專利名稱:轉(zhuǎn)錄因子orca3和關(guān)鍵酶g10h雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域,特別是一種轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化代謝工程策略提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法。
背景技術(shù):
喜樹堿(Camptothecin,CPT)是最早從中國特有的喜樹(Camptotheca acuminata)中提取出來的一種具有顯著抗腫瘤活性的生物堿?,F(xiàn)有多種喜樹堿類藥物如依立替康(Irinotecan)和拓?fù)涮婵?Topotecan)獲得美國FDA(199》認(rèn)證,在臨床上被廣泛用于治療卵巢癌、直腸癌及白血病等多種惡性腫瘤,全球市場需求十分巨大。目前世界上喜樹堿類藥物的生產(chǎn)主要是從喜樹等植株中提取,然而由于喜樹天然資源數(shù)量有限,生長十分緩慢,喜樹堿及其類似物在植物體內(nèi)含量又非常低,且提取環(huán)節(jié)多、費時費力,所以從天然喜樹中提取喜樹堿的方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對喜樹堿日益增長的需求。多年來,國內(nèi)外學(xué)者圍繞著擴(kuò)大喜樹堿藥源問題進(jìn)行了諸多領(lǐng)域的研究如化學(xué)全合成,半合成及細(xì)胞培養(yǎng)等,并取得了一定的進(jìn)展。喜樹堿的化學(xué)全合成雖然已經(jīng)成功, 但因成本太高、產(chǎn)量太低、周期太長且易造成環(huán)境污染等因素而限制了其商業(yè)化生產(chǎn);半合成方法雖然是目前最有效的途徑之一,但其前體的提取分離仍然依賴于天然資源的供應(yīng);細(xì)胞懸浮培養(yǎng)則存在喜樹堿含量低微及穩(wěn)定性較差等問題同樣難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn) (Hengel et al 1992)。相比之下,利用基因工程技術(shù)將喜樹堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)氘a(chǎn)喜樹堿的資源植物中,繼而獲得轉(zhuǎn)基因的發(fā)根系或再生植株等,并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)是實現(xiàn)從根本上提高喜樹堿含量的最佳途徑之一(Lorence and Nessler2004, Lu et al 2008)。大量研究表明,異胡豆苷合成酶(STR),色氨酸脫羧酶(Tryptophan decarboxylase, TDC),香葉醇-10-脫氫酶即櫳牛兒醇-10-羥化酶(Geraniol 10-hydroxylase, GlOH)及 1_ 脫氧木酮糖 _5_ 磷酸合成酶(l-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase, DXS)等關(guān)鍵酶在包括喜樹堿在內(nèi)的TIAs的生物合成中具有重要作用(Canel et al 1998 ;De Luca et al 1989 ; Lopez -Meyer 1997 ;Yamazaki et al 2003 ;McKnight et al 1990 ;Kutchan 1989 ;Yamazaki et al 2003 ;Lu et al 2008)。另外,近年來轉(zhuǎn)錄因子正逐漸被認(rèn)為是一種能有效地調(diào)控植物次生代謝途徑的新手段。通過超量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子,能夠有效地克服多基因共轉(zhuǎn)化存在的弊端,全面上調(diào)能被其調(diào)控的相關(guān)基因的表達(dá)水平,對整個次生代謝途徑的調(diào)控效果要比單純依賴單個(或多個)結(jié)構(gòu)基因的增強(qiáng)表達(dá)好得多。例如van der Fits和MemelinkQ000)在SCIENCE 上報道發(fā)現(xiàn)一個受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)并能夠調(diào)控植物初級和次生代謝的中央轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 0RCA3(Octadecanoie-responsive Cantharanthus AP2-domain protein 3),會邑增強(qiáng)TIAs生物合成代謝途徑中絕大多數(shù)催化酶基因的協(xié)同表達(dá),從而有效地調(diào)控長春花 (Catharanthus roseus)中TIAs的生物合成,充分展示了用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來調(diào)控TIAs生物合成的巨大潛力。0RCA3的發(fā)現(xiàn)為調(diào)控喜樹堿的代謝合成提供了一種新的研究切入點。必須指出的是轉(zhuǎn)錄因子并非萬能的,單轉(zhuǎn)化一個0RCA3基因,雖然可以調(diào)控諸如AS,TDC,DXS, CPR和STR等多個關(guān)鍵酶基因的協(xié)同表達(dá),但是有些基因如關(guān)鍵酶基因GlOH并不受0RCA3 的調(diào)控。在0RCA3基因過量表達(dá)的細(xì)胞中由于關(guān)鍵酶基因GlOH的表達(dá)不足,從而限制了 TIA代謝終產(chǎn)物如長春堿的產(chǎn)量沒有得到顯著提高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)技術(shù)中的不足,提供一種有效提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法。本發(fā)明還提供了實現(xiàn)上述方法的重組載體。本發(fā)明利用已克隆的長春花Cr0RCA3和CrGlOH基因,構(gòu)建含上述基因的植物雙價高效表達(dá)載體,以發(fā)根農(nóng)桿菌(如C58C1等)為介導(dǎo),將Cr0RCA3和CrGlOH基因同時導(dǎo)入喜樹下胚軸中并再生出毛狀根;PCR和熒光定量PCR檢測目的基因Cr0RCA3和CrGlOH的整合和表達(dá)情況,高效液相色譜測定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿含量。技術(shù)方案為一種用于提高喜樹堿含量的重組載體,含有轉(zhuǎn)錄因子基因Cr0RCA3 和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH。轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法,包括如下具體步驟(1)將轉(zhuǎn)錄因子基因(Cr0RCA3 基因,SEQ ID NO. 1,GenBank :EU072424. 1)和香葉醇-10-脫氫酶基因(CrGlOH基因,SEQ ID NO. 2,GenBank :AJ251269. 1)插入植物表達(dá)載
體,構(gòu)建重組載體;以長春花幼苗RNA為模板PCR獲得Cr0RCA3和CrGlOH基因片段;植物表達(dá)載體可選用pCAMBIA質(zhì)?;騪BI質(zhì)粒,尤其是pCAMBIA1304質(zhì)粒;(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌,構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌;發(fā)根農(nóng)桿菌可選用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4或發(fā)根農(nóng)桿菌菌株 L BA9402 ;(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化喜樹,優(yōu)選為喜樹下胚軸,獲得毛狀根;(4)檢測步驟(3)毛狀根中的Cr0RCA3和CrGlOH基因,取篩選結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克??;檢測方法為PCR 及 Southern blotting 檢測。PCR陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆進(jìn)行Southern blot檢測,證明目的基因Cr0RCA3和 CrGlOH已整合到喜樹毛狀根基因組中;熒光定量PCR測定Cr0RCA3和CrGlOH在喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中的表達(dá)情況;高效液相色譜法測定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿含量,進(jìn)一步篩選喜樹堿和羥基喜樹堿含量顯著提高的喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。所述的PCR檢測中,分別在植物表達(dá)載體上啟動插入基因(Cr0RCA3,CrGlOH)表達(dá)的組成型表達(dá)啟動子CaMV35S的內(nèi)部及插入基因的內(nèi)部設(shè)計上游及下游特異性引物進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增,紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。所述的熒光定量PCR檢測Cr0RCA3和CrGlOH基因的表達(dá)情況,具體方法為對經(jīng) PCR鑒定為陽性的毛狀根克隆進(jìn)行總RNA的提取并反轉(zhuǎn)成cDNA第一條鏈,分別設(shè)計插入目的基因及看家基因ISSrRNA的引物,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,用相對定量法分析Cr0RCA3和 CrGlOH基因的相對表達(dá)量。本發(fā)明的雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化策略提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法,采用基因工程方法,將雙關(guān)鍵酶基因(Cr0RCA3,CrGlOH)導(dǎo)入喜樹下胚軸中,獲得了高產(chǎn)喜樹堿的喜樹毛狀根株系。共轉(zhuǎn)Cr0RCA3及CrGlOH基因的毛狀根中所檢測的喜樹堿和羥基喜樹堿含量相比于對照組顯著提高,是對照組毛狀根(非轉(zhuǎn)基因型)的5. 4倍和2. 3倍。將一些常規(guī)生物學(xué)實驗方法如載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測、熒光定量PCR分析、喜樹堿提取及含量測定等應(yīng)用于本發(fā)明,建立了一種有效提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法,篩選出喜樹堿和羥基喜樹堿含量大幅度提高的轉(zhuǎn)基因喜樹發(fā)根系,為生產(chǎn)具重要臨床需求的喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新型優(yōu)質(zhì)藥源,為今后應(yīng)用生物技術(shù)大量生產(chǎn)喜樹堿及最終解決喜樹堿的藥源短缺問題提供一條新途徑,也為喜樹毛狀根商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。將上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因0RCA3和關(guān)鍵酶基因GlOH構(gòu)建成雙價植物表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這兩個基因共同轉(zhuǎn)入喜樹中,并考察了其對喜樹堿合成代謝途徑的調(diào)控效應(yīng)及對代謝物產(chǎn)量的影響,最終篩選出喜樹堿和羥基喜樹堿含量大幅度提高的轉(zhuǎn)基因喜樹發(fā)根系,為今后應(yīng)用生物技術(shù)大量生產(chǎn)喜樹堿及最終解決喜樹堿的藥源短缺問題提供一條新途徑。
圖1為實施例4熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根中Cr0RCA3和CrGlOH基因的表達(dá)
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如分子克隆(Sambrook等),或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說明書建議的條件。實施例1長春花Cr0RCA3及CrGlOH基因編碼序列的獲得1.1.長春花總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit從長春花幼苗中提取總 RNA(提取步驟參照試劑盒內(nèi)的說明書)。用于提取總RNA的長春花幼苗的鮮重量為0. Ig 左右,在提取過程中樣品中的DNA已用DNase工作液清除。將提取的RNA在分光光度計上測定相關(guān)的吸光值,計算所提取RNA的純度及濃度。根據(jù)不同RNA樣品的濃度通過計算后, 分別以0.5yg RNA為起始量,用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成(操作步驟參照Promega公司提供的相關(guān)說明書)。1. 2. Cr0RCA3和CrGlOH編碼序列特異引物的設(shè)計及目的基因片段的獲得
根據(jù)從NCBI獲得的所述Cr0RCA3基因的編碼序列(SEQ IDN0. 1)和CrGlOH基因的編碼序列(SEQ ID NO. 2),分別設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼框的上下游特異引物,并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定),以便構(gòu)建植物表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。DNA序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。測序結(jié)果表明,所克隆的序列與GenBank上登錄的長春花Cr0RCA3基因(SEQ ID NO. 1)和CrGlOH基因(SEQ ID NO. 2)的編碼序列完全一致。實施例2含長春花Cr0RCA3及CrGlOH基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建2.1.中間載體 pCAMBIA1304+的構(gòu)建以pBI121和pCAMBIA1304為材料,構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+。具體地, Hindlll/EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ;回收 pBI121_GUS 表達(dá)盒及 pCAMBIA1304 大片段;連接轉(zhuǎn)化,挑取單克隆菌落抽提質(zhì)粒酶切驗證。結(jié)果表明,植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+ 構(gòu)建成功。2. 2.植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-CrG10H 的構(gòu)建在上述構(gòu)建成功的PCAMBIA1304+基礎(chǔ)上,用從長春花中克隆到的CrGlOH基因替換其上的GUS基因。具體地,BamHI/SacI雙酶切pMD18T_CrG10H和pCAMBIA1304+ ;回收 CrGlOH基因和pCAMBIA1304+大片段;連接轉(zhuǎn)化,挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克??;提取質(zhì)粒進(jìn)一步酶切驗證。結(jié)果表明,CrGlOH基因已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+ 中,從而獲得含CrGlOH基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+-CrG10H。2. 3.植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-Cr0RCA3-CrG10H 的構(gòu)建以上述的pCAMBIA1304+-CrG10H為基礎(chǔ),用從長春花中克隆的Cr0RCA3基因替換 pCAMBIA1304+-CrG10H 上的 GFP+GUS 基因。具體地,Bglll/BstEII 雙酶切 pMD18T_Cr0RCA3 和 pCAMBIA1304+-CrG10H ;回收 Cr0RCA3 基因及 pCAMBIA1304+_CrG10H 大片段;連接轉(zhuǎn)化,挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克??;提取質(zhì)粒進(jìn)一步酶切驗證。結(jié)果表明,Cr0RCA3基因已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+-CrG10H中,從而獲得含Cr0RCA3和CrGlOH的植物表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-Cr0RCA3-CrG10H。本實施例將喜樹堿合成途徑關(guān)鍵酶基因Cr0RCA3和CrGlOH可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列,形成含Cr0RCA3和CrGlOH基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+-Cr0RCA3_CrG10H, 該表達(dá)載體可用于通過代謝工程策略來提高喜樹中喜樹堿含量。實施例3發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)Cr0RCA3和CrGlOH基因遺傳轉(zhuǎn)化喜樹獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根3. 1.含植物表達(dá)載體PCAMBIA1304+-Cr0RCA3-CrG10H發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實施例2中含Cr0RCA3和CrGlOH基因的植物雙價表達(dá)載體 pCAMBIA1304+-Cr0RCA3-CrG10H轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中,挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗證。 結(jié)果表明,含Cr0RCA3和CrGlOH基因的植物表達(dá)載體已成功構(gòu)建到發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1中。3. 2.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)Cr0RCA3,CrGlOH基因遺傳轉(zhuǎn)化喜樹3. 2. 1.外植體的預(yù)培養(yǎng)剪取喜樹無菌下胚軸(l-3cm),接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(B5)上,25°C暗培養(yǎng)2d。3. 2. 2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
將上述經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的喜樹下胚軸外植體,放入含活化好的上述發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的 1/2MS懸液中浸泡10分鐘(輕輕搖晃使外植體與菌液充分接觸)后,取出浸染后的喜樹下胚軸用無菌吸水紙吸干表面菌液,轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基4中,暗培養(yǎng)2d。3. 2. 3.毛狀根的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)將上述的共培養(yǎng)2d的喜樹外植體轉(zhuǎn)接到除菌固體培養(yǎng)基(B5+Cef500mg/L)中, 250C 16h/ !光照培養(yǎng)2-3周左右,可從外植體傷口處長出毛狀根。剪下(大約l-3cm)的毛狀根,接種于B5+Cef500mg/L培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3周。轉(zhuǎn)入B5+Cef 250mg/L培養(yǎng)基中繼代篩選,每2周繼代培養(yǎng)一次。經(jīng)過數(shù)次繼代后即可完全脫菌。再將良好的喜樹毛狀根轉(zhuǎn)入無抗生素的B5培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右。3. 3.轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根的PCR檢測3. 3. 1.轉(zhuǎn)基因毛狀根基因組DNA的提取本發(fā)明采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因毛狀根基因組DNA。剪取3. 2. 3中除菌完畢的轉(zhuǎn)基因毛狀根5cm左右放入1. 5ml離心管中,加入適量的石英砂及600 μ 1 CTAB裂解液(65°C預(yù)熱,含β巰基乙醇),用研磨棒將材料充分磨碎。置于65°C水浴鍋中40-50分鐘,其間多次混勻樣品(次/lOmin),冷卻至室溫后加入等入體積的苯酚,輕輕顛倒混勻乳化lOmin, 12000rpm離心20min,小心吸取上清于新EP管中,加入等體積苯酚/氯仿(1 1),輕輕混勻,12000rpm離心20min,緩慢吸取上清于新EP管中,加等體積的氯仿混勻,12000rpm離心 20min,緩慢吸取上清于新EP管中,加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇,析出沉淀。用槍頭將沉淀挑到新EP管中,加入75%乙醇4°C洗滌過夜。次日用75%乙醇再洗滌兩次,吸出上清,室溫晾干,加入30-50 μ 1水溶解沉淀,用RNA酶處理后于_80°C超低溫冰箱凍存,備用。3.3.2.引物設(shè)計及PCR檢測在PCAMBIA1304+-Cr0RCA3-CrG10H上啟動插入目的基因表達(dá)的組成型表達(dá)啟動子 CaMV35S及插入基因上分別設(shè)計特異性上游及下游引物,用PCR方法對上述毛狀根的總DNA 進(jìn)行分子檢測,紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽性轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根株系。引物序列為
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法,其特征在于, 包括以下步驟(1)將轉(zhuǎn)錄因子基因Cr0RCA3和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH插入植物表達(dá)載體,構(gòu)建重組載體;(2)將步驟(1)所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌,構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌;(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化喜樹,獲得毛狀根;(4)檢測步驟(3)毛狀根中的Cr0RCA3和CrGlOH基因,取篩選結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆。
2.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法,其特征在于,步驟(1)中的Cr0RCA3和CrGlOH基因片段以長春花幼苗RNA為模板PCR獲得。
3.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法,其特征在于,步驟(1)中的植物表達(dá)載體為pCAMBIA質(zhì)?;騪BI質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹堿含量的方法,其特征在于,步驟( 所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4 或發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA9402。
5.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法,其特征在于,步驟(3)中用含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化喜樹下胚軸,獲得毛狀根。
6.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子0RCA3和關(guān)鍵酶GlOH雙基因共轉(zhuǎn)化提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法,其特征在于,步驟(4)所述的檢測方法為PCR及Southern blotting檢測。
7.一種用于提高喜樹堿含量的重組載體,其特征在于,含有轉(zhuǎn)錄因子基因Cr0RCA3和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法。從長春花中克隆出CrORCA3和CrG10H基因的編碼框序列,構(gòu)建含上述基因的植物雙價高效表達(dá)載體,以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化喜樹獲得轉(zhuǎn)CrORCA3和CrG10H基因的喜樹毛狀根。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根中喜樹堿含量顯著提高,喜樹堿含量為對照的5.4倍,羥基喜樹堿含量為對照的2.3倍。單獨轉(zhuǎn)CrORCA3基因的毛狀根喜樹堿含量比對照提高了1.5倍,單獨轉(zhuǎn)CrG10H基因的毛狀根喜樹堿含量并無明顯提高。本發(fā)明提供了一種提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法,也為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新方法。
文檔編號A01H5/06GK102212550SQ20111008410
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者付雪晴, 尤麗佳, 開國銀, 李姍姍, 王偉 申請人:上海師范大學(xué)