組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)領(lǐng)域。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行大豆子葉節(jié)和胚尖遺傳轉(zhuǎn)化的研究，首次采用了一種新型轉(zhuǎn)化植株生根方法，即使用雙層生根培養(yǎng)基，上層含有抗生素，而下層不含抗生素，這樣既能抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，又能大大降低抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因再生植株的不利影響，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的植株移栽成活率分別達(dá)90.70％和88.10％。該方法的應(yīng)用對(duì)提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要意義，在其他植物的遺傳轉(zhuǎn)化中也有很好的借鑒作用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102174562SQ20111002994
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者張潔, 王冬梅, 鄭文永 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)