專利名稱：水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
分蘗是多數(shù)禾本科植物的重要形態(tài)特征。禾本科作物的莖桿每節(jié)都生有芽，芽可發(fā)育形成枝條，枝條基部形成不定根，這類枝條就是分蘗。分蘗的形態(tài)特征與主莖基本相同，分蘗可以與主莖分離而單獨存活。水稻莖桿第一節(jié)間有分生組織區(qū)，該分生組織區(qū)的細胞進行分裂可以使節(jié)間伸長，調(diào)節(jié)分蘗節(jié)位，使分蘗在不同插植深度的土壤申萌芽。稻秧生長至4個葉片時進入分蘗期。由于水稻的大部分營養(yǎng)器官如葉片、分蘗和根系都是在這個時期形成的，因此分蘗期是水稻生長發(fā)育過程中的重要時期。穗數(shù)是水稻產(chǎn)量的重要決定因素，而單株分蘗數(shù)又是決定穗數(shù)的重要因素，過低或過高的分蘗數(shù)都會影響產(chǎn)量。因此， 分蘗力是重要的農(nóng)藝性狀，是影響水稻產(chǎn)量重要因素。過去對分蘗的研究主要集中在形態(tài)觀察和栽培生理方面。水稻栽培生理學的研究對分蘗數(shù)量與環(huán)境條件的關(guān)系有較好的闡明，包括溫度、光照、水分、耕作和礦質(zhì)營養(yǎng)等因素對分蘗生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，尤其是氮素營養(yǎng)水平和溫度對分蘗的影響。從遺傳學的角度一般認為分蘗受多基因聯(lián)合調(diào)節(jié)。目前的研究顯示有多個遺傳因子參與了水稻的分蘗調(diào)控，這其中包括MOCl，LAX, OsTBl和MAX/RMS/D通路中的一序列調(diào)節(jié)因子。其中MOCl調(diào)控分蘗芽的發(fā)生并一直促進分蘗芽的生長，而LAX， OsTBl和MAX/RMS/D通路中的調(diào)節(jié)因子均調(diào)節(jié)發(fā)生后的分蘗芽的生長。水稻(Oryza sativa)突變體，是單基因隱性突變，符合孟德爾方式遺傳規(guī)律。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的水稻分蘗枝相關(guān)的蛋白質(zhì)，名稱為TE，來源于水稻(Oryza sativa)， 是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物的分蘗數(shù)相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由個523個氨基酸殘基組成。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物的分蘗數(shù)相關(guān)蛋白的 DNA分子；
(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物的分蘗數(shù)相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在6 X SSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述序列表中的序列1由1572個核苷酸組成。含有所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。所述重組載體為如下1)或2)1)是將所述基因插入pCambial305. 1載體的SmaI識別位點處得到的重組載體；2)是將所述基因插入pCUbil390載體的KpnI和SpeI識別位點間得到的重組載體。擴增所述基因全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，是將所述基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的單株分蘗數(shù)小于所述目的植物。所述基因通過所述重組載體導入所述目的植物中。所述目的植物為雙子葉或單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻，所述水稻為突變體cl。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明克隆得到TE基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過量表達TE基因， 獲得分蘗明顯減少的轉(zhuǎn)基因水稻，分蘗數(shù)是突變體的野生型姊妹系的1/4-1/2，證明TE基因能夠有效減少水稻分蘗數(shù)，應用TE基因調(diào)整植物株型以及形成合理的植物群體結(jié)構(gòu)成為可能，能夠提高單位面積耕地內(nèi)農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖1為功能互補實驗Tl代轉(zhuǎn)基因水稻的表型圖2為過量表達TE轉(zhuǎn)基因水稻的分蘗數(shù)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。yjCfS (Oryza sativa ssp. Japonica)曰本日青、7_Κ稻(Oryza sativa)突變體 cl、突變體cl的野生型姊妹系和雙元表達載體pCubil390均在如下文章中記載水稻葉扭曲基因CL的精細定位與“培矮64S/93-11”染色體片段置換系分子標記的完善，作者公杰，畢業(yè) 2008年，發(fā)表2009年6月，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。根癌農(nóng)桿菌 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)記載在 NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Hood, Elizabeth E ；Gelvin, Stanton B ；Melchers, Leo S ；Hoekema, Andre. Transgenic Research,2 (4) p. 208-218-218(1993).公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得。
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水稻材料的栽培條件將水稻種子用水浸泡3天，然后播種在苗床上。4葉期的水稻幼苗移栽到水田中，分單株插秧。實施例1、TE基因的獲得提取水稻(Oryza sativa ssp. Japonica)日本晴的基因組DNA，以一對引物 PGR-3F和pGR-4R進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物送去測序，結(jié)果為該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸，該PCR產(chǎn)物的基因為TE，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列1 ；該基因編碼的蛋白命名為TE，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。pGR-3F(5，端加磷酸基團):5，-TGAATCTTACTCTTCTATATATTGCCTCAC-3，pGR-4R(5，端加磷酸基團)5，-GGATCCCATAACCTTATTTATTTTTCTAGT-3，也可人工合成序列1，以pGR-3F和pGR_4R為引物，擴增得到PCR產(chǎn)物。實施例2、轉(zhuǎn)TE水稻互補了突變體的突變表型1、重組表達載體的獲得用SmaI酶切雙元表達載體pCambia1305. 1 (此載體為研究用途研究人員均可向 CambiaLabs 實驗室免費索取。CambiaLabs, G301, 2George Street Brisbane, QLD 4000, Australia。)，再去磷酸化，得到不含5 ‘磷酸基團的平末端的pCambial305. 1載體骨架； 將用引物PGR-3F和pGR-4R擴增得到的PCR產(chǎn)物(由實施例1得到的PCR產(chǎn)物)純化，純化產(chǎn)物與上述獲得的pCambial305. 1載體骨架連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將包含序列表中的序列1插入 pCambial305. 1的SmaI識別位點處得到的載體，該質(zhì)粒命名為pGTE。2、轉(zhuǎn)TE水稻的獲得將上述獲得的質(zhì)粒pGTE通過熱激的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105 (Agrobacteriumtumefaciens EHA105)中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒,送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為PGTE，將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為EHA105/pGTE。將水稻(Oryza sativa)突變體cl (分蘗增加，旗葉嚴重扭曲，株高變矮。)的成熟種子脫殼滅菌，接種到誘導愈傷的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3周后，從盾片處生長出愈傷組織，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷，用作轉(zhuǎn)化的受體。將上述獲得的EHA105/pGTE侵染胚性愈傷，在黑暗處25 V培養(yǎng)3天后，在含有 50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，幾天后移栽到水田，得到Ttl代轉(zhuǎn)TE水稻(te)。以 Hyg-F(5‘ -AAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATT-3‘)和 Hyg-R(5‘ -GAAGTGCTTGACA TTGGGGAGTTTA-3 ‘)為引物，對Ttl代轉(zhuǎn)TE水稻(te)進行PCR擴增，得到475bp大小的目的片段，說明轉(zhuǎn)入了 TE基因，共得到5株陽性Ttl代轉(zhuǎn)TE水稻(te)。從陽性Ttl代轉(zhuǎn)TE水稻(te)上收獲種子，播種，得到T1代轉(zhuǎn)TE水稻(te)。T1代轉(zhuǎn)TE水稻(te)、cl突變體的野生型姊妹系和突變體cl比較，觀察表型，結(jié)果如圖1所示，其中，PGTE為T1代轉(zhuǎn)TE水稻(te) ；WT為cl突變體的野生型姊妹系；te為突變體cl，從圖中看出，T1代轉(zhuǎn)TE水稻(te)將突變體過多的分蘗恢復至WT水平，將變矮的株高和扭曲的旗葉等表型恢復到WT水平。實施例3、TE過表達水稻減少了受體材料突變體的分蘗1、重組表達載體的獲得
用KpnI和SpeI酶切雙元表達載體pCubil390，得到不含KpnI和SpeI之間片段的 pCubil390載體骨架；以水稻(Oryza sativa ssp. Japonica)日本晴為模板，用引物RT-2L F(5’-ATCCCCAAATCTCTCGCCCCCACCCA-3’) and RT-2LR(5’-TCGCTCCTACAAAGCCAATGAATAAA-3’)擴增得到的PCR產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物用KpnI和SpeI酶切，酶切產(chǎn)物純化后與上述獲得的pCubil390載體骨架連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列1插入pCubial390的KpnI和SpeI間得到的載體，該質(zhì)粒命名為pUbi: :TE。2、TE過表達水稻的獲得將pUbi::TE通過熱激的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105 (Agrebacteriumtumefaciens EHA105)中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒,送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pUbi: :TE，將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為EHA105/pUbi: :TE。將水稻(Oryza sativa)的突變體cl的成熟種子脫殼滅菌，接種到誘導愈傷的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3周后，從盾片處生長出愈傷組織，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷，用作轉(zhuǎn)化的受體。將上述獲得的EHA105/pUbi: :TE侵染胚性愈傷，在黑暗處25°C培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，幾天后移栽到水田，得到Ttl代TE過表達水稻。以 Pcubi-f(5' -TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3 ‘)和 RT-2LR 為引物，對 Ttl 代 TE 過表達水稻進行PCR擴增，得到2100bp目的片段，說明轉(zhuǎn)入了 TE基因，共得到16株陽性Ttl 代TE過表達水稻。采用同樣的方法，將空載體pCubil390轉(zhuǎn)入水稻(Oryza sativa)的突變體cl中， 得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體水稻，提取基因組DNA，以Pcubi-f和RT-2LR為引物，進行PCR擴增，沒有得到目的片段，說明轉(zhuǎn)入的為空載體。3、TE過表達水稻的功能研究選取編號為17、22、65的陽性T2代TE過表達水稻株系于五月份栽種在水田里， 在自然條件下生長，以突變體cl的野生型姊妹系(WT)和水稻(Oryza sativa)的突變體 cl (te)、T1代轉(zhuǎn)空載體水稻為對照，每個株系選取15株，結(jié)果取平均值。統(tǒng)計單株的分蘗數(shù)，結(jié)果如圖2所示，從圖中看出，編號為17的T2代轉(zhuǎn)TE水稻(0E17)單株分蘗數(shù)為3. 7 ；編號為22的T2代轉(zhuǎn)TE水稻(0E22)單株分蘗數(shù)為6. 0 ；編號為65的T2代轉(zhuǎn)TE水稻(0E65)單株分蘗數(shù)為6. 5 ；WT單株分蘗數(shù)為12. 5 ；te單株分蘗數(shù)為31. 9 ；T2代轉(zhuǎn)空載體水稻和te的結(jié)果無顯著差異。從圖中可以看出，與突變體的野生型姊妹系(WT)和水稻(Oryza sativa)的突變體cl (te)相比，T2代TE過表達水稻的單株分蘗數(shù)明顯減少，僅為突變體的野生型姊妹系的 1/4-1/2(水稻的分蘗太多的話，部分不抽穗的分蘗會浪費營養(yǎng)，減少其他能抽穗的分蘗的稻穗的營養(yǎng)供給，從而影響稻穗的產(chǎn)量和品質(zhì)。TE基因可在控制水稻產(chǎn)生適宜的分蘗上有作用。)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物的分蘗數(shù)相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物的分蘗數(shù)相關(guān)蛋白的DNA 分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物的分蘗數(shù)相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于 所述重組載體為如下1)或2):1)是將權(quán)利要求2或3所述基因插入pCambial305.1載體的SmaI識別位點處得到的重組載體；2)是將權(quán)利要求2或3所述基因插入pCUbil390載體的KpnI和SpeI識別位點問得到的重組載體。
6.擴增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的單株分蘗數(shù)小于所述目的植物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求4或 5所述重組載體導入所述目的植物中。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉或單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻分蘗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱為TE，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物的分蘗數(shù)相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明克隆得到TE基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過量表達TE基因，獲得分蘗明顯減少的轉(zhuǎn)基因水稻，分蘗數(shù)是野生型水稻的1/4-1/2，證明TE基因能夠有效減少水稻分蘗數(shù)，應用TE基因調(diào)整植物株型以及形成合理的植物群體結(jié)構(gòu)成為可能，能夠提高單位面積耕地內(nèi)農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號A01H5/00GK102180956SQ201110112498
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者萬建民, 公杰, 吳赴清, 張欣, 林啟冰, 江鈴, 王丹, 秦瑞珍, 程治軍, 董慧, 郭秀萍, 顧溯海 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所