專利名稱：EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及EBFl基因mRNA的3’UTR在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物激素乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由兩個(gè)F-Box類蛋白EBF1/EBF2所介導(dǎo)的泛素化降解調(diào)控。目前關(guān)于EBF1/EBF2基因功能的研究主要進(jìn)展是被受體感知到的乙烯信號(hào)能夠負(fù)調(diào)EBF1/EBF2蛋白積累(Plant Cell.2010Jul ；22(7) :2384-401.)，從而使其蛋白量減少。但是對(duì)于這兩個(gè)基因的mRNA的研究還沒有人進(jìn)行深入的研究，只是2004年曾有人報(bào)道(Mol Cell. 2004 Jul 23 ； 15 (2) 173-83.)這兩個(gè)基因的mRNA受到外切核酸酶EIN5的負(fù)調(diào)。EBFLEBF2基因成熟mRNA的3，UTR分別為695nt和590nt，至今為止還不清楚這么長的序列在生物體內(nèi)是否具有某種特定的生物學(xué)功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用，其是將編碼EBFl 3’ UTR的核苷酸序列與報(bào)告基因GFP編碼序列重組得到一個(gè)結(jié)構(gòu)為 GFP-3'UTR的重組基因然后整合至宿主基因組中，并隨宿主基因組進(jìn)行表達(dá)。其中，所述宿主為植物，優(yōu)選為擬南芥等。前述編碼EBFl 3，UTR的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有EBFl 3’ UTR同等功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供EBFl基因mRNA的3’UTR在獲得乙烯不敏感型轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用以及EBFl基因mRNA的3’ UTR在抑制轉(zhuǎn)基因植物中EIN3蛋白表達(dá)水平中的應(yīng)用。過量表達(dá)EBFl基因3’ UTR的擬南芥植物體內(nèi)EIN3蛋白水平顯著下調(diào)，具有明顯的乙烯不敏感表型。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 EBFl基因的3，UTR具有負(fù)調(diào)植物基因表達(dá)的功能，將3，UTR 用于負(fù)調(diào)植物基因表達(dá)，具有以下優(yōu)點(diǎn)3’ UTR為非編碼序列其序列較短易于克隆，且植物過量表達(dá)3’ UTR后可產(chǎn)生與過量表達(dá)EBFl基因編碼序列相同的生物學(xué)效應(yīng)。


圖1為載體pEGAD的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為將EBFl 3，UTR與載體pEGAD連接后的重組基因結(jié)構(gòu)。圖3分別顯示了轉(zhuǎn)基因35S :GFP-EBF1U/Col-0以及轉(zhuǎn)基因35S :GFP/Col_0擬南芥幼苗的三個(gè)部位，子葉、下胚軸、根尖的熒光強(qiáng)度。
圖4為轉(zhuǎn)基因植物mRNA及蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果。圖5為轉(zhuǎn)基因植物的三重反應(yīng)。圖6為轉(zhuǎn)基因竹中EIN3蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的試劑和材料均為市售商品。實(shí)施例1 EBFl mRNA 3，UTR的功能研究構(gòu)建一個(gè)新的重組基因。按照5，一 3，方向從EBFl終止密碼子TGA開始選取了長度為643nt的一段序列，以擬南芥基因組DNA為模板擴(kuò)增目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No=I所示，擴(kuò)增過程所使用的PCR反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將編碼EBF13’UTR的核苷酸序列整合至宿主基因組中，隨宿主基因組進(jìn)行表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將編碼EBF13’UTR的核苷酸序列整合至宿主基因組中目的基因的3’端。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述編碼EBF13’UTR的核苷酸序列如 SEQ ID No 1 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述宿主為植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述宿主為擬南芥。
7.EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
8.EBFl基因mRNA的3，UTR在獲得乙烯不敏感型轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9.EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制轉(zhuǎn)基因植物中EIN3蛋白表達(dá)水平中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用，其是將編碼EBF1 3’UTR的核苷酸序列與報(bào)告基因GFP重組后通過轉(zhuǎn)基因整合至宿主基因組中，隨宿主基因組進(jìn)行表達(dá)，帶有3’UTR的GFP與單獨(dú)的GFP相比起蛋白產(chǎn)物明顯減少。本發(fā)明還提供EBF1基因mRNA的3’UTR在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了EBF1基因的3’UTR具有負(fù)調(diào)植物基因表達(dá)的作用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102286482SQ20111011010
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者安豐英, 李文陽, 李紅姜, 江志強(qiáng), 郁暉, 郭紅衛(wèi) 申請(qǐng)人:北京大學(xué)