專利名稱：一種大葉藻屬愈傷組織的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海草愈傷組織的誘導(dǎo)方法，具體涉及一種大葉藻愈傷組織的誘導(dǎo)方 法。
背景技術(shù)：
海草是一種生活在溫帶和熱帶海域淺水中的單子葉植物，是一種只適應(yīng)于海洋環(huán) 境生活的水生種子植物。主要由海草構(gòu)成的海草場(chǎng)是遍布世界淺海水域最顯著和廣泛的群 落之一，是一類具有極高生產(chǎn)力的淺海生態(tài)系統(tǒng)。大葉藻(Zostera marina L.)是一種多年生草本單子葉海草植物，隸屬于沼生目、 大葉藻科、大葉藻屬。由于其特殊的生活環(huán)境和自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，既具有水生植物的生長(zhǎng)特 性，也具有陸生植物的生長(zhǎng)特性。不但可以為附生藻類和附著動(dòng)物提供固著基，也可為動(dòng)物 提供食物來(lái)源，還具有穩(wěn)定沉積物改善海水透明度的作用，生態(tài)效益顯著。但近年來(lái)，由于 自然條件的改變和人為因素的干擾，導(dǎo)致大葉藻資源大量減少，其種群分布范圍日益縮小。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不受季節(jié)和地域限制、繁殖速度快、植物材料單一、遺傳背景一 致、具有良好的遺傳重復(fù)性；通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)繁殖大量藻體，對(duì)灰復(fù)、保護(hù) 和合理開(kāi)發(fā)利用大葉藻具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，為海水養(yǎng)殖提供健康環(huán)境，為海洋生態(tài)系統(tǒng) 的恢復(fù)提供基礎(chǔ)，達(dá)到海水養(yǎng)殖和生態(tài)恢復(fù)的雙贏。目前高等植物的愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。高等植物一般以成熟或發(fā)育 完全的植株器官作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，不可避免消毒劑對(duì)幼嫩組織的直接傷 害，消毒劑種類選擇和消毒時(shí)間掌控對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要；而大葉藻生活在海水環(huán)境中， 海洋中的微生物種類和數(shù)量較多，而海藻的細(xì)胞壁又很薄，消毒劑對(duì)細(xì)胞的直接傷害比陸 生高等植物嚴(yán)重很多，消毒后很難保證既可以獲得很高無(wú)菌性又可以獲得很高成活率的外 植體；以通過(guò)無(wú)菌人工培育的無(wú)菌實(shí)生苗為外植體既可以保證外植體的無(wú)菌性，也可以保 證外植體的成活率。此外，高等植物大多以MS培養(yǎng)基或N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基；MS培養(yǎng) 基和N6培養(yǎng)基含有大量的無(wú)機(jī)鹽，營(yíng)養(yǎng)極為豐富，不需要添加更多的有機(jī)附加物，就能滿足 植物組織對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的需要，具有加速愈傷組織和培養(yǎng)物生長(zhǎng)的作用；然而大葉藻雖然具 有陸生植物的生長(zhǎng)特性，但其畢竟生活在海洋環(huán)境中，沒(méi)有陸生植物高級(jí)，呈酸性的MS和N6 培養(yǎng)基是否適宜其生長(zhǎng)還不明確，將酸性MS和N6培養(yǎng)基pH調(diào)到海水pH后發(fā)生一些化學(xué) 變化，對(duì)大葉藻愈傷組織誘導(dǎo)的作用也不明確。大葉藻既是一種海洋藻類，又具有高等陸生植物的生長(zhǎng)特性，因此，高等植物的愈 傷組織誘導(dǎo)技術(shù)用來(lái)培育大葉藻愈傷組織并不能獲得很好的效果，所以，急需從培養(yǎng)基篩 選等方面入手來(lái)建立有效的大葉藻愈傷組織的誘導(dǎo)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大葉藻愈傷組織的誘導(dǎo)方法，即選用合適的培養(yǎng)基和誘 導(dǎo)條件來(lái)建立大葉藻科愈傷組織的誘導(dǎo)方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
考慮到大葉藻是水生植物，生長(zhǎng)在自然環(huán)境中的藻體攜帶的雜藻和細(xì)菌的種類和 數(shù)量較多，消毒劑濃度低時(shí)達(dá)不到消毒作用，而過(guò)高則會(huì)使藻體死亡，所以外植體和消毒劑 的選擇至關(guān)重要。為了達(dá)到外植體較高的無(wú)菌性和成活率，以其自然成熟植株的種子培育 出的無(wú)菌苗為外植體，既可以保證擁有相對(duì)無(wú)菌的外植體，又可以避免消毒劑對(duì)外植體的
直接傷害。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的一種大葉藻愈傷組織的誘導(dǎo)方法，是用大葉藻的無(wú)菌苗作為誘導(dǎo)愈傷組 織的外植體。本發(fā)明的誘導(dǎo)方法，是在無(wú)菌條件下將大葉藻無(wú)菌苗的胚根、胚軸、子葉的切段選 取任一種或幾種接種于培養(yǎng)基中，在無(wú)菌條件下，15 30°C下黑暗條件下培養(yǎng)完成愈傷組 織的誘導(dǎo)，其中培養(yǎng)基是鹽度為20 35%。，且添加了碳源、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的MS固體 培養(yǎng)基、N6固體培養(yǎng)基、PESI固體培養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基中的任一種。培養(yǎng)基中添加的碳源可以是蔗糖、葡萄糖等培養(yǎng)基常用的碳源，添加濃度為30g/ L ；培養(yǎng)基中添加的生長(zhǎng)素可以選用2，4_D，濃度為ang/L ；培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞分裂素為6-BA，濃度為lmg/L。培養(yǎng)基的鹽度優(yōu)選為30%0。誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)的溫度優(yōu)選為18°C。本發(fā)明的誘導(dǎo)方法，是在黑暗條件下培養(yǎng)15 30天完成誘導(dǎo)。其中胚根的誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為PESI培養(yǎng)基或VSE培養(yǎng)基；胚軸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選 為PESI培養(yǎng)基或VSE培養(yǎng)基；子葉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為VSE培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)出大葉藻愈傷組織，為人工條件下實(shí)現(xiàn)大葉藻 規(guī)?；M織培養(yǎng)快繁體系做基礎(chǔ)技術(shù)參考，為海草場(chǎng)的恢復(fù)奠定基礎(chǔ)。適用于沼生目大葉 藻科大葉藻屬的多年生草本植物種類。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。一、大葉藻無(wú)菌苗的培育首先在大葉藻的成熟季節(jié)6-7月份，從海水中用篩絹收集大葉藻種子，4°C保存送 至無(wú)菌室，且在4°C低溫條件下保存一個(gè)月以低溫刺激打破種子休眠狀態(tài)；在超凈工作臺(tái) 內(nèi)，用滅菌海水將低溫保存的大葉藻種子清洗干凈，挑取結(jié)實(shí)飽滿的種子，用75%乙醇消毒 30s，再用10%次氯酸鈉消毒lOmin，用滅菌海水沖洗干凈后接種于裝有鹽度為10%。的液 體培養(yǎng)基的錐形瓶中；將錐形瓶放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度14°C，光照強(qiáng)度 500Lx，光周期:12:12 L:D。鹽度為10%。的液體培養(yǎng)基，由過(guò)濾海水和自來(lái)水配制而成，pH調(diào)為8. O ；液體培養(yǎng) 基和海水高溫(120°C )高壓(103kPa)滅菌20min，冷卻至20°C左右后用于接種和清洗；每
1天換一次培養(yǎng)基。白色胚根突破種皮Icm左右后將其轉(zhuǎn)移到溫度18°C ；光照強(qiáng)度2000Lx ；光周期 12:12 L:D的光照培養(yǎng)箱中，逐漸將其鹽度調(diào)為30%。。培養(yǎng)至發(fā)育成具胚根、胚軸和子葉的苗種，將其稱為無(wú)菌苗，作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。二、愈傷組織的誘導(dǎo)實(shí)施例1以MS固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)大葉藻愈傷組織在無(wú)菌室的超凈臺(tái)內(nèi)，分離出無(wú)菌苗的胚根、胚軸和子葉，分別將胚根、胚軸和子 葉切成2-4mm左右的切段。將胚根、胚軸和子葉的切段接種于裝有MS固體培養(yǎng)基的錐形瓶 內(nèi)，將錐形瓶置于光照控溫培養(yǎng)箱中，在18°C下，黑暗條件下培養(yǎng)。其中MS固體培養(yǎng)基是在 MS基本培養(yǎng)基中添加凝固用的7g/L瓊脂，所添加的碳源為30g/L蔗糖，并添加生長(zhǎng)素aiig/ L的2，4-D和細(xì)胞分裂素lmg/L的6-BA，將pH調(diào)為8. 0后高溫(120°C )高壓(103kPa)滅 菌20min，冷卻至固體狀態(tài)后就制成了 MS固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)15-30天，只有胚根可以在MS固體培養(yǎng)基上形成正常愈傷組織，愈傷組織顏 色為白色，形狀為半球形，結(jié)構(gòu)緊密粘稠，愈傷組織誘導(dǎo)率為23% ；但胚軸和子葉只能形成 褐化的愈傷組織，顏色為黃褐色，質(zhì)地粘稠或堅(jiān)硬。實(shí)施例2以N6固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)大葉藻愈傷組織本實(shí)例2的大葉藻愈傷組織誘導(dǎo)方法與實(shí)例1相同，只是培養(yǎng)基為N6固體培養(yǎng)基。 其中N6固體培養(yǎng)基是在N6基本培養(yǎng)基中添加凝固用的7g/L瓊脂，所添加的碳源為30g/ L蔗糖，并添加生長(zhǎng)素ang/L的2，4-D和細(xì)胞分裂素lmg/L的6-BA，將pH調(diào)為8. 0后高溫 (120°C )高壓(103kPa)滅菌20min，冷卻至固體狀態(tài)后就制成N6固體培養(yǎng)基。按照實(shí)施例的誘導(dǎo)方法培養(yǎng)15-30天，只有胚根和子葉可以在N6固體培養(yǎng)基上形 成正常白色愈傷組織，胚根形成的愈傷組織形狀為半球形或不規(guī)則形，子葉形成的愈傷組 織形狀為不規(guī)則形；子葉也可以形成褐化的不規(guī)則形愈傷組織，顏色為黃褐色，質(zhì)地粘稠或 堅(jiān)硬；愈傷組織誘導(dǎo)率為胚根(25% ) >子葉(5. 9% )；培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，胚軸未產(chǎn)生任何 愈傷組織。其中培養(yǎng)基中的碳源、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等都可以用現(xiàn)有的成分來(lái)替代，在誘 導(dǎo)效果上同上述的N6固體培養(yǎng)基效果類似。實(shí)施例3PESI固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)大葉藻愈傷組織本實(shí)例3的大葉藻愈傷組織誘導(dǎo)方法與實(shí)例1相同，只是培養(yǎng)基為PESI固體培養(yǎng) 基。其中PESI固體培養(yǎng)基是在PESI基本培養(yǎng)基中添加凝固用的7g/L瓊脂，所添加的碳源 為30g/L蔗糖，并添加生長(zhǎng)素ang/L的2，4-D和細(xì)胞分裂素lmg/L的6-BA，將pH調(diào)為8. 0 后高溫(120°C )高壓(103kPa)滅菌20min，冷卻至固體狀態(tài)后就制成PESI固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)5天左右，胚根和胚軸均可以在PESI培養(yǎng)基上形成半球形和不規(guī)則形的正常 白色愈傷組織；胚根形成的愈傷組織顏色為白色，質(zhì)地略為稀??；胚軸形成的愈傷組織顏 色為半透明色，質(zhì)地比較稀薄；培養(yǎng)21天后，愈傷組織數(shù)量變動(dòng)較小，愈傷組織誘導(dǎo)率為胚 根(70% ) >胚軸(50% )；培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，子葉未產(chǎn)生任何愈傷組織。實(shí)施例4 VSE固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)大葉藻愈傷組織本實(shí)例4的大葉藻愈傷組織誘導(dǎo)方法與實(shí)例1相同只是培養(yǎng)基為VSE固體培養(yǎng) 基。其中VSE固體培養(yǎng)基是在VSE基本培養(yǎng)基中添加凝固用的7g/L瓊脂，所添加的碳源為 30g/L蔗糖，并添加生長(zhǎng)素ang/L的2，4-D和細(xì)胞分裂素lmg/L的6-BA，將pH調(diào)為8. 0后 高溫(120°C )高壓(103kPa)滅菌20min，冷卻至固體狀態(tài)后制成VSE固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)5天左右，胚根和胚軸均可以在VSE培養(yǎng)基上形成半球形和不規(guī)則形正常白色愈傷組織；胚根形成的愈傷組織顏色為白色，質(zhì)地略為稀薄；胚軸形成的愈傷組織顏色 為半透明色，質(zhì)地比較稀薄。子葉只可以在VSE培養(yǎng)基上形成不規(guī)則形愈傷組織，愈傷組織 顏色為半透明色，質(zhì)地比較稀薄。培養(yǎng)21天后，愈傷組織數(shù)量變動(dòng)較小，愈傷組織誘導(dǎo)率為 胚軸(80% ) >胚根(75% ) >子葉(15% )。結(jié)果表明，不同的培養(yǎng)基對(duì)于大葉藻無(wú)菌苗不同部位的愈傷組織誘導(dǎo)效果差別非 常大，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)其中胚根的誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為PESI固體培養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基；胚軸 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為PESI固體培養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基；子葉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為VSE固
體培養(yǎng)基。本發(fā)明方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織一方面可研究大葉藻的生長(zhǎng)發(fā)育及分化的機(jī)制、 遺傳變異規(guī)律，對(duì)大葉藻遺傳育種具有特殊意義；另一方面可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)中的原生 質(zhì)體來(lái)源等。
權(quán)利要求
1.一種大葉藻愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，是用大葉藻的無(wú)菌實(shí)生苗作為誘導(dǎo) 愈傷組織的外植體。
2.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，是在無(wú)菌條件下將大葉藻無(wú)菌苗的胚 根、胚軸、子葉的切段選取任一種或幾種接種于培養(yǎng)基中，在無(wú)菌、培養(yǎng)溫度為15 30°C的 黑暗條件下培養(yǎng)完成愈傷組織的誘導(dǎo)，其中培養(yǎng)基為鹽度20 35%。，且添加了碳源、生長(zhǎng) 素和細(xì)胞分裂素的MS固體培養(yǎng)基、N6固體培養(yǎng)基、PESI固體培養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基中的 任一種。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的四種培養(yǎng)基中添加的碳源是蔗 糖，濃度為30g/L的；生長(zhǎng)素為2，4-D，添加濃度為2mg/L ；細(xì)胞分裂素為6-BA，添加濃度為 lmg/L 的。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的四種培養(yǎng)基的pH值為8.0。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的四種培養(yǎng)基的鹽度為30%。。
6.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的培養(yǎng)溫度為18°C。
7.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的胚根的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為PESI固體培 養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的胚軸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為PESI固體培 養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基。
9.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于上述的子葉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為VSE固體培 養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大葉藻愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，是用大葉藻的無(wú)菌實(shí)生苗作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，具體誘導(dǎo)方式是在無(wú)菌條件下將大葉藻無(wú)菌苗的胚根、胚軸、子葉的切段選取任一種或幾種接種于培養(yǎng)基中，在無(wú)菌、培養(yǎng)溫度為18～30℃的黑暗條件下培養(yǎng)完成愈傷組織的誘導(dǎo)，其中培養(yǎng)基為鹽度20～35‰，且添加了碳源、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的MS固體培養(yǎng)基、N6固體培養(yǎng)基、PESI固體培養(yǎng)基或VSE固體培養(yǎng)基中的任一種。本發(fā)明的方法可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)出大葉藻愈傷組織，為人工條件下實(shí)現(xiàn)大葉藻規(guī)?；M織培養(yǎng)快繁體系做基礎(chǔ)技術(shù)參考，為海草場(chǎng)的恢復(fù)奠定基礎(chǔ)。適用于沼生目大葉藻科大葉藻屬的多年生草本植物種類。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102138530SQ20111008201
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者吳茜, 宮慶禮, 王巧晗 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)