專利名稱：一種紫花苜蓿分子聚合育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種紫花苜蓿分子聚合育種方法。
背景技術(shù)：
植物分子育種是指把供體植物帶目的性狀的遺傳信息DNA分子或其中的目的基 因分離提取出來，導(dǎo)入待改良受體細(xì)胞中(受精卵、種胚細(xì)胞等)，使之整合、復(fù)制、表達(dá)和遺 傳，并根據(jù)需要選育出帶有目的性狀的優(yōu)良個體，培育出具有經(jīng)濟價值的新品種。高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆是植物育種所追求的最終目標(biāo)之一，尋找與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆相關(guān) 的功能基因，對育種具有重要意義。近年來，以分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的分子育種技 術(shù)已成為植物育種發(fā)展的重要方向，分子育種正在由目前只能改變單個或少數(shù)遺傳性狀向 系統(tǒng)改良轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的“經(jīng)驗育種”正逐步向定向、高效的“精確育種”轉(zhuǎn)化。控制植物性狀的通常為多基因，因此通過轉(zhuǎn)基因來改變植物性狀，往往需要轉(zhuǎn)多 個基因才能達(dá)到改變植物某個性狀的目的。轉(zhuǎn)多個基因可以通過構(gòu)建多個目的基因的多價 植物表達(dá)載體和多次轉(zhuǎn)基因操作來實現(xiàn)。但是構(gòu)建多價植物表達(dá)載體比較困難，因此要把 多個基因聚合到1個植株上，通常需要進(jìn)行多次轉(zhuǎn)基因操作，但是有些植物如紫花苜蓿獲 得轉(zhuǎn)基因植株的周期比較長，而且每次轉(zhuǎn)基因時由于目的基因插入位點不同而表達(dá)有明顯 差異，更是由于目的基因插入往往會改變原有的遺傳平衡，使得多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株生命力差， 獲得轉(zhuǎn)了多個基因的正常植株的可能性很小。異花授粉植物是以異花授粉為主的一類植物，其中有些自交不孕，如蘋果、梨；有 些自交后代嚴(yán)重退化，如紫花苜蓿、青蒿。因此要把分布于不同植株上的多個基因聚合到 1個植株上，就需要采用植物群體改良方法進(jìn)行多次復(fù)合雜交(混合授粉)與優(yōu)良單株的選 擇，提高群體中目的基因的頻率，從而達(dá)到將多個基因聚合到一起的目的。因此，有必要把植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)與群體改良方法相結(jié)合，形成一種異花授粉植物 分子聚合育種技術(shù)，以大大提高獲得生長正常的轉(zhuǎn)了多個基因植株的可能性，從而提高異 花授粉植物分子聚合育種效率。目前尚無相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種異花授粉植物分子聚合育種方法，特別是一 種紫花苜蓿分子聚合育種方法，該方法能夠提高分子聚合育種效率。本發(fā)明一種紫花苜蓿分子聚合育種方法，包括運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得紫花苜蓿的不 同單株、運用復(fù)合雜交(混合授粉)技術(shù)進(jìn)行1-3代繁育獲得子代種子，以及運用依據(jù)逆境適 應(yīng)性或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株，并 通過混合選擇法培育新品種三個步驟，具體通過以下步驟實現(xiàn)
(1)用常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法將目的基因?qū)胱匣ㄜ俎５牟煌瑔沃?，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因單
株；
(2)運用復(fù)合雜交(混合授粉)技術(shù)進(jìn)行1-3代繁育獲得子代種子將轉(zhuǎn)基因單株種植在一處，開花時混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得1代種子；或 再將1代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得2代種子；或繼 續(xù)將2代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得3代種子；上述 復(fù)合雜交均設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基因植株花粉外竄；
(3 )運用依據(jù)逆境適應(yīng)性或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部 目的基因的優(yōu)良單株，并通過混合選擇法培育新品種對步驟2所得種子進(jìn)行檢測，如果檢 測結(jié)果未見聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株，再返回步驟2，將聚合了比較多目的基因的優(yōu) 良單株再進(jìn)行復(fù)合雜交；最后將聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種 子，即育成了新品系。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明一種紫花苜蓿分子聚合育種方法，通過運用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)獲得紫花苜蓿的不同單株、運用復(fù)合雜交(混合授粉)技術(shù)進(jìn)行1-3代繁育獲得子代種子， 以及運用依據(jù)逆境適應(yīng)性或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部目 的基因的優(yōu)良單株，并通過混合選擇法培育新品種三個步驟，把轉(zhuǎn)基因技術(shù)與群體改良方 法相結(jié)合，進(jìn)行多個目的基因聚合于一體的優(yōu)良品種選育，提高了紫花苜蓿分子聚合育種 效率。本發(fā)明方法還可用于其它異花授粉植物比如青蒿等的育種。
具體實施例方式以下實施例的紫花苜蓿分子聚合育種方法，包括運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得紫花苜蓿的 不同單株、運用復(fù)合雜交(混合授粉)技術(shù)進(jìn)行1-3代繁育獲得子代種子，以及運用依據(jù)逆 境適應(yīng)性或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部目的基因的優(yōu)良單 株，并通過混合選擇法培育新品種三個步驟，其中涉及到的基因，MDH為蘋果酸脫氫酶基因， PEPC為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，CS為檸檬酸合成酶基因，A-T為蘋果酸通道蛋白基 因，這些基因的序列及其克隆方法均已公開報道，為公知技術(shù)。實施例1:
(1)將MDH、PEPC基因分別導(dǎo)入紫花苜蓿2個不同單株，獲得轉(zhuǎn)MDH基因植株和轉(zhuǎn)PEPC 基因植株；
(2)將轉(zhuǎn)MDH基因植株和轉(zhuǎn)PEPC基因植株種植在一處，開花時混合授粉，種子成熟后混 合収種，獲得1代種子；開花授粉時設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基因植株花粉外竄；
(3)將獲得的種子種植于酸性土壤中，選擇得到生長性狀表現(xiàn)好的植株8個，并用分子 技術(shù)檢測這8株，最后獲得聚合了 MDH、PEPC基因的優(yōu)良單株5個；將聚合了全部目的基因 的5個優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種子，即育成了新品系。實施例2:
(1)將MDH、PEPC、CS基因分別導(dǎo)入紫花苜蓿3個不同單株，獲得轉(zhuǎn)MDH基因植株、轉(zhuǎn) PEPC基因植株和轉(zhuǎn)CS基因植株；
(2)將轉(zhuǎn)MDH基因植株、轉(zhuǎn)PEPC基因植株和轉(zhuǎn)CS基因植株種植在一處，開花時混合授 粉，種子成熟后混合収種，獲得1代種子；又將1代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉， 種子成熟后混合収種，獲得2代種子；再繼續(xù)將2代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉， 種子成熟后混合収種，獲得3代種子；上述復(fù)合雜交均設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基 因植株花粉外竄；(3)將獲得的3代種子種植于酸性土壤中，選擇得到生長性狀表現(xiàn)好的植株13個，并用 分子技術(shù)檢測這13株，最后獲得聚合了 MDH、PEPC、CS基因的優(yōu)良單株10個；將聚合了全 部目的基因的10個優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種子，即育成了新品系。實施例3:
(1)將MDH、PEPC、A-T基因分別導(dǎo)入紫花苜蓿3個不同單株，獲得轉(zhuǎn)MDH基因植株、轉(zhuǎn) PEPC基因植株和轉(zhuǎn)A-T基因植株；
(2)將轉(zhuǎn)MDH基因植株、轉(zhuǎn)PEPC基因植株和轉(zhuǎn)A-T基因植株種植在一處，開花時混合授 粉，種子成熟后混合収種，獲得1代種子；又將1代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉， 種子成熟后混合収種，獲得2代種子；上述復(fù)合雜交均設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基 因植株花粉外竄；
(3)將獲得的2代種子種植于酸性土壤中，選擇得到生長性狀表現(xiàn)好的植株20個，并 用分子技術(shù)檢測這20株，結(jié)果沒有獲得聚合了 MDH、PEPC、A-T基因的優(yōu)良單株，但獲得聚 合了 2個不同基因的植株12個；再將這12個植株種植在一處，開花時混合授粉，種子成熟 后混合収種，獲得1代種子；又將1代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混 合収種，獲得2代種子；上述復(fù)合雜交均設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基因植株花粉外 竄；將獲得的2代種子種植于酸性土壤中，選擇得到生長性狀表現(xiàn)好的植株15個，并用分子 技術(shù)檢測這15株，最后獲得聚合了 MDH、PEPC、A-T基因的優(yōu)良單株10個；將聚合了全部目 的基因的10個優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種子，即育成了新品系。實施例4:
(1)將A-T基因分別導(dǎo)入紫花苜蓿2個不同單株，獲得轉(zhuǎn)A-T基因的2個植株； (2MfRA-T基因的2個植株種植在一處，開花時混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得 1代種子；開花前設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基因植株花粉外竄；
(3)將獲得的1代種子種植于酸性土壤中，選擇得到生長性狀表現(xiàn)好的植株20個，并用 分子技術(shù)檢測這20株，最后獲得聚合了 A-T基因的優(yōu)良單株18個；將聚合了全部目的基因 的18個優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種子，即育成了新品系。實施例5:
(1)將A-T基因分別導(dǎo)入紫花苜蓿3個不同單株，獲得轉(zhuǎn)A-T基因的2個植株；
(2)將轉(zhuǎn)A-T基因的2個植株種植在一處，開花時混合授粉，種子成熟后混合収種，獲 得1代種子；又將1代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得2 代種子；再將2代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得3代種 子；上述復(fù)合雜交均設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基因植株花粉外竄；
(3)將獲得的3代種子種植于酸性土壤中，選擇得到生長性狀表現(xiàn)好的植株12個，并用 分子技術(shù)檢測這12株，結(jié)果獲得聚合了 A-T基因的優(yōu)良單株10個；將聚合了全部目的基因 的10個優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種子，即育成了新品系。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較 佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技 術(shù)方案進(jìn)行參數(shù)范圍內(nèi)的修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其 均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種紫花苜蓿分子聚合育種方法，其特征在于，包括運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得紫花苜蓿 的不同單株、運用復(fù)合雜交技術(shù)進(jìn)行1-3代繁育獲得子代種子，以及運用依據(jù)逆境適應(yīng)性 或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株，并通過 混合選擇法培育新品種三個步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體通過以下步驟實現(xiàn)(1)用常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法將目的基因?qū)胱匣ㄜ俎５牟煌瑔沃辏@得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因單株；(2)運用復(fù)合雜交技術(shù)進(jìn)行1-3代繁育獲得子代種子將轉(zhuǎn)基因單株種植在一處，開花時混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得1代種子；或 再將1代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得2代種子；或繼 續(xù)將2代種子種植在一處，開花時同樣混合授粉，種子成熟后混合収種，獲得3代種子；上述 復(fù)合雜交均設(shè)置隔離，以免外來花粉混雜和轉(zhuǎn)基因植株花粉外竄；(3)運用依據(jù)逆境適應(yīng)性或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部 目的基因的優(yōu)良單株，并通過混合選擇法培育新品種對步驟2所得種子進(jìn)行檢測，如果檢 測結(jié)果未見聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株，再返回步驟2，將聚合了比較多目的基因的優(yōu) 良單株再進(jìn)行復(fù)合雜交；最后將聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株混合授粉，成熟后混収種 子，即育成了新品系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫花苜蓿分子聚合育種方法，包括運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株、運用復(fù)合雜交技術(shù)進(jìn)行種子繁育，以及運用依據(jù)逆境適應(yīng)性或性狀表型的傳統(tǒng)選擇方法及分子檢測技術(shù)選擇聚合了全部目的基因的優(yōu)良單株，并通過混合選擇法培育新品種三個步驟，該方法把轉(zhuǎn)基因技術(shù)與群體改良方法相結(jié)合，有利于多個目的基因聚合在一體的優(yōu)良品種選育，可提高紫花苜蓿分子聚合育種效率。
文檔編號A01K1/02GK102144570SQ20111010601
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者劉盧生, 李佺, 玉永雄, 甘智才, 胡艷, 馬雪梅 申請人:西南大學(xué), 重慶市茂澤科技有限公司