專利名稱：稻黑孢菌46代謝產(chǎn)物在防治黃瓜立枯病菌中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及生防內(nèi)生真菌——稻黑孢菌 (Nigrospora oryzae)的培養(yǎng)及其代謝產(chǎn)物的應用。
背景技術：
植物體內(nèi)都存在大量的內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌最早發(fā)現(xiàn)于牧草，后來又在木本植物、 草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發(fā)現(xiàn)。迄今的研究表明，植物內(nèi)生真菌可增強宿主的抗病性、提高植物的生產(chǎn)力、抗逆抗蟲等。發(fā)揮這些作用是由于內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)繁殖和生長，并在體內(nèi)產(chǎn)生有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。因此，內(nèi)生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和生物農(nóng)藥研制方面具有重要的用途。近年來植物內(nèi)生真菌已引起了微生物學家、生態(tài)學家、植物保護學家的廣泛興趣，逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點。目前微生物源生物化學農(nóng)藥的研究和開發(fā)在我國十分活躍，但微生物資源及其應用潛力尚沒有得到充分的發(fā)揮，而植物內(nèi)生真菌即是這樣一類有待開發(fā)的新興微生物資源。目前對植物病害的防治，主要采用化學農(nóng)藥殺滅病原菌，但化學農(nóng)藥對人畜的毒副作用和殘留問題至今仍難以有效的解決。利用內(nèi)生真菌產(chǎn)生的抗病原真菌的活性物質(zhì)進行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產(chǎn)和低毒等優(yōu)點。本發(fā)明從夾竹桃中分離到一株生防內(nèi)生真菌，并對該菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行了抑菌作用研究。該發(fā)明為微生物源農(nóng)藥的進一步研制和開發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對化學農(nóng)藥不安全與微生物源農(nóng)藥種類較少的不足，提供一種從夾竹桃中分離篩選出的內(nèi)生真菌-稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)；本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株代謝產(chǎn)物防治植物真菌病害的方法。本發(fā)明稻黑孢菌的分離、篩選與鑒定是于2008年6月在浙江省農(nóng)業(yè)科學院內(nèi)采集的夾竹桃莖中，經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)、發(fā)酵和活性測定等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類學鑒定為稻黑孢菌(Mgrospora oryzae)，定名為稻黑孢菌(Nigrospora oryzae) 46 0該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCCNo.4509。稻黑孢菌46，其固體培養(yǎng)特征為在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白色，后為灰白，氣生菌絲發(fā)達。在平板上4-5天擴展9cm。顯微形態(tài)特征分生孢子梗無色、有隔；分生孢子黑色、卵圓到球行、表面光滑、單細胞。本發(fā)明所述的稻黑孢菌46，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代謝產(chǎn)物。本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)一種防治黃瓜立枯病、番茄灰霉病或菜豆炭疽病等植物真菌病害微生物代謝產(chǎn)物的制備方法，按以下步驟進行(1)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的稻黑孢菌46菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在士 1°C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性淀粉 20g，麩皮 10g，蛋白胨 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液60mL ；配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取1直徑為 4mm菌餅，在士 1°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)12 ；(3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，離心收集發(fā)酵上清液，用常規(guī)有機溶劑萃取經(jīng)真空濃縮后獲得浸膏，用于抑菌活性測定。本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明從植物夾竹桃莖中分離篩選出代謝物對部分植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的稻黑孢菌46，這為農(nóng)業(yè)上防治植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株；二是本發(fā)明提供了利用稻黑孢菌46發(fā)酵獲得活性代謝產(chǎn)物的方法；該代謝產(chǎn)物可應用于植物真菌病害的防治，為農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。
具體實施例方式實施例1 (稻黑孢菌46的分離與篩選)本發(fā)明于2008年6月在浙江省農(nóng)業(yè)科學院內(nèi)采集夾竹桃莖，經(jīng)表面消毒、內(nèi)生真菌分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟，從中獲得稻黑孢菌46，保存。稻黑孢菌46抑菌活性測定取經(jīng)0. 22 μ m膜過濾的發(fā)酵上清液ImL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放1個直徑為4mm的黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)或菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)或番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等供試菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采
用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率
難生刪摔=對照菌m菌落直徑蕭/。
對照菌落直徑-4測定結果表明稻黑孢菌46代謝產(chǎn)物對黃瓜立枯病菌、西瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制率分別為96%、93%和98%。實施例2 (稻黑孢菌46發(fā)酵代謝產(chǎn)物的制備方法)按以下步驟進行(1)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的稻黑孢菌46菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在士 1°C條件下培養(yǎng)，至菌絲覆蓋整個培養(yǎng)皿，用直徑為4mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，可溶性
4淀粉 20g，麩皮 10g，蛋白胨 8g，NH4NO3 3g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 lg，每 300mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液60mL ；配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取1直徑為4mm菌餅，在士 1條件下，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)12 ；(3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢后離心收集發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物，供抑菌活性測定。以下實施例3、4中所述的稻黑孢菌46代謝產(chǎn)物均為實施例2所制產(chǎn)品；所述產(chǎn)品的百分含量均為質(zhì)量/體積百分比。實施例3 (稻黑孢菌46代謝產(chǎn)物對黃瓜立枯病菌、菜豆炭疽病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用)(1)準確稱取稻黑孢菌46代謝產(chǎn)物0. 03g，并加入IOmL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為3g/L的母液；(2)抑菌活性測定取上述母液分別稀釋成濃度為1500mg/L和1000mg/L的溶液， 取各濃度溶液ImL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻(稻黑孢菌 46代謝產(chǎn)物終濃度為150mg/L和100mg/L)，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放1個直徑為 4mm的菜豆炭疽病菌或黃瓜立枯病菌或番茄灰霉病菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，以常規(guī)化學藥劑和無菌水處理作為對照，重復3次； 采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率
權利要求
1.稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)46代謝產(chǎn)物防治黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)的應用。
2.權利要求1所述的應用，其中稻黑孢菌46代謝產(chǎn)物由以下方法獲得稻黑孢菌46經(jīng)斜面活化培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物，所述的稻黑孢菌46已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCC No. 4509。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術領域，本發(fā)明所述的夾竹桃內(nèi)生真菌是從浙江省農(nóng)業(yè)科學院內(nèi)采集的夾竹桃活體中采用內(nèi)生真菌分離技術分離獲得的，經(jīng)微生物分類學鑒定，命名為稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)46，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2010年12月31日，保藏登記號CGMCC No.4509。本發(fā)明最顯著的特征是該菌株液體發(fā)酵能產(chǎn)生對黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)和番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等有抑制作用的活性代謝產(chǎn)物，是農(nóng)業(yè)上重要的微生物資源。
文檔編號A01N63/04GK102210331SQ201110088208
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權日2011年4月8日
發(fā)明者俞曉平, 申屠旭萍, 董勝張, 邊亞琳, 郝培應, 馬正 申請人:中國計量學院