專利名稱：一種非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體是一種非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
至今并未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明相同或相似的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。該方法的操作步驟如下一種非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞的方法，該方法的操作步驟如下1)原代培養(yǎng)利用微量液體組織塊貼壁法原代培養(yǎng)分離成纖維細(xì)胞，無(wú)菌采集動(dòng)物活組織塊， 用75%酒精快速?zèng)_洗約60S，立即放入含3倍雙抗的DPBS中；提前30min開啟無(wú)菌超凈臺(tái)紫外線創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境，將浸泡于3倍雙抗的DPBS中的組織塊用手術(shù)剪剪成適當(dāng)小塊，用經(jīng)消毒的鑷子將組織塊轉(zhuǎn)入高壓滅菌的青霉素小瓶中，再用手術(shù)剪剪成碎塊，加入2 3ml含 3倍雙抗的DPBS，轉(zhuǎn)入滅菌的塑料離心管，于震蕩器上震蕩，然后llOOr/min離心％iin，如此反復(fù)離心2 3次，最后加入2 3mL DMEM混勻，1100r/min離心％iin，棄去上清液，補(bǔ)充2 3ml新鮮DMEM ；用移液器混勻，吸取適量組織塊于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕震蕩，使組織塊分布均勻，放入37 39°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第二天補(bǔ)加1 2mL新鮮DMEM，這樣培養(yǎng)3 5d就可以看到成纖維細(xì)胞游出，根據(jù)培養(yǎng)液體顏色變化，顏色漸黃， 2 3d換液一次，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸匯合，待原代細(xì)胞生長(zhǎng)80%以上匯合時(shí)開始傳代；2)傳代培養(yǎng)待原代細(xì)胞生長(zhǎng)80 100%匯合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，加入無(wú)Ca2+、Mg2+DPBS2 3mL 室溫下漂洗1 2次，棄去漂洗液，加入0. 5 ImL胰蛋白酶-EDTA消化液，微浸細(xì)胞即可， 置于37 39°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱:3min后，顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞趨向變圓， 輕輕震蕩培養(yǎng)皿，立即加入2 3mL預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)液，并用移液器輕輕吹吸數(shù)次，收集細(xì)胞懸液于滅菌的離心管內(nèi)，1000r/min離心％iin，棄去上清液，加入2 3mL新鮮DMEM，進(jìn)行傳代，2d后更換新鮮培養(yǎng)液，以后2 3d換液一次。待純化細(xì)胞生長(zhǎng)80%以上匯合時(shí)開始傳代；3)非冷凍長(zhǎng)期細(xì)胞保存-接觸抑制待純化細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合時(shí)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)原狀態(tài)，不進(jìn)行常規(guī)傳代即進(jìn)行長(zhǎng)期接觸抑制處理，記為接觸抑制O天；接觸抑制的前1 2周按2 3d換一次培養(yǎng)液，以后根據(jù)液體顏色和細(xì)胞代謝狀態(tài)隨時(shí)更換培養(yǎng)液，根據(jù)需求適時(shí)解除抑制按上述幻傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞傳代，解除抑制1 2代后細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)規(guī)律即可恢復(fù)正常。
本發(fā)明的有益效果是使用本發(fā)明方法相對(duì)常規(guī)液氮罐保存細(xì)胞成本更低、污染更少、操作簡(jiǎn)便可靠。特別對(duì)于一些特殊的項(xiàng)目，比如稀少、珍貴轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行一批體細(xì)胞克隆后，需要進(jìn)一步驗(yàn)證胚胎體內(nèi)發(fā)育情況才可以決定是否大批量進(jìn)行胚胎生產(chǎn)即胚胎移植。妊娠期間的這些特殊細(xì)胞如果用于冷凍保存，存活率難以保證，同時(shí)增加了污染機(jī)會(huì)；如果繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)傳代會(huì)增加細(xì)胞變異和污染的概率，進(jìn)而影響胚胎體內(nèi)外正常發(fā)育。因此，使用非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞更是一種可供選擇的方法。


圖1是接觸抑制前腎臟成纖維細(xì)胞圖片。圖2接觸抑制90天腎臟成纖維細(xì)胞。圖3解除抑制后腎臟成纖維細(xì)胞。圖4接觸抑制前附睪成纖維細(xì)胞。圖5接觸抑制90天附睪成纖維細(xì)胞。圖6解除抑制后附睪成纖維細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面以新生廣西巴馬香豬附睪成纖維細(xì)胞和腎臟成纖維細(xì)胞為例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。需要說(shuō)明的是，本實(shí)施例僅是本發(fā)明的具體施例。顯然，本發(fā)明不限于實(shí)施例。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。1.成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)獲取1 2周齡內(nèi)廣西巴馬香豬，無(wú)菌采集附睪和腎臟組織，按照上述介紹程序原代培養(yǎng)分離廣西巴馬香豬附睪成纖維細(xì)胞和腎臟成纖維細(xì)胞。2.非冷凍長(zhǎng)期細(xì)胞保存(接觸抑制)為進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞非冷凍體外長(zhǎng)期保存的能力，待細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合時(shí)記為Od對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期接觸抑制，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)規(guī)律研究其體外增殖潛力。3.結(jié)果為了研究腎臟成纖維細(xì)胞體外長(zhǎng)期保存的潛力，待其生長(zhǎng)至100%匯合時(shí)記為抑制O天，細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，對(duì)其進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)90d以上的長(zhǎng)期接觸抑制，抑制的前段時(shí)間細(xì)胞還仍在繼續(xù)生長(zhǎng)，呈典型的成纖維狀或梭形或線狀，整體排列成流水狀、旋渦狀或放射狀，并出現(xiàn)明顯的重疊式或復(fù)層式生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，原來(lái)的集團(tuán)繼續(xù)生長(zhǎng)，與臨近的成纖維細(xì)胞團(tuán)交叉匯合并呈放射形的網(wǎng)格狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)如圖2所示。開始由于細(xì)胞的重疊生長(zhǎng)培養(yǎng)液顏色變化比較快，每2d換液，隨著抑制時(shí)間的加長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸緩慢或抑制，每3 4 天換液。否則由于液體的過(guò)分蒸發(fā)，造成培養(yǎng)液滲透壓、營(yíng)養(yǎng)等發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常情況。解除抑制培養(yǎng)后細(xì)胞可以正常貼壁生長(zhǎng)，并且在培養(yǎng)的當(dāng)代內(nèi)就可以恢復(fù)形態(tài)， 與抑制前相同，按1 2 3傳代，約3 4d即可匯合細(xì)胞形態(tài)如圖3所示。為了研究附睪成纖維細(xì)胞體外長(zhǎng)期保存的能力，待其生長(zhǎng)至100%匯合時(shí)記為抑制O天，細(xì)胞形態(tài)如圖4所示，對(duì)其進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)90d以上的長(zhǎng)期接觸抑制，每2 4d換液，防液體過(guò)分蒸發(fā)，以至影響細(xì)胞正常情況。形態(tài)呈鋪路石狀或大理石花紋狀，細(xì)胞形態(tài)如圖5 所示，解除抑制后可以正常貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)和生長(zhǎng)規(guī)律與抑制前相同，按1 3傳代，約3 4d即可長(zhǎng)滿，細(xì)胞形態(tài)如圖6所示。
權(quán)利要求
1. 一種非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法的操作步驟如下1)原代培養(yǎng)利用微量液體組織塊貼壁法原代培養(yǎng)分離成纖維細(xì)胞，無(wú)菌采集動(dòng)物活組織塊，用 75%酒精快速?zèng)_洗約60S，立即放入含3倍雙抗的DPBS中；提前30min開啟無(wú)菌超凈臺(tái)紫外線創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境，將浸泡于3倍雙抗的DPBS中的組織塊用手術(shù)剪剪成適當(dāng)小塊，用經(jīng)消毒的鑷子將組織塊轉(zhuǎn)入高壓滅菌的青霉素小瓶中，再用手術(shù)剪剪成碎塊，加入2 3ml含3 倍雙抗的DPBS，轉(zhuǎn)入滅菌的塑料離心管，于震蕩器上震蕩，然后llOOr/min離心％iin，如此反復(fù)離心2 3次，最后加入2 3mL DMEM混勻，1100r/min離心％iin，棄去上清液，補(bǔ)充 2 3ml新鮮DMEM ；用移液器混勻，吸取適量組織塊于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕震蕩，使組織塊分布均勻，放入37 39°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第二天補(bǔ)加1 2mL新鮮DMEM， 這樣培養(yǎng)3 5d就可以看到成纖維細(xì)胞游出，根據(jù)培養(yǎng)液體顏色變化，顏色漸黃，2 3d換液一次，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸匯合，待原代細(xì)胞生長(zhǎng)80%以上匯合時(shí)開始傳代；2)傳代培養(yǎng)待原代細(xì)胞生長(zhǎng)80 100%匯合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，加入無(wú)Ca2+、Mg2+DPBS2 3mL室溫下漂洗1 2次，棄去漂洗液，加入0. 5 ImL胰蛋白酶-EDTA消化液，微浸細(xì)胞即可，置于 37 39 °C、飽和濕度、5 % (X)2培養(yǎng)箱;3min后，顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞趨向變圓，輕輕震蕩培養(yǎng)皿，立即加入2 3mL預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)液，并用移液器輕輕吹吸數(shù)次，收集細(xì)胞懸液于滅菌的離心管內(nèi)，1000r/min離心％iin，棄去上清液，加入2 3mL新鮮DMEM，進(jìn)行傳代，2d后更換新鮮培養(yǎng)液，以后2 3d換液一次，待純化細(xì)胞生長(zhǎng)80%以上匯合時(shí)開始傳代；3)非冷凍長(zhǎng)期細(xì)胞保存-接觸抑制待純化細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合時(shí)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)原狀態(tài)，不進(jìn)行常規(guī)傳代即進(jìn)行長(zhǎng)期接觸抑制處理，記為接觸抑制O天；接觸抑制的前1 2周按2 3d換一次培養(yǎng)液，以后根據(jù)液體顏色和細(xì)胞代謝狀態(tài)隨時(shí)更換培養(yǎng)液，根據(jù)需求適時(shí)解除抑制按上述幻傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞傳代，解除抑制1 2代后細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)規(guī)律即可恢復(fù)正常。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞的方法。該方法的操作步驟包括1)原代培養(yǎng)；2)傳代培養(yǎng)；3)非冷凍長(zhǎng)期細(xì)胞保存-接觸抑制。本發(fā)明的有益效果是使用本發(fā)明方法相對(duì)常規(guī)液氮罐保存細(xì)胞成本更低、污染更少、操作簡(jiǎn)便可靠。特別對(duì)于一些特殊的項(xiàng)目，比如稀少、珍貴轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行一批體細(xì)胞克隆后，需要進(jìn)一步驗(yàn)證胚胎體內(nèi)發(fā)育情況才可以決定是否大批量進(jìn)行胚胎生產(chǎn)即胚胎移植。妊娠期間的這些特殊細(xì)胞如果用于冷凍保存，存活率難以保證，同時(shí)增加了污染機(jī)會(huì)；如果繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)傳代會(huì)增加細(xì)胞變異和污染的概率，進(jìn)而影響胚胎體內(nèi)外正常發(fā)育。因此，使用非冷凍長(zhǎng)期保存細(xì)胞更是一種可供選擇的方法。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102197801SQ20111006483
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者盧克煥, 盧晟盛, 王獻(xiàn)偉 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)