專利名稱：一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別是一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化代謝工程策略提高喜樹毛狀根喜樹堿含量的方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿(Camptothecin，CPT)是最早從中國(guó)特有的喜樹(Camptotheca acuminata)中提取出來(lái)的一種具有顯著抗腫瘤活性的生物堿?，F(xiàn)有多種喜樹堿類藥物如依立替康(Irinotecan)和拓?fù)涮婵?Topotecan)獲得美國(guó)FDA(1992)認(rèn)證，在臨床上被廣泛用于治療卵巢癌、直腸癌及白血病等多種惡性腫瘤，全球市場(chǎng)需求十分巨大。目前世界上喜樹堿類藥物的生產(chǎn)主要是從喜樹等植株中提取，然而由于喜樹天然資源數(shù)量有限，生長(zhǎng)十分緩慢，喜樹堿及其類似物在植物體內(nèi)含量又非常低，且提取環(huán)節(jié)多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以從天然喜樹中提取喜樹堿的方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)喜樹堿日益增長(zhǎng)的需求。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞著擴(kuò)大喜樹堿藥源問(wèn)題進(jìn)行了諸多領(lǐng)域的研究如化學(xué)全合成，半合成及細(xì)胞培養(yǎng)等，并取得了一定的進(jìn)展。喜樹堿的化學(xué)全合成雖然已經(jīng)成功，但因成本太高、產(chǎn)量太低、周期太長(zhǎng)且易造成環(huán)境污染等因素而限制了其商業(yè)化生產(chǎn)；半合成方法雖然是目前最有效的途徑之一，但其前體的提取分離仍然依賴于天然資源的供應(yīng)；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)則存在喜樹堿含量低微及穩(wěn)定性較差等問(wèn)題同樣難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)(Hengel et al 1992)。相比之下，利用基因工程技術(shù)將喜樹堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)氘a(chǎn)喜樹堿的資源植物中，繼而獲得轉(zhuǎn)基因的發(fā)根系或再生植株等，并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)從根本上提高喜樹堿含量的最佳途徑之一(Lorence and Nessler 2004，Lu et al 2008)。深入研究喜樹堿生物合成的代謝途徑及其分子調(diào)控是利用基因工程技術(shù)提高喜樹堿產(chǎn)量的前提和基礎(chǔ)。喜樹堿的生物合成來(lái)自于萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids, TIAs) (Lorence and Nessler2004)。由莽草酸途徑來(lái)的色胺(Tryptamine)與由5-磷酸脫氧木酮糖(DXP)途徑(或甲羥戊酸MVA途徑)經(jīng)多步反應(yīng)生成的裂環(huán)馬錢子苷(Secologanin)，在異胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase, STR)催化下形成吲哚生物堿的共同前體異胡豆苷(Strictosidine，也稱次番木鱉苷)，再經(jīng)過(guò)幾步酶促反應(yīng)后最終生成喜樹堿和10-羥基喜樹堿。大量研究表明，異胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脫羧酶 (Tryptophan decarboxylase，TDC)，香葉醇-10-脫氫酶即櫳牛兒醇-10-羥化酶(Geraniol 10-hydroxylase, GlOH)及 1_ 脫氧木酮糖 _5_ 磷酸合成酶(DXS，I-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase)等關(guān)鍵酶在包括喜樹堿在內(nèi)的TIAs的生物合成中具有重要作用 (Canel et al 1998 ；De Luca et al 1989 ；Lopez-Meyer 1997 ；Yamazaki et al 2003 ； McKnight et al 1990 ；Kutchan 1989 ；Yamazaki et al 2003 ；Lu et al 2008)。采用基因工程手段，將上述的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因STR和GlOH共轉(zhuǎn)化喜樹，將有可能打破喜樹堿生物合成途徑的瓶頸效應(yīng)，獲得喜樹堿高產(chǎn)的喜樹毛狀根或植株，為商業(yè)化生產(chǎn)喜樹堿和羥基喜樹堿提供新型優(yōu)質(zhì)藥源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)技術(shù)中的不足，提供一種有效提高喜樹毛狀根喜樹堿含量的方法。本發(fā)明還提供了實(shí)現(xiàn)上述方法的重組載體。本發(fā)明利用已克隆的長(zhǎng)春花CrSTR和CrGlOH基因，構(gòu)建含所述DNA分子的植物雙價(jià)表達(dá)載體，以發(fā)根農(nóng)桿菌(如C58C1等)為介導(dǎo)，將異胡豆苷合成酶CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶CrGlOH基因同時(shí)導(dǎo)入喜樹(如下胚軸組織)中并再生出毛狀根；PCR和熒光定量PCR檢測(cè)目的基因CrSTR和CrGlOH的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜測(cè)定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿含量。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種用于提高喜樹堿含量的重組載體，含有異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因。一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，包括如下步驟(1)將異胡豆苷合成酶基因(CrSTR 基因，SEQ ID NO. 1，GenBank :Χ53602· 1)和香葉醇-10-脫氫酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID NO. 2，GenBank :AJ251269. 1)插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建重組載體；根據(jù)從NCBI獲得的CrSTR和CrGlOH基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以長(zhǎng)春花幼苗 RNA為模板PCR獲得CrSTR和CrGlOH基因片段；植物表達(dá)載體可選用pCAMBIA質(zhì)粒或pBI質(zhì)粒，尤其是pCAMBIA1304質(zhì)粒；(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；發(fā)根農(nóng)桿菌可選用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4或發(fā)根農(nóng)桿菌菌株 L BA9402 ；(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化喜樹，優(yōu)選為喜樹下胚軸，獲得毛狀根；(4)檢測(cè)步驟(3)毛狀根中的異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH，取篩選結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克?。粰z測(cè)方法為PCR 及 Southern blotting 檢測(cè)。PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，證明目的基因CrSTR和 CrGlOH已整合到喜樹毛狀根基因組中。熒光定量PCR測(cè)定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中CrSTR和CrGlOH基因的相對(duì)表達(dá)量；并用高效液相色譜法測(cè)定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿含量，進(jìn)一步篩選喜樹堿和羥基喜樹堿含量顯著提高的喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。所述的PCR檢測(cè)中，分別在植物表達(dá)載體上啟動(dòng)插入基因(CrSTR，CrGlOH)表達(dá)的組成型表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S的內(nèi)部及插入基因的內(nèi)部設(shè)計(jì)上游及下游特異性引物進(jìn)行DNA 的PCR擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。所述的熒光定量PCR檢測(cè)CrSTR和CrGlOH基因的表達(dá)情況，具體方法為對(duì)經(jīng)PCR 鑒定為陽(yáng)性的毛狀根克隆進(jìn)行總RNA的提取并反轉(zhuǎn)成cDNA第一條鏈，分別設(shè)計(jì)插入目的基因及看家基因ISSrRNA的引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，用相對(duì)定量法分析CrSTR和CrGlOH基因的相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明的雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化策略提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，采用基因工程方法，將雙關(guān)鍵酶基因(CrSTR，CrGlOH)導(dǎo)入喜樹下胚軸中，獲得了高產(chǎn)喜樹堿的喜樹毛狀根株系。共轉(zhuǎn)CrSTR及CrGlOH基因的毛狀根中所檢測(cè)的喜樹堿和羥基喜樹堿含量相比于對(duì)照組顯著提高，平均含量為4. 95mg/g和0. 46mg/g，是對(duì)照組毛狀根(1. 03mg/g和 0. 21mg/g Dff)的 4. 8 倍和 2. 2 倍。本發(fā)明應(yīng)用一些常規(guī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法如載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測(cè)、熒光定量 PCR分析、喜樹堿提取及含量測(cè)定等，建立了一種有效提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，為喜樹毛狀根商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新型優(yōu)質(zhì)藥源。但目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化策略提高喜樹毛狀根喜樹堿含量的相關(guān)報(bào)道。因此，本發(fā)明在實(shí)際解決喜樹堿藥源緊缺性的問(wèn)題上具有十分重要的意義。


圖1為實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因毛狀根中目的基因glOh㈧和str⑶基因的PCR檢測(cè)圖， 其中，M :DL2000分子大小標(biāo)記；PC 質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)；NC 空載體轉(zhuǎn)化得毛狀根(陰性對(duì)照)。阿拉伯?dāng)?shù)字代表不同的轉(zhuǎn)基因毛狀根無(wú)性系。圖2為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根中CrSTR和CrGlOH基因的表達(dá)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說(shuō)明書建議的條件。實(shí)施例1長(zhǎng)春花CrSTR及CrGlOH基因編碼序列的獲得1.1.長(zhǎng)春花總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit從長(zhǎng)春花幼苗中提取總 RNA(提取步驟參照試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書)。用于提取總RNA的長(zhǎng)春花幼苗的鮮重量為0. Ig 左右，在提取過(guò)程中樣品中的DNA已用DNase工作液清除。將提取的RNA在分光光度計(jì)上測(cè)定相關(guān)的吸光值，計(jì)算所提取RNA的純度及濃度。根據(jù)不同RNA樣品的濃度通過(guò)計(jì)算后， 分別以0.5yg RNA為起始量，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成(操作步驟參照Promega公司提供的相關(guān)說(shuō)明書)。1. 2. CrSTR和CrGlOH編碼序列特異引物的設(shè)計(jì)及目的基因片段的獲得根據(jù)從NCBI獲得的所述CrSTR基因的編碼序列(SEQ ID NO. 1)和CrGlOH基因的編碼序列(SEQ ID NO. 2)，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游特異引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建植物表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。DNA序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank上登錄的長(zhǎng)春花CrSTR基因(SEQ IDNO. 1)和CrGlOH基因(SEQ ID NO. 2)的編碼序列完全一致。引物序列為str-F 5' -GCGGATCCATGGCAAACTTTTCTGAATCTAAATCCAT-3’GGATCC 為 BamHI 酶切位點(diǎn)str-R 5' TCGAGCTCCT AGCTAGAAAC ATAAGAATTTCCCTTGT-3，GAGCTC 為 SacI 酶切位點(diǎn)glOh-F 5' -GGAGATCTATGGATTACCTTACCATAATATTAAC-3’AGATCT 為 BglII 酶切位點(diǎn)glOh-R 5' TCGGTGACCTTAAAGGGTGCTTGGTACAG-3‘GGTGACC 為 BstEII 酶切位點(diǎn)實(shí)施例2含長(zhǎng)春花CrSTR及CrGlOH基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建2.1.中間載體 pCAMBIA1304+的構(gòu)建以pBI121和pCAMBIA1304為材料，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+。具體地， Hindlll/EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表達(dá)盒及 pCAMBIA1304 大片段；連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落抽提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+ 構(gòu)建成功。2. 2.植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-CrG10H 的構(gòu)建在上述構(gòu)建成功的PCAMBIA1304+基礎(chǔ)上，用從長(zhǎng)春花中克隆到的CrGlOH基因替換其上的GUS基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pMD18T_CrG10H和pCAMBIA1304+ ；回收 CrGlOH基因和pCAMBIA1304+大片段；連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽(yáng)性克??；提取質(zhì)粒進(jìn)一步酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，CrGlOH基因已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+ 中，從而獲得含CrGlOH基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+-CrG10H。2. 3.植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H 的構(gòu)建以上述的pCAMB I Al 304+-CrG 1OH為基礎(chǔ)，用從長(zhǎng)春花中克隆的Cr STR基因替換 pCAMBIA1304+-CrG10H 上的 GFP+GUS 基因。具體地，Bglll/BstEII 雙酶切 pMD18T_CrSTR 和 pCAMBIA1304+-CrG10H ；回收 CrSTR 基因及 pCAMBIA1304+_CrG10H 大片段；連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽(yáng)性克??；提取質(zhì)粒進(jìn)一步酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，CrSTR基因已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+-CrG10H中，從而獲得含CrSTR和CrGlOH的植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H。本實(shí)施例將萜類吲哚生物堿合成途徑關(guān)鍵酶基因CrSTR和CrGlOH可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含CrSTR和CrGlOH基因的植物表達(dá)載體 PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H，該表達(dá)載體可用于通過(guò)代謝工程策略來(lái)提高喜樹中喜樹堿含量。實(shí)施例3發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)CrSTR和CrGlOH基因遺傳轉(zhuǎn)化喜樹獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根3. 1.含植物表達(dá)載體PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實(shí)施例2中含CrSTR和CrGlOH基因的植物雙價(jià)表達(dá)載體 PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，含CrSTR和CrGlOH基因的植物表達(dá)載體已成功構(gòu)建到發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1中。3. 2.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)CrSTR和CrGlOH基因遺傳轉(zhuǎn)化喜樹3. 2. 1.外植體的預(yù)培養(yǎng)
剪取喜樹無(wú)菌下胚軸(l-3cm)，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(B5)上，25°C暗培養(yǎng)2d。3. 2. 2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將上述經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的喜樹下胚軸外植體，放入含活化好的上述發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的 1/2MS懸液中浸泡10分鐘(輕輕搖晃使外植體與菌液充分接觸)后，取出浸染后的喜樹下胚軸用無(wú)菌吸水紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基4中，暗培養(yǎng)2d。3. 2. 3.毛狀根的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)將上述的共培養(yǎng)2d的喜樹外植體轉(zhuǎn)接到除菌固體培養(yǎng)基(B5+Cef500mg/L)中， 250C 16h/ !光照培養(yǎng)2-3周左右，可從外植體傷口處長(zhǎng)出毛狀根。剪下(大約l-3cm)的毛狀根，接種于B5+Cef500mg/L培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3周。轉(zhuǎn)入B5+Cef 250mg/L培養(yǎng)基中繼代篩選，每2周繼代培養(yǎng)一次。經(jīng)過(guò)數(shù)次繼代后即可完全脫菌。再將良好的喜樹毛狀根轉(zhuǎn)入無(wú)抗生素的B5培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右。3. 3.轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根的PCR檢測(cè)3. 3. 1.轉(zhuǎn)基因毛狀根基因組DNA的提取本發(fā)明采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因毛狀根基因組DNA。剪取3. 2. 3中除菌完畢的轉(zhuǎn)基因毛狀根5cm左右放入1. 5ml離心管中，加入適量的石英砂及600 μ 1 CTAB裂解液(65°C預(yù)熱，含β巰基乙醇)，用研磨棒將材料充分磨碎。置于65°C水浴鍋中40-50分鐘，其間多次混勻樣品(次/lOmin)，冷卻至室溫后加入等入體積的苯酚，輕輕顛倒混勻乳化lOmin， 12000rpm離心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等體積苯酚/氯仿(1 1)，輕輕混勻，12000rpm離心20min，緩慢吸取上清于新EP管中，加等體積的氯仿混勻，12000rpm離心 20min，緩慢吸取上清于新EP管中，加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，析出沉淀。用槍頭將沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗滌過(guò)夜。次日用75%乙醇再洗滌兩次，吸出上清，室溫晾干，加入30-50 μ 1水溶解沉淀，用RNA酶處理后于_80°C超低溫冰箱凍存，備用。3.3.2.引物設(shè)計(jì)及PCR檢測(cè)在PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H上啟動(dòng)插入目的基因表達(dá)的組成型表達(dá)啟動(dòng)子 CaMV35S及插入基因上分別設(shè)計(jì)特異性上游及下游引物，用PCR方法對(duì)上述毛狀根的總DNA 進(jìn)行分子檢測(cè)，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根株系。引物序列為
權(quán)利要求
1.一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建重組載體；(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化喜樹，獲得毛狀根；(4)檢測(cè)步驟(3)毛狀根中的異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因，取篩選結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆。
2.權(quán)利要求1所述一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(1)中的異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因片段以長(zhǎng)春花幼苗RNA為模板 PCR獲得。
3.權(quán)利要求1所述一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(1)中的植物表達(dá)載體為pCAMBIA質(zhì)?；騪BI質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1所述一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(2)所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4或發(fā)根農(nóng)桿菌菌株 L BA9402。
5.權(quán)利要求1所述一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(3)中用含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化喜樹下胚軸，獲得毛狀根。
6.權(quán)利要求1所述一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法，其特征在于，步驟(4)所述的檢測(cè)方法為PCR及Southern blotting檢測(cè)。
7.一種用于提高喜樹堿含量的重組載體，其特征在于，含有異胡豆苷合成酶基因和香葉醇-10-脫氫酶基因。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，從長(zhǎng)春花中克隆出異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶CrG10H的編碼框序列，構(gòu)建含上述基因的植物雙價(jià)高效表達(dá)載體，以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化喜樹獲得轉(zhuǎn)基因的喜樹毛狀根。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根中喜樹堿含量顯著提高，喜樹堿含量為對(duì)照的4.8倍，羥基喜樹堿含量為對(duì)照的2.2倍。單獨(dú)轉(zhuǎn)CrSTR基因的毛狀根喜樹堿含量比對(duì)照提高了2.4倍，單獨(dú)轉(zhuǎn)CrG10H基因的毛狀根喜樹堿含量并無(wú)明顯提高。本發(fā)明提供了一種提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新方法。
文檔編號(hào)A01H5/06GK102212549SQ20111008405
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者周聰聰, 季倩, 開國(guó)銀, 李?yuàn)檴? 王偉 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)