專利名稱：金果欖組培繁殖方法及其誘導培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)繁殖領(lǐng)域，具體涉及到一種金果欖組培繁殖方法及其誘
導培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
金果欖(Tinospora capillipes feign印.)為防己科青牛膽屬常綠纏繞藤本植物，主產(chǎn)于四川、湖南、廣西、湖北、貴州等省區(qū)。它是中藥金果欖基源植物之一，具有清熱解毒、利咽止痛之功效，主治咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等。金果欖藥用塊根，是《中國藥典》歷年收載的藥材品種，其塊根含掌葉防己堿(Palnmtine)和咖倫賓 (Colmtfifin)、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、千金藤堿、蝙蝠葛堿和木蘭花堿。民間廣泛用于治療胃痛，現(xiàn)代藥理研究表明，金果欖有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗應激、 抗?jié)兗敖舛咀饔玫龋直挥鳛榭商娲股氐奶烊凰幬?。一直以來，金果欖都依靠挖取野生品作藥用，由于只挖不種，加上生長較慢，野生資源日趨枯竭，人工種植和撫育勢在必行。另外，金果欖雌雄異株，授粉受到環(huán)境影響極大， 自然結(jié)實率低，資源調(diào)查和引種中發(fā)現(xiàn)，雄株遠多于雌株(約50 1)，結(jié)果機會大大減少； 且種子有明顯的休眠期，發(fā)芽率較低。因此，種源缺乏是金果欖資源銳減的主要原因。目前， 金果欖扦插繁殖未獲得成功。組織培養(yǎng)快速繁殖是現(xiàn)代生物技術(shù)，在香蕉、羅漢果、甜茶、石斛等作物上已取得成功，并應用于生產(chǎn)，而金果欖組培繁殖研究并未見成功報導。利用MS 培養(yǎng)基(Murashige and Skoog Stock)為基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度和不同種類的激素，在多種植物組織培養(yǎng)中已獲得成功。其中，所用激素或激素組合及其濃度是組培成功與否的技術(shù)關(guān)鍵，不同植物使用的激素和濃度大不相同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種金果欖組培繁殖方法，以有效利用現(xiàn)有資源快速繁殖金果欖，并能充分保障其醫(yī)藥用途開發(fā)所需原料來源。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供用于上述金果欖組培繁殖方法的叢生芽誘導培養(yǎng)基和生根誘導培養(yǎng)基。為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案金果欖組培繁殖方法，將金果欖外植體接種到叢生芽誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待叢生芽長至3cm時，將叢生芽分割成小叢或單苗接種到生根誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；上述叢生芽誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì)6-節(jié)氨基嘌呤 0. 46 0. 55mg/L 奈乙酸 0. 18 0. 24mg/L赤霉素0. 8 1. 3mg/L激動素 0. 15 0. 23mg/L,其pH 值為 4. 5 5.0 ；上述生根誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì)吲哚丁酸0. 6 1. 2mg/L奈乙酸 0. 6 1. 2mg/L。
外植體為嫩莖。嫩莖先經(jīng)洗凈并用0. 1 % HgCl2溶液消毒處理8 IOmin。培養(yǎng)均在溫度26士3°C、光照時間12 14h. cf1、光照強度20 30 μ mol. m_2· s-1的條件下進行。單苗長到5 7cm時，于室內(nèi)煉苗1周，取出洗凈種植于已消毒拌有50%育苗基質(zhì)的紅壤土中。金果欖叢生芽誘導培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì)6-節(jié)氨基嘌呤 0. 46 0. 55mg/L 奈乙酸 0. 18 0. 24mg/L赤霉素0. 8 1. 3mg/L激動素 0. 15 0. 23mg/L0該培養(yǎng)基的pH值為4. 5 5. 0。金果欖生根誘導培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì)吲哚丁酸0. 6 1. 2mg/L奈乙酸 0. 6 1. 2mg/L。本發(fā)明采用MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA) +奈乙酸(NAA) +赤霉素(GA3) +激動素(KT) 作為金果欖叢生芽誘導培養(yǎng)基，這四種生長激素組合，在合適的濃度和弱酸性的環(huán)境下，可激活金果欖體細胞內(nèi)的作用酶，促進金果欖外植體的萌發(fā)和生長，培養(yǎng)20天就能形成粗壯的叢生芽，擴繁達25倍；本發(fā)明還采用MS+吲哚丁酸(IBA) +奈乙酸(NAA)作為生根誘導培養(yǎng)基，能有效地促進金果欖單苗生根形成新植株。應用上述兩種誘導培養(yǎng)基的金果欖組培繁殖方法，可快速有效地繁殖金果欖，解決了其野生資源日益減少和自然繁殖率低的問題， 為深入開發(fā)其醫(yī)藥價值提供了有力的種源保障。
具體實施例方式實施例1(1)叢生芽誘導取金果欖幼嫩莖，先用洗潔精洗去表面污垢，接著流水沖洗15min，然后在超凈工作臺上用75%乙醇處理30s，無菌水沖洗1遍，再用0. 1 % HgCl2消毒lOmin，無菌水沖洗5 次；用無菌濾紙吸干外植體，植于用MS添加6-BA 0. 46mg/L、NAA 0. 24mg/L,GA30. 8mg/L、KT 0. 15mg/L，pH值調(diào)節(jié)至4. 5的培養(yǎng)基上，在溫度為^±3°C，光照時間為12 14h. cf1，光照強度20 30 μ mol. m_2. s—1的條件下，培養(yǎng)22天，平均得到25. 2倍的叢生芽，叢生芽較粗壯，綠色，生長稍緩慢。(2)生根誘導待叢生芽生長至3 4cm時，將叢生芽分割成小叢或單苗接種到生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基配方為在MS上，添加IBA 0. 6mg/L+NAA 1. 2mg/L制成；在溫度為^±3°C，光照時間為12 14h. cf1，光照強度20 30 μ mol. m_2. s—1的條件下，培養(yǎng)30天開始生長出白色的不定根，50天長出1 2條，粗壯，長度約Icm的不定根。(3)煉苗與移栽待上述已生根的單苗生長有5 7cm的組培苗，打開培養(yǎng)瓶蓋，于室內(nèi)煉苗1周， 取出洗凈種植于疏松的紅壤土中；在透光度30%左右的育苗棚中，保持濕潤，培養(yǎng)2個月， 葉片淡綠色，成活率達82%。實施例2
4
(1)叢生芽誘導取金果欖幼嫩莖，先用洗潔精洗去表面污垢，接著流水沖洗15min，然后在超凈工作臺上用75 %乙醇處理30s，無菌水沖洗1遍，再用0. 1 % HgCl2消毒8min，無菌水沖洗5 次；用無菌濾紙吸干外植體，植于用MS添加6-BA 0. 50mg/L、NAA 0. 20mg/L、GA3 1. Omg/L、 KT 0. 20mg/L，pH值調(diào)節(jié)至4. 7的培養(yǎng)基上，在溫度為洸士3°C，光照時間為12 14h. d—1，光照強度20 30 μ mol. m_2. s—1的條件下，培養(yǎng)20天，平均得到27倍的叢生芽，叢生芽粗壯， 葉濃綠色、肥厚，長勢好。(2)生根誘導待叢生芽生長至3 4cm時，將叢生芽分割成小叢或單苗接種到生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基配方為在MS上，添加IBA 1. Omg/L+NAA 1. Omg/L制成；在溫度為^±3°C，光照時間為12 14h. cf1，光照強度20 30 μ mol. m_2. s—1的條件下，培養(yǎng)25天開始生出白色的不定根，45天長出2 3條，粗壯，長度約2cm的不定根。(3)煉苗與移栽待上述已生根的單苗生長有5 7cm的組培苗，打開培養(yǎng)瓶蓋，于室內(nèi)煉苗1周， 取出洗凈種植于已消毒拌有50%育苗基質(zhì)的紅壤土中；在透光度30%左右的育苗棚中，保持濕潤，培養(yǎng)2個月，葉片濃綠色，生長健壯，成活率達88%，此基質(zhì)適合金果欖幼苗生長。實施例3(1)叢生芽誘導取金果欖幼嫩莖，先用洗潔精洗去表面污垢，接著流水沖洗15min，然后在超凈工作臺上用75 %乙醇處理30s，無菌水沖洗1遍，再用0. 1 % HgCl2消毒9min，無菌水沖洗5 次；用無菌濾紙吸干外植體，植于用MS添加6-BA 0. 55mg/L、NAA 0. 18mg/L、GA3 1. 3mg/L、 KT 0. 23mg/L, pH值調(diào)節(jié)至5. 0的培養(yǎng)基上，在溫度為^±3°C，光照時間為12 14h. cf1， 光照強度20 30 μ mol. m_2. s—1的條件下，培養(yǎng)18天，平均得到25. 8倍的叢生芽，叢生芽較粗壯，葉濃綠色，生長較快。(2)生根誘導待叢生芽生長至3 4cm時，將叢生芽分割成小叢或單苗接種到生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基配方為在MS上，添加IBA 1. 2mg/L+NAA 0. 6mg/L制成；在溫度為^±3°C，光照時間為12 14h. cf1，光照強度20 30mol. m_2. s—1的條件下，培養(yǎng)30天開始生長出白色的不定根，48天長出2條，粗壯，長度約2cm的不定根。(3)煉苗與移栽用上述已生根的單苗生長高于培養(yǎng)瓶，高度約8 IOcm的組培苗，打開培養(yǎng)瓶蓋， 于室內(nèi)煉苗1周，取出洗凈種植于已消毒拌有50%育苗基質(zhì)的紅壤土中；在透光度30%左右的育苗棚中，保持濕潤培養(yǎng)；打開瓶蓋后3 4天有頂芽壞死現(xiàn)象，但苗還成活，種植2個月，側(cè)芽萌發(fā)，葉片綠色，成活率達83%。
權(quán)利要求
1.一種金果欖組培繁殖方法，其特征在于將金果欖外植體接種到叢生芽誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待叢生芽長至3cm時，將叢生芽分割成小叢或單苗接種到生根誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；所述叢生芽誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì) 6-節(jié)氨基嘌呤0. 46 0. 55mg/L 奈乙酸0. 18 0. 24mg/L 赤霉素0. 8 1. 3mg/L激動素0. 15 0. 23mg/L,其PH值為4. 5 5.0 ；所述生根誘導培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì) 吲哚丁酸0. 6 1. 2mg/L 奈乙酸0. 6 1. 2mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金果欖組培繁殖方法，其特征在于所述外植體為嫩莖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金果欖組培繁殖方法，其特征在于所述嫩莖先經(jīng)洗凈并用 0. 1% HgCl2溶液消毒處理8 lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金果欖組培繁殖方法，其特征在于所述培養(yǎng)均在溫度 26士3°C、光照時間12 14h. cf1、光照強度20 30 μ mol. m_2· s-1的條件下進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金果欖組培繁殖方法，其特征在于待所述單苗長到5 7cm 時，于室內(nèi)煉苗1周，取出洗凈種植于已消毒拌有50%育苗基質(zhì)的紅壤土中。
6.一種金果欖叢生芽誘導培養(yǎng)基，其特征在于以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì)6-節(jié)氨基嘌呤0. 46 0. 55mg/L 奈乙酸0. 18 0. 24mg/L 赤霉素0. 8 1. 3mg/L激動素0. 15 0. 23mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的金果欖叢生芽誘導培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基的PH值為 4. 5 5. O0
8.—種金果欖生根誘導培養(yǎng)基，其特征在于以MS培養(yǎng)基為基礎，含有下列濃度的物質(zhì)吲哚丁酸0. 6 1. 2mg/L 奈乙酸0. 6 1. 2mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金果欖組培繁殖方法及其誘導培養(yǎng)基。本發(fā)明采用MS+6-芐氨基嘌呤(6-BA)+奈乙酸(NAA)+赤霉素(GA3)+激動素(KT)作為金果欖叢生芽誘導培養(yǎng)基，這四種生長激素組合，在合適的濃度和弱酸性的環(huán)境下，可激活金果欖體細胞內(nèi)的作用酶，促進金果欖外植體的萌發(fā)和生長，培養(yǎng)20天就能形成粗壯的叢生芽，擴繁達25倍；本發(fā)明還采用MS+吲哚丁酸(IBA)+奈乙酸(NAA)作為生根誘導培養(yǎng)基，能有效地促進金果欖單苗生根形成新植株。應用上述兩種誘導培養(yǎng)基的金果欖組培繁殖方法，可快速有效地繁殖金果欖，解決了其野生資源日益減少和自然繁殖率低的問題，為深入開發(fā)其醫(yī)藥價值提供了有力的種源保障。
文檔編號A01H4/00GK102150620SQ20111006596
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者馮世鑫, 潘麗梅, 王曉峰, 閆志剛, 馬小軍, 黃曦 申請人:廣西壯族自治區(qū)藥用植物園