專利名稱：一種羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea L. var. acephala)又名葉牡丹，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個變種，為2年生草本植物，其葉片形態(tài)美觀、色彩多變，整個植株形如牡丹花， 觀賞價值極高。近幾年，我國多從美國、日本、荷蘭等地引進羽衣甘藍(lán)，因羽衣甘藍(lán)含有大量的維生素A、C、&及多種礦物質(zhì)，特別是鈣、鐵、鉀含量很高，其營養(yǎng)價值遠(yuǎn)高于普通甘藍(lán)，多作特菜栽培。由于有些羽衣甘藍(lán)品種葉色鮮艷美麗，紅、黃、綠相間，皺縮特殊，形態(tài)各異，可用來裝飾宴會的餐桌，布置城市公園和大型花壇，美化中心廣場和商業(yè)街面，因此，又被廣泛用于觀葉栽培。羽衣甘藍(lán)原產(chǎn)地中海和小亞西亞一帶，英國、荷蘭、德國和美國種植較多。我國近幾年也開始引種栽培和開發(fā)研究，目前種子基本依靠進口，價格昂貴，成本高，究其原因是因為我們自己的羽衣甘藍(lán)育種資源少，育不出好的品種。傳統(tǒng)的育種方法是通過引進國外優(yōu)良品種進行自交分離，周期長，需要耗費大量的人力物力，但還不一定能選育到好的品種。因此迫切需要創(chuàng)新育種手段，把市場上應(yīng)用的品種快速純合，獲得育種資源。小孢子培養(yǎng)方法可以在1 2年內(nèi)快速獲得雙單倍體純系，比傳統(tǒng)的方法縮短了 3 4年的時間，從而大大縮短了育種進程，提高了育種的效率。中國專利ZL2006101U997. 5中公開了一種獲得羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)方法包括以下步驟1)將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，至終濃度為5 X IO4 5 X IO5個/ML，接著在30 35°C、黑暗條件下高溫脅迫處理M 72小時后，再轉(zhuǎn)入M 26°C、黑暗條件下誘導(dǎo)胚狀體；幻待魚雷期至子葉期胚狀體形成后，將胚狀體先在24 ^°C、1500 2500LUX、14 18小時光照/天條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 10天， 再將胚狀體接種于分化培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)；幻長出莖、葉后，將植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在24 ^°C、1500 2500LUX、14 18小時光照/天條件下進行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘藍(lán)再生植株。自1982年Lichter首次報道油菜游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株以來，蕓薹屬作物在出胚率、出胚量、胚培養(yǎng)及再生植株方面都獲得了很大的成功。羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)的報道首見于1989年(Lichter和Takahata)，隨后Duijs等人(1992)、湯清林等(2000)、 姜鳳英和馮輝O005)等人也做了不少研究，但羽衣甘藍(lán)出胚率不高的問題依然沒有解決。 有關(guān)蕓薹屬游離小孢子培養(yǎng)的大量研究表明，供體植株的基因型對小孢子胚胎發(fā)生的影響極為重要，它不僅影響產(chǎn)胚率，而且也影響胚的質(zhì)量(Chuong et al.，1988)，抑制了小孢子培養(yǎng)育種技術(shù)的應(yīng)用。因此，尋找一種提高羽衣甘藍(lán)出胚率的方法具有重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，采用高出胚率的油菜品種和難出胚的羽衣甘藍(lán)品種混合培養(yǎng)，得到難出胚的羽衣甘藍(lán)小孢子苗，提高羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)出胚率。一種羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)取羽衣甘藍(lán)的花序和油菜的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；直接或?qū)⒒ㄐ蛘T導(dǎo)后取花蕾，得到油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾；2)將滅菌后的油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀，依次加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；3)將小孢子懸浮液在黑暗條件下于32°C 33°C恒溫?zé)峒ぬ幚?天 3天，后取出在黑暗條件下于25士2°C培養(yǎng)20天 30天，得到子葉期胚狀體；4)將子葉期胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至形成胚狀體；將胚狀體接種到胚狀體分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接種至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將根生長健壯的苗經(jīng)煉苗和移栽，得到再生植株，鑒定。為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選步驟1)中，所述的花蕾選用花序上花瓣和花藥長度比為0.6 1. 1、單核晚期至雙核早期的花蕾，更利于小孢子的培養(yǎng)。誘導(dǎo)后的花蕾也更利于小孢子的培養(yǎng)，所述的誘導(dǎo)的條件為在；TC 5°C誘導(dǎo) 0. 1小時 48小時。所述的油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾中油菜花蕾與羽衣甘藍(lán)花蕾的用量一般不做特別的限定，為了達(dá)到更好的效果，進一步優(yōu)選油菜花蕾的數(shù)量略大于羽衣甘藍(lán)花蕾的數(shù)量。步驟2、中，所述的滅菌采用本領(lǐng)域常規(guī)的滅菌方法，可采用滅菌液將油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾滅菌15 20分鐘，清洗干凈后得到滅菌后的油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾。一般用于外植體滅菌的滅菌液有升汞溶液、次氯酸鈉溶液等，由于升汞溶液有很大的毒性，且污染環(huán)境，對人體有害；而次氯酸鈉滅菌的效果較好，沒有毒害，所述的滅菌液優(yōu)選次氯酸鈉溶液。以IL次氯酸鈉溶液計，組成為質(zhì)量百分濃度為5. 6%的次氯酸鈉水溶液56ml、無水乙醇100ml、洗潔精8滴 10滴和余量的無菌水。所述的NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基為由NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g組成，pH 6. 0 6. 2 ；高溫高濕滅菌，備用。所述的活性炭混合液的組成為NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g 5g和Ig活性炭； 高溫滅菌，備用。所述的NLN 液體培養(yǎng)基，以 IL 計，組成為=KNO3 125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，維生素 Bl (VB1) 0. 5mg, 維生素 B6 (VB6) 0. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H20 27. 8mg,肌醇lOOmg，甘氨酸ang，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，維生素B55mg，絲氨酸 IOOmg和余量的無菌水。所述的沉淀可以重復(fù)以下操作1 2次在沉淀中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液。重復(fù)操作后所得的沉淀中依次加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。所述的小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為0. 8X IO5個/mL 1. 2X IO5個/mL。所述的過濾可采用45 μ m無菌濾網(wǎng)。所述的離心的條件一般為600rpm/min 900rpm/min離心3min 5min。步驟3)中，在黑暗條件下于25士2°C培養(yǎng)20天 30天的具體步驟為在黑暗條件下于25士2°C培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時，再在黑暗條件下于25士2°C條件下?lián)u動培養(yǎng)；搖動培養(yǎng)相對于不搖動培養(yǎng)的小孢子胚生長的較健壯。步驟4)中，所述的培養(yǎng)條件為每天12小時 18小時光照和20°C 下培養(yǎng)；進一步優(yōu)選為每天16小時光照和25°C下培養(yǎng)。一般培養(yǎng)時間為2周 3周。所述的胚狀體較大時可切成多塊后接種。所述的胚狀體分化培養(yǎng)基為由MS培養(yǎng)基1L、蔗糖20g和瓊脂IOg 12g組成， pH5. 8 6. 1 ；高溫高濕滅菌。步驟5)中，所述的生根培養(yǎng)基為由MS培養(yǎng)基1L、糖20g 30g和瓊脂6g 7g 組成，pH5. 8 6. 0 ；所述的糖為蔗糖或白糖；高溫高濕滅菌。所述的MS 培養(yǎng)基，以 IL 計，組成為=NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, CaCl2 · 2H20 440mg, KH2PO4 170mg，MgSO4 ·7Η20 370mg, FeSO4 ·7Η2027. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 16. 9mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KI 0. 83mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸 2mg,煙酸 0. 5mg,維生素 BIO. lmg,維生素B60. 5mg和余量的無菌水。移栽時用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量百分濃度為75% 80%的百菌清 (如市售的百菌清可濕性粉劑)800 1000倍(稀釋的倍數(shù))液浸泡組培苗根部1 2分鐘后植于羽衣甘藍(lán)育苗專用基質(zhì)穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)15 20天后移栽。 通過百菌清來殺菌，并給予一定的緩沖環(huán)境，以更好的使在生長環(huán)境較好的實驗室里生長的組培苗適應(yīng)較嚴(yán)酷的自然環(huán)境。
所述的鑒定可采用本領(lǐng)域常用的倍性鑒定方法，如取再生植株的嫩葉檢測各再生植株倍性，并從再生植株群體中鑒定出油菜再生苗和羽衣甘藍(lán)再生苗?？捎妹绹鳥D公司的 BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進行倍性分析和再生植株種類的鑒定。本發(fā)明的有益效果為1、本發(fā)明針對現(xiàn)有羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)出胚率低，尤其是非常難以出胚的品種， 提供了一種提高出胚率的方法，采用易出胚的油菜品種和難出胚的羽衣甘藍(lán)花蕾混合培養(yǎng)的方法，以易出胚的材料帶動難出胚的材料出胚，提高羽衣甘藍(lán)的出胚率。本發(fā)明方法混合培養(yǎng)羽衣甘藍(lán)出胚率最高達(dá)104個/蕾，而對照羽衣甘藍(lán)出胚率最高僅為0. 7個/蕾，解決了羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生頻率較低的問題，提高了小孢子培養(yǎng)技術(shù)的利用效率。2、經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，在相同的條件下混合培養(yǎng)最后能得到13 株羽衣甘藍(lán)小孢子苗，而羽衣甘藍(lán)花蕾單獨培養(yǎng)的對照株數(shù)為0個。
具體實施例方式實施例1
培養(yǎng)方法按如下步驟進行。(1)培養(yǎng)基配制包括小孢子不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基，其組分與各組分在每升培養(yǎng)基中所含的重量為表INLN和MS培養(yǎng)基成分表
權(quán)利要求
1.一種羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)取羽衣甘藍(lán)的花序和油菜的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；直接或?qū)⒒ㄐ蛘T導(dǎo)后取花蕾，得到油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾；2)將滅菌后的油菜和羽衣甘藍(lán)混合花蕾中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀，依次加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；3)將小孢子懸浮液在黑暗條件下于32°C 33°C恒溫?zé)峒ぬ幚?天 3天，后取出在黑暗條件下于25士2°C培養(yǎng)20天 30天，得到子葉期胚狀體；4)將子葉期胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至形成胚狀體；將胚狀體接種到胚狀體分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接種至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將根生長健壯的苗經(jīng)煉苗和移栽，得到再生植株，鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1) 中，所述的花蕾為花序上花瓣和花藥長度比為0. 6 1. 1、單核晚期至雙核早期的花蕾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1) 中，所述的誘導(dǎo)的條件為在3°C 5°C誘導(dǎo)0. 1小時 48小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2) 中，所述的NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基為由NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g組成，pH 6. 0 6. 2 ；所述的活性炭混合液的組成為NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g-5g和Ig活性炭；所述的NLN液體培養(yǎng)基，以IL計，組成為KN03125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4125mg, H3B036. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，維生素 BIO. 5mg，維生素 B60. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸ang，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，維生素B55mg，絲氨酸IOOmg和余量的無菌水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2) 中，所述的沉淀重復(fù)以下操作1 2次在沉淀中加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基，研磨成懸浮液， 過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2) 中，所述的小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為0. 8X IO5個/mL 1. 2X IO5個/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3) 中，在黑暗條件下于25士2°C培養(yǎng)20天 30天的具體步驟為在黑暗條件下于25士2°C培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時，再在黑暗條件下于25士2°C條件下?lián)u動培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟4) 中，所述的培養(yǎng)條件為每天12小時 18小時光照和20°C 下培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟4) 中，所述的胚狀體分化培養(yǎng)基為由MS培養(yǎng)基1L、蔗糖20g和瓊脂IOg 12g組成，pH5. 8 6. 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟5)中，所述的生根培養(yǎng)基為由MS培養(yǎng)基1L、糖20g 30g和瓊脂6g 7g組成，pH5. 8 6.0;所述的糖為蔗糖或白糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，包括取羽衣甘藍(lán)和油菜的花序，直接或誘導(dǎo)后取花序上的花蕾，滅菌后加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基，制成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心得到沉淀；依次加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基和活性炭混合液，得到小孢子懸浮液；經(jīng)熱激處理后培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體；接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接種至生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，經(jīng)煉苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩葉檢測各再生植株倍性，并從再生植株群體中鑒定出油菜再生苗和羽衣甘藍(lán)再生苗。該方法將易出胚的油菜與難出胚的羽衣甘藍(lán)品種混合培養(yǎng)，以易出胚的材料帶動難出胚的材料出胚，提高羽衣甘藍(lán)的出胚率。
文檔編號A01H4/00GK102228003SQ20111011269
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者劉旦, 周偉軍, 張振超, 戴忠良, 潘躍平 申請人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 浙江大學(xué)