專利名稱：一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生dh植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)和植物育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用一種植物單倍體育種方法創(chuàng)制足夠數(shù)量純合育種自交系資源，尤其是一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH 植株的方法。
背景技術(shù)：
甘藍(Brassica oleracea L.)原產(chǎn)于地中海沿岸，為十字花科蕓薹屬二年生異花授粉作物，春化需要植株生長到一定體積大小，才能感應(yīng)低溫，通過春化，屬綠體春化型， 其具有十分明顯的雜種優(yōu)勢。甘藍一代雜種在國內(nèi)外已被普遍應(yīng)用，其優(yōu)良一代雜交種的育種研究是以豐富優(yōu)良、遺傳性穩(wěn)定的純合自交系為基礎(chǔ)的。目前，國內(nèi)外甘藍優(yōu)良自交系選育主要采用兩條途徑，一條是通過常規(guī)育種靠多代連續(xù)自交定向選擇獲得，一條是通過單倍體育種采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得穩(wěn)定雙單倍體純合系(DoubleHaploid簡稱DH株系)；前者常規(guī)育種方法，自交系純合選育周期較長，一般需要6 8年，后者單倍體生物技術(shù)育種，它是一種快速純合自交系和創(chuàng)制新育種資源的有效育種途徑，創(chuàng)制自交系周期較短，僅需2 3年，育種效率顯著，但技術(shù)難度較大。甘藍游離小孢子培養(yǎng)中除普遍存在小孢子發(fā)育的同步性較差，成胚率遠低于其他蕓薹屬作物，即使誘導(dǎo)成胚，一個小孢子胚狀體僅能再生同一基因型1 2個DH植株，即使胚狀體不定芽再經(jīng)2 3次繼代后也只能得到同一來源小孢子胚狀體4 6個DH株，不利DH植株群體農(nóng)藝性狀提早鑒定、也延遲了育種年限，這些問題不僅影響著甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)有效應(yīng)用，而且也阻礙著甘藍雜種一代新品種的快速選育。因此，我們針對甘藍植物學(xué)特性，為了提高甘藍單倍體育種中游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用效率，研究發(fā)明出一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法成為該領(lǐng)域的一個創(chuàng)新點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法。采用如下技術(shù)方案一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，包括以下步驟Al，胚狀體不定芽誘導(dǎo)；A2，外植體獲得以小孢子胚狀體誘導(dǎo)出不定芽葉片達 Icm時起計算葉片生長日齡，選用一定生長日齡的葉片作為離體培養(yǎng)的外植體。在超凈工作臺上將培養(yǎng)有胚狀體不定芽的試管外部消毒后，隨后打開試管口從葉柄處剪下葉片，然后將葉片切成1.0cm見方的小方塊；A3，外植體再生芽的分化誘導(dǎo)，將步驟A2獲得的外植體接種于外植體再生芽分化培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25士 1)°C，光照 16h · cf1，光強為20001x的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)；A4，再生芽的生根誘導(dǎo)與移栽，剪下長有3 4片葉的再生芽插入MS+NAA 0. 3mg · Γ1生根培養(yǎng)基進行生根；當DH株根系長至4 5cm 左右時開始煉苗，三角瓶封口膜先半開半閉，2天后完全打開，7天后取出DH株小苗將根部殘留培養(yǎng)基用流水洗凈，移栽到裝有專用培養(yǎng)土，即體積比為培養(yǎng)土 珍珠巖蛭石=2:1: 1的培養(yǎng)缽中，同時將培養(yǎng)缽放至有少量水的穴盤之中并置于半陰處，加強澆水管理，1周后帶基質(zhì)移栽到大田中。所述的方法，優(yōu)選的，步驟A2中，所述的外植體葉片生長日齡為25天。所述的方法，優(yōu)選的，所述外植體再生芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2. Omg -L^+NAAO. Img · ^+GA3L 5mg · L—1 ；蔗糖、瓊脂濃度和 pH 值分別為 30g · L"\8g · L—1 和 5. 8。本發(fā)明選擇合適生長日齡的甘藍小孢子胚狀體不定芽葉片為外植體來源，在所述分化培養(yǎng)基上快速誘導(dǎo)分化成再生芽，再經(jīng)生根移栽，獲得大量健壯的甘藍DH植株。該方法具有彌補甘藍游離小孢子培養(yǎng)中1個小孢子胚狀體誘導(dǎo)出不定芽僅能再生出少量DH株的數(shù)量不足，在短時間內(nèi)將有限的同一基因型的小孢子DH植株數(shù)量擴大32倍以上，從而在當年獲得足夠數(shù)量能夠達到農(nóng)藝性狀鑒定標準的、確保通過綠體春化體積大小的同一基因型的小孢子DH群體，克服了甘藍游離小孢子常規(guī)多次繼代培養(yǎng)存在小孢子不定芽生長勢減弱、繼代成活率低、生長周期長、DH植株群體和體積均過小，不利性狀選擇和難以春化等諸多缺陷，實現(xiàn)了當年經(jīng)濟性狀田間鑒定和次年花期配合力測定，達到比普通小孢子培養(yǎng)育種縮短1年時限，從而提高甘藍育種效率。


圖1中A為小孢子子葉型胚狀體；B為子葉型胚狀體在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的不定
芽圖2中A為外植體培養(yǎng)3天時的生長表現(xiàn)；B為外植體在所述培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的再生芽；圖3為本發(fā)明甘藍小孢子不定芽不同生長日齡葉片誘導(dǎo)再生芽的結(jié)果；圖4中A為再生芽在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；B為DH株小苗移栽于培養(yǎng)缽中。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例11材料和方法1.1 材料實例選用甘藍一代雜種品種“秦甘60”自交分離世代中，通過F3代定向選擇的植株，在初花期利用游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的雙單倍體不定芽的葉片作為外植體材料。1.2 方法1. 2. 1胚狀體不定芽誘導(dǎo)2009年7月25日露地落水播種甘藍“秦甘60卞3代種子，當幼苗生長有6片真葉時定植大田，當植株葉球成熟后，按照育種目標選擇游離小孢子培養(yǎng)供體植株，11月15日挖起窖藏假植越冬，翌年3月觀日定植于露地紗網(wǎng)棚內(nèi)，培養(yǎng)植株抽薹現(xiàn)蕾。當植株第一朵花開放時選擇植株上適宜大小的花蕾，利用甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)(例如張恩慧等、 朱守亮等研究建立的甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)張恩慧，楊安平.甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)[M].中國十字花科蔬菜研究進展，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008;朱守亮，張恩慧，楊安平，等.2個甘藍Fl小孢子培養(yǎng)中高出胚率的誘導(dǎo)技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，18(6) :237-241)，誘導(dǎo)培養(yǎng)小孢子胚狀體，選擇健壯子葉型胚狀體(圖1-A)轉(zhuǎn)接于三角瓶中分化培養(yǎng)基上并進行倍性鑒定，分化培養(yǎng)獲得雙單倍體不定芽使其葉片健壯生長(圖 1-B)。1.2. 2外植體獲得和培養(yǎng)當胚狀體不定芽繼代生長至有2 3片真葉時，選用第1或第2葉片作為離體培養(yǎng)的外植體。在超凈工作臺上將培養(yǎng)有胚狀體不定芽的試管外部消毒后，隨后打開試管口從葉柄處剪下葉片，然后將葉片切成1.0cm見方的小方塊，接種于外植體再生芽分化培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基選用在MS中添加6-BA、NAA和GA3不同濃度，蔗糖、瓊脂濃度和PH值分別為30g · Llg · L-1和5. 8 ；溫度(25士 1) °C，光照16h · d—1，光強為20001x 的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。1. 2. 3添加6-BA和NAA對外植體再生芽的誘導(dǎo)將質(zhì)量濃度為1.0,2.0,3.0,4. Omg'Γ1的6-BA分別與質(zhì)量濃度為0. 05、0· 1、0· 2、
0. 4mg · Γ1的NAA組合添加于MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)外植體分化再生芽，設(shè)不添加兩種激素為對照(CK)，比較篩選6-BA和NAA的最佳濃度組合。由圖2和表1可以看出，將小孢子不定芽葉片接種于含有不同質(zhì)量濃度配比的 6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上，接種3天后，切口處有白色小點出現(xiàn)，外植體開始膨大，并且向上凸起，變硬(圖2-A)；培養(yǎng)22天后，愈傷組織變綠，30天生長出再生芽(圖2-B)。在MS 培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA的16個濃度組合均能誘導(dǎo)出再生芽，而未添加6-BA和NAA的處理未誘導(dǎo)出再生芽。在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA誘導(dǎo)出再生芽分化頻率變化范圍在 3. 33% 64. 29%之間；其分化系數(shù)除添加6-BA 3. Omg · Γ1和NAA 0. 4mg · Γ1處理為1相對較小外，其余處理均相對較大，變化范圍在1. 44 4. 60之間。由此得出，添加6-ΒΑ和 NAA兩種激素有利小孢子不定芽葉片誘導(dǎo)再生芽，其誘導(dǎo)效果在MS中添加6-BA 2. Omg -L"1 和NAA 0. Img · Γ1最有利于生長再生芽，再生芽分化頻率為64.，與其它處理呈顯著性差異，分化系數(shù)為4. 03。表1 6-ΒΑ與NAA不同質(zhì)量濃度組合對甘藍小孢子不定芽葉片誘導(dǎo)再生芽的影響
權(quán)利要求
1.一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，其特征在于，包括以下步驟:A1，胚狀體不定芽誘導(dǎo)；A2，外植體獲得以小孢子胚狀體誘導(dǎo)出不定芽葉片達Icm時起計算葉片生長日齡，選用一定生長日齡的葉片作為離體培養(yǎng)的外植體；A3，外植體再生芽的分化誘導(dǎo)，將步驟A2獲得的外植體接種于外植體再生芽分化培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25士 1)°C，光照let^cf1，光強為20001x的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)；A4，再生芽的生根誘導(dǎo)與移栽，剪下長有3 4片葉的再生芽插入MS+NAA 0. 3mg化4生根培養(yǎng)基進行生根； 當DH株根系長至4 5cm左右時開始煉苗，三角瓶封口膜先半開半閉，2天后完全打開，7 天后取出DH株小苗將根部殘留培養(yǎng)基用流水洗凈，移栽到裝有專用培養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，所述的專用培養(yǎng)土，按照體積比計為培養(yǎng)土 珍珠巖蛭石=2 1 1，同時將培養(yǎng)缽放至有少量水的穴盤之中并置于半陰處，加強澆水管理，1周后帶基質(zhì)移栽到大田中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A2中，所述的外植體葉片生長日齡為 25天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植體再生芽分化培養(yǎng)基為 MS+6-BA 2. Omg 'L"1+NAA 0. Img .!^+GA3L 5mg .Γ1 ；蔗糖、瓊脂濃度和 ρΗ 值分別為 30g · Λ 8g · L-1 禾口 5· 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，其特征在于，包括以下步驟A1，胚狀體不定芽誘導(dǎo)；A2，外植體獲得以小孢子胚狀體誘導(dǎo)出不定芽葉片達1cm時起計算葉片生長日齡，選用生長日齡為25天的葉片作為離體培養(yǎng)的外植體；A3，外植體再生芽的分化誘導(dǎo)；A4，再生芽的生根誘導(dǎo)與移栽。在MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+GA31.5mg·L-1的培養(yǎng)基上，再生芽分化頻率高達80.36％，比未添加GA3增加16.07％，再生芽分化系數(shù)為4.15。該方法在短時間內(nèi)將有限的同一基因型的小孢子DH植株數(shù)量擴大32倍以上，獲得足夠數(shù)量同一基因型的小孢子DH群體，實現(xiàn)當年DH群體農(nóng)藝性狀田間鑒定和次年花期配合力測定。
文檔編號A01G9/10GK102204513SQ20111008909
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者張恩慧, 朱守亮, 李偉, 楊安平, 王朝陽, 程永安, 許忠民, 馬勇斌, 馬英夏, 高海娜 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)