專利名稱：太和貢椿組織培養(yǎng)繁殖種苗技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)，確切的說是用香椿的莖尖分生組織 進行組織培養(yǎng)，葉片組織培養(yǎng)進行快速繁殖，以及組織培養(yǎng)所用的營養(yǎng)物質(zhì)一培養(yǎng)基組成。
背景技術(shù)：
香椿[Toona sinensis (A, Juss.) Rome.]楝科香椿屬，多年生落葉大 喬木，別名紅椿、香椿樹、香椿芽等，古時亦稱熏、柿，原產(chǎn)于我國中部。人們通常采其嫩莖 葉進食，即俗稱的香椿芽。香椿芽是我國傳統(tǒng)的木本蔬菜，芽質(zhì)脆、多汁、無渣、香氣濃郁、營 養(yǎng)豐富，雄居群蔬之冠(李秀信，2001)。我國對香椿大規(guī)模栽培開發(fā)較遲，直到1970年，山 東、安徽等地才相繼大面積栽培，從而開始了香椿菜用林的開發(fā)利用。80年代，山東率先實 行香椿矮化密植栽培，使它成為單一的木本蔬菜，大大提高了香椿的產(chǎn)量。隨著近年來溫 室、大棚等保護地設(shè)施的廣泛利用，香椿芽周年栽培技術(shù)日漸成熟。香椿芽的周年化供應(yīng)， 特別是在春節(jié)、元旦前上市，使栽培的經(jīng)濟效益激增，香椿的生產(chǎn)也由零星栽植發(fā)展到大 規(guī)模集約化生產(chǎn)(吳國良，1999 ；宋元林，2000)。太和貢椿系安徽著名特產(chǎn)。產(chǎn)于太和縣。該縣香椿資源豐富，相傳有千余年 的栽培歷史。產(chǎn)品芽頭鮮嫩、色澤油光、肉質(zhì)肥厚、清脆無渣、香氣濃郁，且含有大量的蛋白 質(zhì)、維生素、碳水化合物以及鐵、鈣、鉀等常量元素，是一種極富特色的食用佳品?！疤拖?椿”計有9個品種，其中以黑油椿、紅油椿、青油椿3個品種為優(yōu)，而黑油椿最佳，為重點發(fā)展 品種，約占總面積的40%。經(jīng)腌制后，原頭不散，香氣如故，食之無渣，經(jīng)久不變質(zhì)。產(chǎn)品芽頭 鮮嫩、色澤油光、肉質(zhì)肥厚、清脆無渣、香氣濃郁，且含有大量的蛋白質(zhì)、維生素、碳水化合物 以及鐵、鈣、鉀等常量元素，經(jīng)腌制后，原頭不散，香氣如故，食之無渣，經(jīng)久不變質(zhì)。暢銷國 內(nèi)，遠銷東南亞一帶。香椿是我國特產(chǎn)，目前國內(nèi)出口產(chǎn)地僅安徽省太和一地。我國的香椿市場是面積 小，產(chǎn)量低，價格高，人民喜食，市場緊缺。在傳統(tǒng)栽培方法中香椿主要以種子繁殖和分株 繁殖，由于香椿的種子常因感病而降低萌發(fā)率，種子采集困難，種源較少。種子播種后代分 離較大。無法保存優(yōu)良種性。分株繁殖速率很低。由于資源有限，通過扦插繁殖埋根等方 法繁殖系數(shù)低很難滿足生產(chǎn)上的需要，其發(fā)展規(guī)模因而受到限制，扦插繁殖方法只適用于 少數(shù)品種。短期內(nèi)無法獲得大量種苗。分株繁殖只適用于零星栽植，不適用于大面積栽培 用苗。因此采用組培技術(shù)，快繁名貴優(yōu)良品種，以適應(yīng)大棚或溫室栽培，實現(xiàn)良種規(guī)?；?產(chǎn)，是解決種苗退化，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，加快香椿應(yīng)用的有效途徑。組織培養(yǎng)方法具有繁殖 速度快，可周年生產(chǎn)，做到生產(chǎn)周年化和標(biāo)準(zhǔn)化。保持優(yōu)良的種性，可有效的解決繁殖作物 種性退化的問題。加速優(yōu)良種苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。組培技術(shù)在多種作物上成功實現(xiàn)工廠化育 苗，如桉樹、香蕉苗、甘蔗苗。采用組培方式繁殖香椿是完全可行的。根據(jù)大量資料統(tǒng)計，關(guān)于微繁香椿菜用良種或優(yōu)良類型的研究最早開始1989 年，楊其光用香椿一年生休眠條，在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3個月，芽長僅2-3cm。同年，覃蘭英以幼年的香椿實生苗莖段為外植體，在 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成功，叢生芽多，生長高度 可達4-4. 5cm。但香椿的組織培養(yǎng)研究象其它一些木本植物一樣，如甜柿(孔祥生，1998)、 核桃(韓碧文等，1986)、歐洲栗(Chevre A.M，1983)、葡萄(Dalai Μ. A. et al，1992)、龍眼 (陳菁瑛等，1997)，在進行組織培養(yǎng)時，其固有的易污染，褐化嚴(yán)重是研究中的障礙，使得其 研究進展比較緩慢，遠不如草本植物的組織培養(yǎng)研究快。康明(1991，1993)也有類似的研 究。芽培養(yǎng)方式是迄今為止應(yīng)用最普遍的培養(yǎng)方法，采用香椿速生期的腋芽莖段為外植體 在MS培養(yǎng)基上萌芽率為53% (張小紅，1999)。王春林(1994)比較了剝?nèi)〉那o尖生長點、 帶1個小葉的新生枝莖尖和休眠頂芽生長點的成苗率，結(jié)果得出休眠頂芽生長點的成苗 率最高，在67%以上。陳彥生則以種芽、半木質(zhì)化的腋芽莖段為外植體在MS培養(yǎng)基上成苗 率達73%，移栽成活率為70%，并提出GA3不僅能使腋芽增殖，而且能有效降低并防止玻璃 化苗產(chǎn)生(陳彥生等，1999)。陳彥生等(1999)用常規(guī)方法對種子進行消毒，即可獲得無菌 苗，繼代培養(yǎng)中，子葉分化出芽，而下胚軸沒有分化。據(jù)報道，目前只有王春林(1994)的研 究中愈傷組織分化出了芽，其分化培養(yǎng)基為BA2.5 mg/kg +NAA2.5mg/kg，但再生率極低，每 塊愈傷組織一般只能產(chǎn)生一個芽。縱觀以上組織培養(yǎng)方面的研究，其所選的外植體多樣化， 接種的時間也各異，且大都是在單一的培養(yǎng)基上進行的試驗。目前為止香椿組培仍處于實 驗室階段，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用仍需要進一步努力。

發(fā)明內(nèi)容
1、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)
從香椿休眠的植株中，選擇生長健壯，無病蟲，具有本品種特征特性的植株，剪取主芽、 腋芽飽滿的20-30cm長枝條，在溫室內(nèi)進行水培催芽。待芽長到3-4cm時，取下，在實驗室內(nèi) 進行清洗處理。去除多余葉片葉柄，剪成2cm長帶芽小段。在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，用 升汞消毒lOmin，，再用無菌水沖洗5-6遍，然后剪成1. Ocm長含有1個腋芽的莖段，在解剖 鏡下挑取0. 2mm大小莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，封口后作好標(biāo)記，在培養(yǎng)室內(nèi)進行誘導(dǎo)培 養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25°C，濕度65-75%，光照強度1000-2000LX，光照時間12-14h/d。經(jīng)過25-28 天的分化培養(yǎng)，莖尖逐漸長大，莖尖基部略帶愈傷組織，此時可以轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。2、增殖培養(yǎng)
將長大的莖尖轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)室內(nèi)通過 20天的增殖培養(yǎng)，莖尖逐漸分化成叢生芽，每個莖尖可以分化出2-3個小芽，此時可進行繼 代繁殖，將芽叢從基部切開，重新接種到繼代增殖培養(yǎng)基中。經(jīng)過一個周期后，又形成2-3 個小芽叢。如此反復(fù)進行。芽叢逐漸增多，繁殖體系基本建立起來。培養(yǎng)溫度25 士。C，濕 度 65-75%，光照強度 1800-2200LX，光照時間 12_14h/d。3、切段繁殖
在培養(yǎng)芽叢的過程中，有的芽叢逐漸脫離叢生狀態(tài)，轉(zhuǎn)向高生長，如果延長培養(yǎng)時 間，不轉(zhuǎn)接，少量可以形成根系，此時應(yīng)將這種苗分離出來，單獨生根、切段繁殖培養(yǎng)。將高 4cm以上的小苗，用剪刀剪切成單莖節(jié)莖段，轉(zhuǎn)入切段繁殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。25天后，又 萌發(fā)成一株小苗。這樣反復(fù)進行，可以大量獲得這樣的小苗。切段繁殖體系建立起來。將 已獲得的組培苗切成帶一個腋芽的小段，大約0. 5-lcm。接種在切段繁殖培養(yǎng)基中，一周后 腋芽萌發(fā)，一個月后苗高7-8cm。香椿腋芽的數(shù)量直接取決于芽數(shù)量的多少，而香椿分枝性差，特別是一年生的幼苗，只有一個主莖沒有側(cè)枝發(fā)育。通過摘心抑制頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽 發(fā)育，對于香椿分枝有一定的促進作用，通過摘心處理主莖數(shù)增加了 5%左右，有的增加到
5-6個芽。3、生根培養(yǎng)
選取生長勢強、健壯的無菌芽苗切成含有1個節(jié)間的小段長1. Ocm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中， 25天左右，有95%以上的植株長出0. 3-3cm長的根，展開葉3_5片，待苗長至30-35天時，即 可煉苗移栽。培養(yǎng)溫度25°C，濕度65-75%，光照強度1800-2200LX，光照時間12_14h/d。試 管苗易根型材料的篩選，易根型材料10天生根；中間型45天生根；難生根型材料，常久不 形成根，生根階段，將快繁獲得的新苗，莖部切除，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中15d便有根長出，根數(shù) 在5-10個左右。觀察表明，在生根過程中，莖的生長并不顯著，這是因為，在生根培養(yǎng)基中。 根系的吸收主要供自身的生長。4、煉苗與移栽
香椿組培苗在長出根以后，就可以出瓶煉苗，待苗高5-7cm時較易成活，練苗前首先揭 開培養(yǎng)瓶的封口膜，然后小心取出小苗，用自來水沖洗凈苗基部的培養(yǎng)基，然后移栽到已滅 過菌的蛭石基質(zhì)中，前期適當(dāng)遮陰并保持濕度在85-95%，逐步降至70%，15天后去掉薄膜， 定期用75%百菌清噴灑殺菌，每7天一次。成活率在95%以上。冬季煉苗時，為防止休眠， 除提高培養(yǎng)溫度外，需要在葉片上噴灑GA320ppm —到兩次。本發(fā)明的培養(yǎng)基組成
由基本培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑附加食用白糖和瓊脂組成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增值培養(yǎng)基和 生根培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基為Ms，基本培養(yǎng)基Ms的配制方法為公知技術(shù)，生長調(diào)節(jié)劑分別由
6-芐氨基腺漂吟(6-BA)、a-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA3)組合而成。1、莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比是
MS+6-BA3. 5mg/l+NAA0. 15mg/l+GA30. lmg/1+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g 以上表達式所表示的意思是在每升培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤(6-BA) 3. 5mg、 a -萘乙酸(NAA) 0. 15mg、赤霉素(GA3)O. lmg、瓊脂6. 5g、白糖30g。本發(fā)明所列表達式均 按此解釋。2、增殖培養(yǎng)基的組成是
M S +BAl. 5 m g /1+NAA0. 08mg/l+GA30. 01mg/l+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g
3生根培養(yǎng)基組成
MS+6-IBA0. lmg/1+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g 本發(fā)明的積極效果是
利用香椿的莖尖進組織培養(yǎng)繁殖改變了常規(guī)繁育方法用香椿種子繁殖后代出現(xiàn)嚴(yán)重 分離的多樣化現(xiàn)象，保持了原品種的優(yōu)良種性，確保了種苗純度。香椿芽產(chǎn)量提高30%以 上，且香味濃郁，無病蟲害發(fā)生?？朔藗鹘y(tǒng)的用種子和扦插繁殖速度慢的弊端，可實現(xiàn)工 廠化育苗、高效率生產(chǎn)；可人為的控制培養(yǎng)生長條件，不受自然條件的影響，取材量小，培 養(yǎng)材料經(jīng)濟，生長周期短，繁殖系數(shù)大，管理方便，利于自動化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。同時本發(fā) 明解決了香椿初代接種時，污染率高、褐變嚴(yán)重的問題。初代接種污染率低于4%。莖尖培養(yǎng) 成苗率高，程序簡單實用，有效解決了香椿試管苗的繁殖周期較慢，生長緩慢的問題。繁殖 系數(shù)達到5. 6倍，快繁生產(chǎn)周期25天。試管中加入GA (赤霉素)可以幼化試管苗，不使試管苗木質(zhì)化，可以獲得高增殖率的芽叢，便于增殖。同時解決了規(guī)模化生產(chǎn)成本偏高的問題， 采用食用白糖代替昂貴的蔗糖，可以有效降低成本。單株成本0. 5元/株，種苗質(zhì)量優(yōu)于種 子和分株繁殖方法。
具體實施例方式本實施例是用太和貢椿中的黑油椿，進行組培快繁的實例。1、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)
從香椿休眠的植株中，選擇生長健壯，無病蟲，具有本品種特征特性的植株，剪取主芽、 腋芽飽滿的20-30cm長枝條，在溫室內(nèi)進行水培催芽。待芽長到3-4cm時，取下，在實驗室內(nèi) 進行清洗處理。去除多余葉片葉柄，剪成2cm長帶芽小段。在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上，用 升汞消毒lOmin，，再用無菌水沖洗5-6遍，然后剪成1. Ocm長含有1個腋芽的莖段，在解剖 鏡下挑取0. 2mm大小莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室內(nèi)進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25°C， 濕度65-75%，光照強度1000-2000LX，光照時間12_14h/d。經(jīng)過25- 天的分化培養(yǎng)，莖尖 逐漸長大，莖尖基部略帶愈傷組織，此時可以轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。2、增殖培養(yǎng)
將長大的莖尖轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)室內(nèi)通過 20天的增殖培養(yǎng)，莖尖逐漸分化成叢生芽，每個莖尖可以分化出2-3個小芽，此時可進行 繼代繁殖，將芽叢從基部切開，重新接種到繼代培養(yǎng)基中。經(jīng)過一個周期后，又形成2-3個 小芽叢。如此反復(fù)進行。芽叢逐漸增多，繁殖體系基本建立起來。培養(yǎng)溫度25 士。C，濕度 65-75%，光照強度 1800-2200LX，光照時間 12_14h/d。3、切段繁殖
在培養(yǎng)芽叢的過程中，有的芽叢逐漸脫離叢生狀態(tài)，轉(zhuǎn)向高生長，如果延長培養(yǎng)時 間，不轉(zhuǎn)接，少量可以形成根系，此時應(yīng)將這種苗分離出來，單獨生根、切段繁殖培養(yǎng)。將高 4cm以上的小苗，用剪刀剪切成單莖節(jié)莖段，轉(zhuǎn)入切段繁殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。25天后，又 萌發(fā)成一株小苗。這樣反復(fù)進行，可以大量獲得這樣的小苗。切段繁殖體系建立起來。將 已獲得的組培苗切成帶一個腋芽的小段，大約0. 5-lcm。接種在切段繁殖培養(yǎng)基中，一周后 腋芽萌發(fā)，一個月后苗高7-8cm。香椿腋芽的數(shù)量直接取決于芽數(shù)量的多少，而香椿分枝性 差，特別是一年生的幼苗，只有一個主莖沒有側(cè)枝發(fā)育。通過摘心抑制頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽 發(fā)育，對于香椿分枝有一定的促進作用，通過摘心處理主莖數(shù)增加了 5%左右，有的增加到 5-6個芽。3、生根培養(yǎng)
選取生長勢強、健壯的無菌芽苗切成含有1個節(jié)間的小段長1. Ocm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中， 25天左右，有95%以上的植株長出0. 3-3cm長的根，展開葉3_5片，待苗長至30-35天時，即 可煉苗移栽。培養(yǎng)溫度25°C，濕度65-75%，光照強度1800-2200LX，光照時間12_14h/d。試 管苗易根型材料的篩選，易根型材料10天生根；中間型45天生根；難生根型材料，常久不 形成根，生根階段，將快繁獲得的新苗，莖部切除，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中15d便有根長出，根數(shù) 在5-10個左右。觀察表明，在生根過程中，莖的生長并不顯著，這是因為，在生根培養(yǎng)基中。 根系的吸收主要供自身的生長。4、煉苗與移栽香椿組培苗在長出根以后，就可以出瓶煉苗，待苗高5_7cm時較易成活，練苗前首先揭 開培養(yǎng)瓶的封口膜，然后小心取出小苗，用自來水沖洗凈苗基部的培養(yǎng)基，然后移栽到已滅 過菌的蛭石基質(zhì)中，前期適當(dāng)遮陰并保持濕度在85-95%，逐步降至70%，15天后去掉薄膜， 定期用75%百菌清噴灑殺菌，每7天一次。成活率在95%以上。冬季煉苗時，為防止休眠， 除提高培養(yǎng)溫度外，需要在葉片上噴灑GA320ppm —到兩次。
權(quán)利要求
1.太和貢椿組織培養(yǎng)繁殖種苗技術(shù)(1)從香椿休眠的植株中，剪取長20-30CH1，主芽、腋芽飽滿的枝條，在溫室內(nèi)進行水培催芽。
2.待芽長到3-4cm時，用升汞消毒lOmin，，再用無菌水沖洗5_6遍，然后剪成1.Ocm長 含有1個腋芽的莖段，在解剖鏡下挑取0. 2mm大小莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中，在培養(yǎng)室內(nèi)進 行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
3.培養(yǎng)溫度25°C，濕度65-75%，光照強度1000-2000LX，光照時間12_14h/d。
4.(2)將高km以上的小苗，用剪刀剪切成單莖節(jié)莖段，轉(zhuǎn)入切段繁殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
5.25天后，又萌發(fā)成一株小苗。
6.通過剪去莖端，摘心抑制頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽發(fā)育。
7.(3)選取無菌芽苗切成含有1個節(jié)間的長1. Ocm小段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度 25°C，濕度 65-75%，光照強度 1800-2200Lx，光照時間 12_14h/d。
8.(4)苗高5-7cm時煉苗，煉苗前首先揭開培養(yǎng)瓶的封口膜，然后小心取出小苗，用自 來水沖洗凈苗基部的培養(yǎng)基，然后移栽到已滅過菌的蛭石基質(zhì)中，前期適當(dāng)遮陰并保持濕 度在85-95%，逐步降至70%，15天后去掉薄膜，定期用75%百菌清噴灑殺菌，每7天一次。
9.成活率在95%以上。
10.冬季煉苗時，為防止休眠，除提高培養(yǎng)溫度外，需要在葉片上噴灑GA320ppm—到兩次。
11.由基本培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑附加食用白糖和瓊脂組成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基 和生根培養(yǎng)基。
12.基本培養(yǎng)基為Ms，基本培養(yǎng)基Ms的配制方法為公知技術(shù)，生長調(diào)節(jié)劑分別由6-芐 氨基腺漂吟(6-BA)、a-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA3)組合而成。
13.1、莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比是MS+6-BA3. 5mg/l+NAA0. 15mg/l+GA30. lmg/1+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g 以上表達式所表示的意思是在每升培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤(6-BA) 3. 5mg、 a -萘乙酸(NAA) 0. 15mg、赤霉素(GA3)O. lmg、瓊脂 6. 5g、白糖 30g。
14.本發(fā)明所列表達式均按此解釋。
15.2、增殖培養(yǎng)基的組成是M S +BAl. 5 m g /1+NAAO. 08mg/l+GA30. 01mg/l+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g3生根培養(yǎng)基組成MS+6-IBA0. lmg/1+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g。
全文摘要
香椿的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)，是從休眠的植株中，剪取當(dāng)年生芽飽滿的枝條，先水培催芽，再經(jīng)殺菌、消毒，挑取0.2mm莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進行分化培養(yǎng)；再利用培養(yǎng)出的植株，放入增殖培養(yǎng)基中進行增殖快繁。本發(fā)明解決了初代接種污染率高、褐變嚴(yán)重的問題，成苗率高，程序簡單實用，有效解決了香椿試管苗的繁殖周期較長的問題。改變了常規(guī)繁育方法用香椿種子繁殖后代出現(xiàn)嚴(yán)重分離的現(xiàn)象，確保了種苗純度?？蓪崿F(xiàn)工廠化育苗、高效率生產(chǎn)。試管中加入GA可以幼化試管苗，不使試管苗木質(zhì)化，可以獲得高增殖率的芽叢，便于增殖。采用食用白糖代替昂貴的蔗糖，可以有效降低成本。單株成本0.5元/株，種苗質(zhì)量優(yōu)于種子和分株繁殖方法。
文檔編號A01H4/00GK102138532SQ20111010416
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者馬宗新 申請人:馬宗新