專利名稱：通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種通過植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)，組織培養(yǎng)生產(chǎn)福建鐵皮石斛誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Herta Dendrodii Officinalis)為蘭科多年生草本植物，是一種瀕危珍惜的藥用全草，是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材。又稱鐵吊蘭、鐵皮蘭、里書草。野生的鐵皮石斛大多分布在東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區(qū)。我國分布在浙江、云南、福建等地的山區(qū)。 主要頒布于上述地區(qū)的高山峻嶺懸崖峭壁和巖石縫隙中。由于鐵皮石斛生長條件的特殊性和分布的局限性，又經(jīng)長期采挖，自然資源瀕臨枯竭，國內(nèi)市場供應(yīng)緊缺。。其功能主治滋陰清熱，生津止渴。用于熱病傷津、口渴舌燥、病后虛熱、胃病、干嘔、舌光少苔。具有清熱、涼血、祛風(fēng)利濕、強(qiáng)心利尿、固腎平肝以及降血壓等功效，主治咯血、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、 糖尿病、血尿、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、由于福建鐵皮石斛的顯著的藥用功效及保健功能已為世人公認(rèn)，其商品價格多年來一直不菲。鐵皮石斛(Herta Dendrodii Officinalis)中含有豐富的多糖成份，干品中含量占五分之一。這種多糖具有增長丁細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(M種)功能的作用。 提高人體的免疫力，以防御外界病源因子的侵襲和清除體內(nèi)衰老死傷、突變細(xì)胞，借以維持機(jī)體的生理穩(wěn)定狀態(tài)。是一種前景可喜的中藥免疫增強(qiáng)劑，并具有抗腫瘤、降血糖、抗衰老、 抗氧化、抗誘變等作用，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。由于鐵皮石斛屬植物傳統(tǒng)的分株扦插等無性繁殖方式的成活率很低、生長速度很慢、繁殖率低、加之其對生長條件要求嚴(yán)格、自然條件惡化、野生資源銳減、人為肆意采挖， 現(xiàn)已瀕臨滅絕，致使藥源緊缺，國內(nèi)外市場供不應(yīng)求。前國內(nèi)外學(xué)者開展了對鐵皮石斛的初步研究，而通過本地選優(yōu)的鐵皮石斛的培養(yǎng)主要集中在組培誘導(dǎo)、基本培養(yǎng)基條件的篩選和理化因子的考查等方面。還沒有找到一個有效地培養(yǎng)技術(shù)用以解決鐵皮石斛誘導(dǎo)和增殖中存在的疑點(diǎn)和難點(diǎn)，從而影響了鐵皮石斛的深入研究應(yīng)用。天然的野生鐵皮石斛已作為瀕臨滅絕的植物物種受到保護(hù)，嚴(yán)禁采摘。為此研究鐵皮石斛的人工培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種保持植物體本身優(yōu)良藥效， 繁殖速度快，增殖倍數(shù)高的通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法，包括如下步驟A、植物體的選擇及無菌處理選擇6-8月份生長的野生鐵皮石斛植物體，除去根和葉進(jìn)行清洗和無菌處理，將莖段剪成0. 5-1. 5CM帶莖節(jié)的鐵皮石斛小段組織。B、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的鐵皮石斛小段組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行組織誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽，培養(yǎng)周期10-60天，培養(yǎng)溫度15-30°C，光照培養(yǎng)時間0- 小時/天，光照強(qiáng)度 1000 20001uX Ix ；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為為MS培養(yǎng)基+蔗糖10-50g/L g/L+瓊脂6_8g/ L+活性炭1. 0-3. Og/L+萘乙酸0. 1-5. Omg/L、+6-芐氨基腺嘌呤0. 01-5. Omg/L+花寶1號 l-3g/L, PH 值為 5. 0-7. 0。C、大規(guī)模培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的叢生芽在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)周期10-60天，培養(yǎng)溫度15-35°C，光照培養(yǎng)時間0- 小時/天，光照強(qiáng)度1000 20001uX ；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為改良MS基本養(yǎng)基+硝酸鈣600mg/L+香蕉泥30_100g/L+蔗糖20_40g/L+瓊脂 6-8g/L+ 活性炭 2. 0-3. Og/L+ 萘乙酸 1. 0-3. Omg/L,+6-芐氨基腺嘌呤 1. 0-4. 0mg/L+ 花寶 1 號 l-3g/L 和花寶 5 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0。作為本發(fā)明通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛的方法更優(yōu)化的技術(shù)方案，對培養(yǎng)基的配方比例和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)周期20-50天，培養(yǎng)溫度20-30°C，光照培養(yǎng)時間0- 小時/天，光照強(qiáng)度1500 20001UX ；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為為MS培養(yǎng)基+蔗糖 10-50g/L g/L+ 瓊脂 6-8g/L+ 活性炭 1. 0-3. 0g/L+ 萘乙酸 0. 1-5. 0mg/L,+6-芐氨基腺嘌呤
0.01-5. 0mg/L+ 花寶 1 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0。所述的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)周期20-50天，培養(yǎng)溫度20-30°C，光照培養(yǎng)時間8_16 小時/天，光照強(qiáng)度1500 20001UX ；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為改良MS基本養(yǎng)基+硝酸鈣 600mg/L+ 香蕉泥 30-100g/L+ 蔗糖 20_40g/L+ 瓊脂 6_8g/L+ 活性炭 2. 0-3. 0g/L+ 萘乙酸
1.0-3. 0mg/L,+6-芐氨基腺嘌呤 1. 0-4. 0mg/L+ 花寶 1 號 l_3g/L 和花寶 5 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0。植物體的無菌處理是本發(fā)明的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，無菌處理的方法包括如下步驟A)將選取的鐵皮石斛植株，用自來水沖洗2-3小時，用毛刷清洗干凈，除去根和葉，再用蒸餾水沖洗，置超凈工作臺內(nèi)。B)將除去了根和葉的莖段植物體用70-80%的酒精浸泡20-40秒進(jìn)行表面滅菌， 再用無菌水清洗干凈C)將經(jīng)過酒精滅菌的莖段植物體用0. 3-0. 8%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-6分鐘， 用無菌水沖洗4-5次，再轉(zhuǎn)入0. 15%升汞溶液中滅菌8分鐘，倒去滅菌液，用事先準(zhǔn)備好的無菌水沖洗4-5次，再用濾紙吸干無菌水；D)無菌條件下將次氯酸鈉消毒的莖段剪成0. 5-1. 5CM帶莖節(jié)的小段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過植物組織培養(yǎng)，保持植物體的優(yōu)良性狀，保持植物優(yōu)良的藥物療效，該方法易操作，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)工廠化育苗。選用配方合理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出的叢生芽比例達(dá)到88%以上，通過兩段培養(yǎng)的方式再生植株產(chǎn)量大幅度提高，和增殖倍數(shù)達(dá)到5倍以上。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)鐵皮石斛，保持母株的優(yōu)良性狀， 藥效顯著，不變異，產(chǎn)量高，成本低，周期短，極具市場競爭力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 一種通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，包括如下步驟A.植物體的選擇及無菌處理A)選擇10月份生長的野生鐵皮石斛植株，用自來水沖洗2-3小時，用毛刷清洗干凈，除去根和葉，再用蒸餾水沖洗，置操凈工作臺內(nèi)；B)將除去了根和葉的莖段植物體用70%的酒精浸泡30秒進(jìn)行表面滅菌，再用無菌水清洗干凈；C)將經(jīng)過酒精滅菌的莖段植物體用0.3%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10分鐘，用無菌水沖洗5次，再轉(zhuǎn)入0. 1 %升汞溶液中滅菌8分鐘，倒去滅菌液，用事先準(zhǔn)備好的無菌水沖洗 4-5次，再用濾紙吸干無菌水；D)無菌條件下將消毒的莖段剪成1-1. 5CM左右?guī)o節(jié)的福建鐵皮石斛小段；b.叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的鐵皮石斛小段組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行組織誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽，培養(yǎng)周期40天，培養(yǎng)溫度J8°C，光照培養(yǎng)時間16小時/天，光照強(qiáng)度 1500-20001ux ；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為為MS培養(yǎng)基+蔗糖10_50g/L g/L+瓊脂6_8g/L+活性炭 1. 0-3. Og/L+ 萘乙酸 0. 1-5. 0mg/L、+6-芐氨基腺嘌呤 0. 01-5. Omg/L+ 花寶 1 號 l_3g/ L，PH 值為 5.5。c.大規(guī)模培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的叢生芽在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)周期60天，培養(yǎng)溫度J8°C，光照培養(yǎng)時間16小時/天，光照強(qiáng)度1500-20001uX所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為改良MS基本養(yǎng)基+硝酸鈣600mg/L+香蕉泥30_100g/L+蔗糖20_40g/L+瓊脂6_8g/L+活性炭 2. 0-3. Og/L+ 萘乙酸 1. 0-3. Omg/L,+6-芐氨基腺嘌呤 1. 0-4. Omg/L+ 花寶 1 號 l_3g/L 和花寶 5 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0。實(shí)施例2 —種通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛的方法，它包括如下步驟a.植物體的選擇及無菌處理A.)選擇7月份生長的野生鐵皮石斛植株，用自來水沖2-3小時，用毛刷清洗干凈， 除去根和葉，再用蒸餾水沖洗，置操凈工作臺內(nèi)；B)將除去了根和葉的莖段植物體用70%的酒精浸泡25秒進(jìn)行表面滅菌，再用無菌水清洗干凈；C)將經(jīng)過酒精滅菌的莖段植物體用0. 6%次氯酸鈉溶液浸泡消毒5分鐘，用無菌水沖洗4次，再轉(zhuǎn)入0. 2%升汞溶液中滅菌4分鐘，倒去滅菌液，用事先準(zhǔn)備好的無菌水沖洗 4-5次，再用濾紙吸干無菌水；D)無菌條件下將消毒的莖段剪成ICM左右?guī)o節(jié)的鐵皮石斛小段；E)采用不同培養(yǎng)基并附加不同種類和濃度的細(xì)胞分裂素對誘導(dǎo)不定芽和萌芽率的影響。
以MS、WhiteJP&為基本培養(yǎng)基，添加的糖和瓊脂、花寶和誘導(dǎo)的培養(yǎng)基一樣分別附加不同種類和濃度的細(xì)胞分裂素(6-BA、NAA)；采用4因素3水平的正交設(shè)計(jì)L9(34)(見表1)，共9個處理，每處理接種10瓶，每瓶接1株苗，每處理重復(fù)3次，調(diào)查并統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)及萌芽率。表1鐵皮石斛初代培養(yǎng)試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于包括如下步驟1.1植物體的選擇及無菌處理選擇6-11月份生長的野生健壯無病蟲害的鐵皮石斛植物，除去根和葉進(jìn)行數(shù)小時的流水清洗和無菌處理，將莖段剪成0. 5-1. 5CM帶莖節(jié)的小段組織；1. 2誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的鐵皮石斛小段組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行組織誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽， 培養(yǎng)周期10-60天，培養(yǎng)溫度15-30°C，光照培養(yǎng)時間0-24小時/天，光照強(qiáng)度0 20001ux ；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖10-50g/Lg/L+瓊脂6_8g/L+活性炭1.0-3. Og/L+ 萘乙酸 0. 1-5. Omg/L、+6-芐氨基腺嘌呤 0. 01-5. Omg/L+ 花寶 1 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0 ；1.3大規(guī)模培養(yǎng)將誘導(dǎo)的叢生芽在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)周期10-70天，培養(yǎng)溫度 10-3°C，光照培養(yǎng)時間0-24小時/天，光照強(qiáng)度0 20001UX ；所述的培養(yǎng)基為改良MS 基本養(yǎng)基+硝酸鈣600mg/L+香蕉泥30-100g/L+蔗糖20_40g/L+瓊脂6_8g/L+活性炭2.0-3. Og/L+ 萘乙酸 1. 0-3. Omg/L,+6-芐氨基腺嘌呤 1. 0-4. 0mg/L+ 花寶 1 號 l_3g/L 和花寶 5 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0。
2.如權(quán)利要求1所述的通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)周期20-50天，培養(yǎng)溫度 15-30°C，光照培養(yǎng)時間8-16小時/天，光照強(qiáng)度1000 30001ux，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS 培養(yǎng)基 + 蔗糖 10-50g/L+ 瓊脂 6-8g/L+ 活性炭 1. 0-3. 0g/L+ 萘乙酸 0. 1-5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 01-5. 0mg/L+花寶1號l_3g/L，PH值為5. 0-7. 0 ；所述的大規(guī)模培養(yǎng)條件 培養(yǎng)周期20-50天，培養(yǎng)溫度15-30°C，光照培養(yǎng)時間8-16小時/天，光照強(qiáng)度1000 30001ux ；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為改良MS基本養(yǎng)基+硝酸鈣600mg/L+香蕉泥30_100g/L+ 蔗糖20-40g/L+瓊脂6-8g/L+活性炭2. 0-3. 0g/L+萘乙酸1. 0-3. 0mg/L,+6-芐氨基腺嘌呤 1. 0-4. 0mg/L+ 花寶 1 號 l-3g/L 和花寶 5 號 l_3g/L，PH 值為 5. 0-7. 0。
3.如權(quán)利要求1或2所述的通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于植物體的無菌處理方法包括如下步驟A、將選取的野生鐵皮石斛材料植株，用自來水沖洗2-3小時，用毛刷清洗干凈，除去根和葉，再用蒸餾水沖洗，置超凈工作臺內(nèi)；B、將除去了根和葉的莖段植物用70-80%的酒精浸泡20-40秒進(jìn)行表面滅菌，再用無菌水清洗干凈；C、將經(jīng)過酒精滅菌的莖段植物體用0.3-0. 8%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-6分鐘，用無菌水沖洗4-5次，再轉(zhuǎn)入0. 15%升汞溶液中滅菌8分鐘，倒去滅菌液，用事先準(zhǔn)備好的無菌水沖洗4-5次，再用濾紙吸干無菌水；D、在無菌條件下將消毒好的莖段剪成0.5-1. 5CM帶莖節(jié)的小段。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過植物組織培養(yǎng)對鐵皮石斛進(jìn)行優(yōu)良植物體的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)的方法。包括植物體的選擇及無菌處理、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)和大規(guī)模增殖培養(yǎng)三大環(huán)節(jié)，其技術(shù)的關(guān)鍵在于誘導(dǎo)培養(yǎng)和大規(guī)模培養(yǎng)兩個階段采用了兩種不同的培養(yǎng)基。本發(fā)明比較容易操作，生產(chǎn)成本低，適合工廠化育苗，產(chǎn)量高，品質(zhì)好，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK102160525SQ20111003569
公開日2011年8月24日 申請日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者陳詠梅, 黃碧華 申請人:福建省金草生物科技有限公司