專利名稱：玉米事件mir604的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及植物分子生物學(xué)、植物轉(zhuǎn)化和植物育種領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及含有新的轉(zhuǎn)基因基因型的抗昆蟲轉(zhuǎn)基因玉米植物及在樣品中檢測(cè)該玉米植物DNA存在的方法以及其組合物。背景植物害蟲是世界重要農(nóng)作物損失的主要因素。由于非-哺乳動(dòng)物害蟲(包括昆蟲)侵染僅在美國(guó)每年約損失80億美元。玉米根蟲(Corn rootworm)種被認(rèn)為是最大破壞性的玉米害蟲。重要的根蟲害蟲種類包括Diabrotica virgifera virgifera即西部玉米牛艮蟲；D. Iongicornis barberi 艮口;!匕部玉米牛艮蟲；D. undecimpunctata howardi 艮口南部玉米根蟲和D. virgifera zeae即墨西哥玉米根蟲。玉米根蟲主要通過(guò)加強(qiáng)應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑來(lái)控制。這樣可以獲得對(duì)玉米根蟲的好的控制，但這些化學(xué)制品有時(shí)也會(huì)影響有益的生物體。廣泛使用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致的另一個(gè)問(wèn)題是出現(xiàn)抗藥性的昆蟲變種。這一問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)多種抗藥性管理實(shí)踐部分地減輕，但對(duì)備選的害蟲控制策略存在增長(zhǎng)的需要。一種這樣的備選策略包括在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)編碼殺蟲蛋白的外源基因。這種方法已經(jīng)提供了一種對(duì)抗選擇性害蟲的有效手段，并且表達(dá)殺蟲毒素的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)商業(yè)化了，使得農(nóng)民減少應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑。外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)可受到它們的染色體位置的影響，這種影響可能是由于染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)或緊靠整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的接近造成的(見(jiàn)例如，Weising等人， 1988，“ Foreign Genes in Plants, “ Ann. Rev. Genet. 22 :421-477)。因此，通常需要產(chǎn)生成百上千個(gè)不同的事件(events)并從這些事件中篩選出用于商業(yè)目的的具有預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的事件。具有預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平或模式的事件可用于采用傳統(tǒng)育種方法通過(guò)有性遠(yuǎn)交將轉(zhuǎn)基因漸滲到其它遺傳背景中。這種雜交產(chǎn)生的子代保持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特性。這種策略用于在許多很好適應(yīng)本地生長(zhǎng)條件的品種中確?？煽康幕虮磉_(dá)。能夠檢測(cè)一特定事件的存在以確定有性雜交的子代是否含有目的轉(zhuǎn)基因?qū)⑹怯欣?。而且，用于測(cè)定特定事件的方法將有助于遵守例如要求源于重組作物的食物售前許可和標(biāo)記的條例。通過(guò)任何熟知的核酸檢測(cè)方法，包括但不限于使用多核苷酸引物進(jìn)行熱擴(kuò)增(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))或使用核酸探針的DNA雜交來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在是可能的。 通常，為了使用來(lái)檢測(cè)已經(jīng)用于轉(zhuǎn)化多種植物品種的特定DNA構(gòu)建體的試劑和方法簡(jiǎn)單并且一致，這些檢測(cè)方法通常集中在頻繁使用的基因元件，例如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因， 因?yàn)閷?duì)于許多DNA構(gòu)建體，編碼序列區(qū)是可互換的。因此，這些方法可能不能用于區(qū)分僅編碼序列不同的構(gòu)建體。而且，這種方法可能不能用于區(qū)分不同的事件，特別是那些使用相同的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的事件，除非與插入的異源DNA相鄰的染色體DNA( “側(cè)翼DNA”)的序列已知。本發(fā)明包括一種已經(jīng)將cry3A055基因(其公開于公布于2003年3月6日的國(guó)際出版物NO.W003/018810，在此引入作為參考)摻入到其基因組中的昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因玉米事件，cry3A055基因編碼Cry3A055殺蟲毒素，可用于控制Diabrotica spp.害蟲。該轉(zhuǎn)基因玉米事件也已經(jīng)將pmi基因摻入到其基因組中，pmi基因編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)，這公開于美國(guó)專利No. 5，767，378，其在此引入作為參考，該酶用作選擇性標(biāo)記，使植物能利用甘露糖作為碳源。本發(fā)明進(jìn)一步包括該轉(zhuǎn)基因玉米事件特有的新的分離的核酸序列，其可用于鑒別該轉(zhuǎn)基因玉米事件并用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)該轉(zhuǎn)基因玉米事件的核酸，本發(fā)明也包括包含用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)這些核酸所需的試劑的試劑盒。概要本發(fā)明涉及命名為MIR604的含有新的轉(zhuǎn)基因基因型的轉(zhuǎn)基因玉米事件，所述的轉(zhuǎn)基因基因型含有分別賦予MIR604玉米事件及其子代昆蟲抗性和利用甘露糖作為碳源能力的cry3A055基因和pmi基因。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因型的轉(zhuǎn)基因玉米植物、來(lái)自含有本發(fā)明基因型的轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子，并涉及通過(guò)將含有本發(fā)明基因型的玉米近交系(inbred)與其自身或與另一種不同基因型的玉米系雜交來(lái)產(chǎn)生含有本發(fā)明基因型的轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法。除了本發(fā)明新的基因型賦予玉米植物的那些特性，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米植物可以基本具有相應(yīng)的等基因非-轉(zhuǎn)基因玉米植物的全部形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性。 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)來(lái)自事件MIR604的核酸的存在的組合物和方法，所述的方法基于插入至產(chǎn)生MIR604事件的玉米基因組的重組表達(dá)盒和插入位點(diǎn)側(cè)翼基因組序列的DNA序列。MIR604事件可以進(jìn)一步通過(guò)分析Cry3A055和PMI蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以及通過(guò)測(cè)試抗玉米根蟲的有效力來(lái)表征。根據(jù)一方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，該核酸分子含有至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，所述的連續(xù)核苷酸來(lái)自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因組中的異源DNA序列，和至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，所述核苷酸來(lái)自插入至玉米事件MR604的玉米植物基因組的異源DNA序列插入位點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組DNA。根據(jù)該方面的分離的核酸分子可以含有至少20或至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸，所述連續(xù)核苷酸來(lái)自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因組的異源DNA序列，和至少20或至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸，所述連續(xù)核苷酸來(lái)自插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因組中的異源DNA序列插入位點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組 DNA。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，所述分子包含含有至少一種選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列的、事件MIR604的接點(diǎn)序列(junction sequence)的核苷酸序列。該接點(diǎn)序列跨越了含有插入至玉米基因組中的表達(dá)盒的異源 DNA和來(lái)自插入位點(diǎn)側(cè)翼的玉米基因組的DNA之間的接點(diǎn)并可用于鑒別MIR604事件。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種將異源DNA分子連接至玉米事件MIR604中的玉米植物基因組的分離的核酸分子，其含有從SEQ ID NO=USEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列中選擇的約11-約20個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種含有選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列的分離的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明核酸分子的擴(kuò)增子。
根據(jù)本發(fā)明的更另外方面，提供了用于檢測(cè)事件MIR604的側(cè)翼序列引物。這種側(cè)翼序列引物含有分離的核酸序列，所述分離的核酸序列含有至少10-15個(gè)來(lái)自如SEQ ID NO :3(在此隨意稱為5'側(cè)翼序列)中列出的核苷酸1-801的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸。 在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該側(cè)翼序列引物選自SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15及其互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的另一方面，側(cè)翼序列引物包含分離的核酸序列，所述分離的核酸序列含有至少10-15個(gè)來(lái)自如SEQ ID N0:4(在此隨意稱為3'側(cè)翼序列)中列出的核苷酸 507-1570的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸。在該方面一個(gè)實(shí)施方案中，該側(cè)翼序列引物選自 SEQ ID NO39,SEQ ID NO40,SEQ ID NO41,SEQ ID NO 42,SEQ ID NO43,SEQ ID N0: 44、SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46 及其互補(bǔ)序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了可用于例如核酸擴(kuò)增的引物對(duì)。這種引物對(duì)包含第一引物，其含有至少10-15個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸序列，后者為上述基因組側(cè)翼序列(SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4)之一或與該側(cè)翼序列之一互補(bǔ)，和第二引物，其含有至少10-15個(gè)插入至事件MIR604基因組中的外源DNA的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。第二引物優(yōu)選含有是插入序列或與插入序列互補(bǔ)的核苷酸序列，所述的插入序列與如SEQ ID N0 3中從核苷酸位置802-1310和與SEQID NO 4中從核苷酸位置1_506所示的植物基因組側(cè)翼DNA序列相鄰。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測(cè)在生物學(xué)樣品中對(duì)應(yīng)于事件MIR604的DNA存在的方法。該方法包括(a)將包含DNA的該樣品與引物對(duì)接觸，所述的引物對(duì)在用于與來(lái)自玉米事件MIR604的基因組DNA進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生可鑒別玉米事件MIR604的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生該擴(kuò)增子；并(c)檢測(cè)該擴(kuò)增子。在該方面一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增子含有選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供在生物學(xué)樣品中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于MIR604事件的DNA存在的方法。該方法包括(a)將含有DNA的該樣品與探針接觸，所述的探針可在高嚴(yán)格條件下與來(lái)自玉米事件MIR604的基因組DNA雜交并且在高嚴(yán)格條件下不與對(duì)照玉米植物的DNA雜交；(b)讓樣品和探針接受高度嚴(yán)格雜交條件；并且(c)檢測(cè)探針與DNA的雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)事件MIR604核酸的試劑盒。該試劑盒包括至少一種含有足夠長(zhǎng)的多核苷酸的DNA序列，所述的多核苷酸是SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或與之互補(bǔ)，其中該DNA序列可用作與來(lái)自事件MIR604的分離的DNA雜交的引物或探針，并且該引物或探針，在擴(kuò)增樣品中的核酸序列或與該核酸序列雜交、隨后檢測(cè)擴(kuò)增子或檢測(cè)與靶標(biāo)序列的雜交之后，可用于鑒別樣品中事件MIR604的核酸序列的存在。試劑盒另外包括實(shí)現(xiàn)核酸雜交或擴(kuò)增方法所需的其它材料。在另一方面，本發(fā)明提供了在生物學(xué)樣品中檢測(cè)玉米事件MIR604蛋白質(zhì)的方法， 所述的方法包括(a)從玉米事件MIR604組織樣品中提取蛋白質(zhì)；(b)使用免疫學(xué)方法測(cè)定提取的蛋白質(zhì)，所述方法包含對(duì)MIR604事件產(chǎn)生的殺昆蟲蛋白質(zhì)或選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)有特異性的抗體；和(c)檢測(cè)該抗體與殺昆蟲蛋白質(zhì)或選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明提供源于事件MIR604玉米植物、組織或種子的生物學(xué)樣品， 其中該樣品含有是選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列或與該序列互補(bǔ)的核苷酸序列，并且其中用核酸擴(kuò)增或核酸雜交方法該序列在樣品中是可檢測(cè)的。在該方面一個(gè)實(shí)施方案中，樣品選自玉米粉(corn flour)、玉米面(corn meal)、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉和被全部或部分加工而含有玉米副產(chǎn)品的谷類食品(cereals)。在另一方面，本發(fā)明提供了源于事件MIR604玉米植物、組織或種子的提取物，其含有是選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列或與該序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在該方面一個(gè)實(shí)施方案中，該序列使用核酸擴(kuò)增或核酸雜交方法在提取物中是可檢測(cè)的。在這方面另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品選自玉米粉、玉米面、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉和完全或部分加工而含有玉米副產(chǎn)品的谷類食品。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明核酸分子的玉米植物和種子。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)至少抗玉米根蟲侵染的玉米植物的方法， 包括(a)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物進(jìn)行有性雜交，其中所述的第一或第二親本玉米植物含有玉米事件MIR604DNA，從而產(chǎn)生多個(gè)第一代子代植物；(b)選擇至少抗玉米根蟲侵染的第一代子代植物；(c)將第一代子代植物自交，從而產(chǎn)生多個(gè)第二代子代植物；(d)從第二代子代植物選擇至少抗玉米根蟲侵染的植物；其中第二代子代植物含有選自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列。根據(jù)更另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)玉米種子的方法，該方法包括將第一親本玉米植物和第二親本玉米植物雜交并收獲產(chǎn)生的第一代玉米種子，其中第一或第二親本玉米植物是本發(fā)明的近交玉米植物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)雜種玉米種子的方法，該方法包括以下步驟 (a)種植根據(jù)本發(fā)明的第一近交玉米系的種子和具有不同基因型的第二近交玉米系的種子；(b)培養(yǎng)從所述種植得到的玉米植物直到其開花；(c)將玉米近交系之一的玉米植物的花去雄；(d)讓另一近交系進(jìn)行授粉，并(e)收獲由此產(chǎn)生的雜種種子。本發(fā)明前述及其它方面從下面詳細(xì)的描述中將變得更明確。序列表中序列的描述SEQIDNO:1是5'基因組-插入序列接點(diǎn)。
SEQIDNO:2是3'插入序列-基因組接點(diǎn)。
SEQIDNO:3是5'基因組+插入序列的序列。
SEQIDNO:4是3'插入序列+基因組的序列。
SEQIDNO:5是插入序列5'側(cè)翼的玉米基因組。
SEQIDNO:6是插入序列3'側(cè)翼的玉米基因組。
SEQIDNO:7-15是用于本發(fā)明的5'側(cè)翼序列引物。
SEQIDNO16-20是用于本發(fā)明的MTL啟動(dòng)子序列引物。
SEQIDNO=21-28是用于本發(fā)明的cry3A055序列引物。
SEQIDNO:29-30是用于本發(fā)明的ZmUbiInt序列引物。
SEQIDNO=31-37是用于本發(fā)明的pmi序列引物。
SEQIDNO38是用于本發(fā)明的NOS序列引物。
SEQIDNO:39-46是用于本發(fā)明的3'側(cè)翼序列引物。
SEQIDNo:47-49 是 cry3A055 TAQMAN 引物和探針。
SEQIDNo:50-52是pmi TAQMAN引物和探針。
SEQIDNO:53-55是ZmADH TAQMAN引物和探針。
SEQIDNO56是用于本發(fā)明的MIR604探針。
SEQIDNO57是右邊界區(qū)域的序列。
SEQIDNO58是MTL啟動(dòng)子的序列。
SEQIDNO59是cry3A055基因的序列。
SEQIDNO60是NOS終止子的序列。
SEQIDNO61是ZmUbInt啟動(dòng)子的序列。
SEQIDNO62是pmi基因的序列。
SEQIDNO63是左邊界區(qū)域的序列。
附圖簡(jiǎn)述


圖1說(shuō)明了命名為pZiC6的植物表達(dá)載體。圖譜確定了用于Southern分析的Kpnl 限制性位點(diǎn)。圖2是說(shuō)明含有插入至玉米事件MIR604基因組中的異源核酸序列的元件之組織的圖解圖譜，并顯示了插入的核酸序列連接位于插入的異源DNA序列末端側(cè)翼的玉米基因組DNA序列之處的相對(duì)位置。1 = 5'側(cè)翼植物基因組(SEQ ID NO 5) ；2 =右邊界區(qū)域 (SEQ ID NO 57) ；3 = MTL 啟動(dòng)子(SEQ ID NO 58) ；4 = cry3A055 基因(SEQ ID NO 59) ；5 =NOS 終止子(SEQ ID NO 60) ；6 = ZmUbINT 啟動(dòng)子(SEQ ID NO 61) ；7 = pmi 基因(SEQ ID NO 62) ；8 = NOS 終止子(SEQ ID NO 60) ；9 =左邊界區(qū)域(SEQ ID NO 63)；并且 10 = 3'側(cè)翼植物基因組(SEQ ID NO :6)。定義提供下面的定義和方法以便更好地定義本發(fā)明并且在本發(fā)明的實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員。除非另外說(shuō)明，在此使用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)該根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的那些一般技術(shù)人員的常規(guī)用法來(lái)理解。分子生物學(xué)中一般術(shù)語(yǔ)的定義也可在Rieger等人，Glossary of Genetics !Classical and Molecular,第 5 版，Springer-Verlag :New York, 1994 中找至丨J。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”指使用至少一個(gè)核酸分子作為模板構(gòu)建核酸分子的多個(gè)拷貝或與該核酸分子互補(bǔ)的多個(gè)拷貝。擴(kuò)增體系包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)體系、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β 復(fù)制酶體系、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增體系(TAS)和鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(SDA)。見(jiàn)，例如Diagnostic Molecular Microbiology :Principles and Applications,D. H. Persing等編輯,American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1993)。擴(kuò)增產(chǎn)物稱為擴(kuò)增子。“編碼序列”是可轉(zhuǎn)錄為RNA例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA的核酸序列。優(yōu)選地，RNA然后在生物體中經(jīng)翻譯而產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在此使用的“檢測(cè)試劑盒”指用于在樣品中檢測(cè)來(lái)自MIR604植物的DNA的存在或缺乏的試劑盒，所述的試劑盒包含本發(fā)明的核酸探針和引物(其可在高度嚴(yán)格條件下與靶標(biāo)DNA序列特異性地雜交)和實(shí)現(xiàn)核酸雜交或擴(kuò)增方法所需的其它材料。在此使用的術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因“事件(event)，，指通過(guò)用異源DNA，例如包括目的基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化并再生單個(gè)植物細(xì)胞而產(chǎn)生的重組植物。術(shù)語(yǔ)“事件”指包括該異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體和/或該轉(zhuǎn)化體的子代。術(shù)語(yǔ)“事件”也指通過(guò)該轉(zhuǎn)化體和另一種玉米系之間進(jìn)行有性遠(yuǎn)交(outcross)而產(chǎn)生的子代。即使經(jīng)過(guò)與回歸親本進(jìn)行反復(fù)回交，來(lái)自轉(zhuǎn)化親本的插入DNA和側(cè)翼DNA仍存在于雜交子代中相同的染色體位置上。通常，植物組織的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生多個(gè)事件，每個(gè)上述事件代表DNA構(gòu)建體插入至植物細(xì)胞的基因組中的不同位置中。 基于轉(zhuǎn)基因或其它期望的特性的表達(dá)，選擇特定的事件。因而，在此使用的“事件MIR604”、 “MIR604”或“MIR604事件”指原始的MIR604轉(zhuǎn)化體和/或MIR604轉(zhuǎn)化體的子代。如在此使用的“表達(dá)盒”指能在合適的宿主細(xì)胞中引導(dǎo)特定的核苷酸序列表達(dá)的核酸分子，其含有有效連接至目的核苷酸序列的啟動(dòng)子，所述的目的核苷酸序列有效地連接至終止信號(hào)。它還典型地包含核苷酸序列正確翻譯所需要的序列。表達(dá)盒還可以含有在引導(dǎo)目的核苷酸序列表達(dá)中不需要的序列，但是其因?yàn)橛糜趯⒈磉_(dá)盒從表達(dá)載體移除的合適的限制性位點(diǎn)而存在。含有目的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，指至少一種它的組分相對(duì)于至少一種它的其它組分是異源的。表達(dá)盒還可以是天然存在的但已經(jīng)以可于異源表達(dá)的重組形式獲得的表達(dá)盒。然而，通常表達(dá)盒相對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)是異源的，即表達(dá)盒的特定核酸序列在宿主細(xì)胞中不是天然存在的，并必須已經(jīng)通過(guò)本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法引入至宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先中。表達(dá)盒中的核苷酸序列的表達(dá)可以處于組成型啟動(dòng)子或僅當(dāng)宿主細(xì)胞曝露于特定外界刺激時(shí)起始轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。在多細(xì)胞生物體例如植物的情況下，啟動(dòng)子也可以是特異于特定組織或器官或發(fā)育階段。表達(dá)盒或其片段，當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)植物時(shí)，也可以稱為“插入的序列”或“插入序列”?！盎颉笔且淮_定的區(qū)域，其位于基因組內(nèi)并且，除了上述的編碼核酸序列，還包含負(fù)責(zé)控制表達(dá)，即轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼部分的其它(主要是調(diào)節(jié)性的)核酸序列。基因還可以包含其它5'和3'非翻譯序列和終止序列。可能存在的其它元件是，例如內(nèi)含子?！澳康幕颉敝府?dāng)轉(zhuǎn)移至植物時(shí)賦予植物期望的特性例如抗生素耐藥性、抗病毒性、抗昆蟲性、抗病性或抗其它害蟲的抗性、除草劑耐性、提高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、工業(yè)過(guò)程中的改良的性能或改變的繁殖能力的任何基因?！澳康幕颉边€可以是轉(zhuǎn)移至植物用以在植物中產(chǎn)生有商業(yè)價(jià)值的酶或代謝物的基因。在此使用的“基因型”是從親本玉米植物遺傳的遺傳物質(zhì)，并不是所有的該遺傳物質(zhì)必定在子代玉米植物中表達(dá)。MIR604基因型指轉(zhuǎn)化入植物基因組中的異源遺傳物質(zhì)以及插入序列側(cè)翼的遺傳物質(zhì)。“異源”核酸序列是與其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞不是天然相聯(lián)系的核酸序列，其包括天然存在的核酸序列的非天然出現(xiàn)的多拷貝?！巴础焙怂嵝蛄惺桥c其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞天然相聯(lián)系的核酸序列。“有效地連接”指將各核酸序列連接在單個(gè)核酸片段上以便一個(gè)的功能影響另一個(gè)的功能。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能影響編碼序列或功能RNA的表達(dá)(S卩，編碼序列或功能RNA受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)時(shí)，其有效地連接至該編碼序列或功能RNA。有義或反義方向的編碼序列可以有效地連接至調(diào)節(jié)序列。在此使用的“引物”是分離的核酸，它可以通過(guò)核酸雜交退火至互補(bǔ)靶標(biāo)DNA鏈上，在引物和靶標(biāo)DNA鏈之間形成雜交體，然后通過(guò)聚合酶，例如DNA聚合酶沿著靶標(biāo)DNA 鏈延伸。引物對(duì)或引物組可例如通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法來(lái)用于擴(kuò)增核酸分子。
“探針”是分離的核酸，其上連接有常規(guī)可檢測(cè)標(biāo)記物或報(bào)告分子，例如放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶。這種探針與靶標(biāo)核酸的一條鏈互補(bǔ)，在本發(fā)明中，其與來(lái)自玉米事件MIR604的基因組DNA的一條鏈互補(bǔ)。MIR604的基因組DNA可以來(lái)自玉米植物或包括該事件的DNA的樣品。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括特異性結(jié)合靶標(biāo)DNA序列并可用于檢測(cè)那些靶標(biāo)DNA序列存在的聚酰胺及其它探針材料。引物和探針通常長(zhǎng)為10-15個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)，引物和探針也可以長(zhǎng)為至少為20個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)，或至少長(zhǎng)為25個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)，或至少長(zhǎng)為30個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。這些引物和探針在高度嚴(yán)格雜交條件下可特異性地與靶標(biāo)序列雜交。根據(jù)本發(fā)明的引物和探針可以與靶標(biāo)序列具有完全的序列互補(bǔ)性，盡管不同于靶標(biāo)序列并且保持與靶標(biāo)序列雜交能力的探針可以通過(guò)常規(guī)方法設(shè)計(jì)得到。“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”包括說(shuō)明一種條件，在該條件下探針將以比與其它序列可檢測(cè)地更高的程度與其靶標(biāo)序列雜交。嚴(yán)格條件是靶標(biāo)序列依賴性的并且將根據(jù)多核苷酸的結(jié)構(gòu)而不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100% 互補(bǔ)(同源探測(cè)(homologcus probing))的靶標(biāo)序列。備選地，可調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯(cuò)配以便檢測(cè)低水平的相似性(異源探測(cè)(heterologous proding))。更長(zhǎng)的序列在更高的溫度下特異性雜交。對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays " , Elsevier :New York ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等人編輯，Greene Publishing and Wiley-Interscience :New York(1995)，\)JsR Sambrook 等)κ (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 5 版，Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 中找到。特異性典型地是雜交后的洗滌的函數(shù)，最終的洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度是關(guān)鍵因素。通常，高嚴(yán)格雜交和洗滌條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的熱解鏈溫度(Tm)約低5°C。1是50%的靶標(biāo)序列與完全互補(bǔ)的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。典型地，在高度嚴(yán)格條件下探針將于它的靶標(biāo)序列而不與其它序列雜交。在Southern印跡或Northern印跡中的濾膜上具有多于100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的高度嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例是在42°C下含有Img肝素的50%甲酰胺，雜交過(guò)夜進(jìn)行。非常高的嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是在72°C下用0. 15M NaCl洗滌約15分鐘。高度嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)實(shí)例是在65°C用0. 2 X SSC洗滌15分鐘(對(duì)SSC緩沖液的描述見(jiàn)， Sambrook,下文)。用于本發(fā)明示例性雜交條件包括于67°C在 % SDS,0. 25Μ NaP04pH 7. 2中雜交過(guò)夜，隨后于65°C在5% SDS、0. 20M NaPO4 pH 7. 2中洗滌兩次，每次洗滌30分鐘，并于65°C 在SDS,0. 20M NaPO4 pH7. 2中洗滌兩次，每次洗滌30分鐘。對(duì)例如多于100個(gè)核苷酸的雙鏈體的示例性中等嚴(yán)格洗滌是在45°C下用1 X SSC洗滌15分鐘。對(duì)例如多于100個(gè)核苷酸的雙鏈體的示例性低嚴(yán)格洗滌是在40°C下用4-6X SSC洗滌15分鐘。對(duì)于約10-50個(gè)核苷酸的探針，高度嚴(yán)格條件通常包括pH7. 0-8. 3，低于約1. OM Na離子，典型地約0. 01-1. OM Na離子濃度(或其它鹽)的鹽濃度，并且溫度典型地至少約30°C。高度嚴(yán)格條件還可以通過(guò)加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)獲得。通常，比在特定雜交測(cè)定中對(duì)于不相關(guān)探針觀測(cè)到的高2倍(或更高)的信噪比表明是特異性雜交的檢測(cè)。如果它們編碼的蛋白質(zhì)基本一致，則在高度嚴(yán)格條件下不互相雜交的核酸仍然是基本一致的。例如，當(dāng)核酸的拷貝用遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并而產(chǎn)生時(shí)出現(xiàn)這一情況。以下是可用于雜交與本發(fā)明參考核苷酸序列基本一致的核苷酸序列的雜交/洗滌條件的示例性組參考核苷酸序列與參考的核苷酸序列優(yōu)選于50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中雜交，并于50°C在2 X SSC、0. 1 % SDS中洗滌，更優(yōu)選在于50°C，7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中雜交，并于50°C在1 X SSC、 0. SDS中洗滌，更優(yōu)選于50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中雜交，于50°C在0. 5XSSC、0. 1% SDS中洗滌，優(yōu)選于50°C在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中雜交，并于50°C在0. 1XSSC、0. 1% SDS中洗滌，更優(yōu)選于50°C，在7% 十二烷基硫酸鈉(SDS)、0· 5M NaPO4, ImM EDTA 中雜交，并于 65°C在 0. 1 X SSC,0. 1 % SDS ψ 洗滌。本發(fā)明的序列可使用上述的所有條件檢測(cè)。為定義本發(fā)明的目的，使用高度嚴(yán)格條件。“轉(zhuǎn)化”是用于將異源核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物內(nèi)的方法。特別地，“轉(zhuǎn)化”指將DNA 分子穩(wěn)定地整合進(jìn)入目的生物的基因組中?！稗D(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)基因的/重組的”涉及異源核酸分子已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主生物例如細(xì)菌或植物。核酸分子可以穩(wěn)定地整合入宿主的基因組或者該核酸分子也可以作為染色體外分子存在。這種染色體外分子可以是自主復(fù)制的。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物應(yīng)理解為不僅包括轉(zhuǎn)化過(guò)程的終產(chǎn)物，還包括其轉(zhuǎn)基因子代?！胺寝D(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”或“非重組的” 宿主是指野生型生物如細(xì)菌或植物，其不含有該異源核酸分子。如此除使用的，“轉(zhuǎn)基因的” 涉及植物、植物細(xì)胞或許多結(jié)構(gòu)化或非結(jié)構(gòu)化的植物細(xì)胞，其經(jīng)過(guò)公知的遺傳操作和基因插入技術(shù)將代表目的基因的核酸序列整合至植物基因組，并且典型地整合進(jìn)入細(xì)胞核、線粒體或其它包含染色體的細(xì)胞器的染色體中，該整合發(fā)生在與天然植物或植物細(xì)胞通常存在的不同的基因座，或以比通常存在于天然植物或植物細(xì)胞的拷貝更多的許多拷貝發(fā)生整合。與天然存在的突變相反，轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)操作和插入這種核酸序列而得到，產(chǎn)生非天然存在的植物或具有非天然存在的基因型的植物。轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，可包括例如電穿孔、顯微注射、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和ballistic轉(zhuǎn)化。在此使用如37C. F. R. § 1. 822中列出的DNA堿基和氨基酸的命名法。詳述本發(fā)明涉及在遺傳學(xué)上改良的玉米系，其產(chǎn)生昆蟲防治蛋白Cry3A055和使得植物能利用甘露糖作碳源的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)。本發(fā)明特別涉及含有新的基因型的命名為MIR604的轉(zhuǎn)基因玉米事件，也涉及用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)來(lái)自該事件的核酸的組合物和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有MIR604基因型的玉米植物、涉及來(lái)自該玉米植物的轉(zhuǎn)基因種子，以及涉及通過(guò)將含有MIR604基因型的近交玉米與自身或另一種玉米系雜交來(lái)產(chǎn)生含有MIR604基因型的玉米植物的方法。含有本發(fā)明的MIR604基因型的玉米植物可用于控制鞘翅目昆蟲害蟲，包括Diabrotica virgifera virgifera即西部玉米根蟲、 D. virgifera zeae即墨西哥玉米根蟲和D. Iongicornis barberi即北部玉米根蟲。含有本發(fā)明的MIR604基因型的玉米植物還能夠利用甘露糖為碳源。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，該分子含有至少10個(gè)或更多(例如15、20、25或50個(gè))插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因組中的異源DNA序列的連續(xù)核苷酸，和至少10個(gè)或更多(例如15、20、25或50個(gè))位于插入至玉米事件MIR604 的玉米植物基因組中的異源DNA序列插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組DNA的連續(xù)核苷酸。還包括核苷酸序列，其含有來(lái)自事件MIR604的連續(xù)插入序列的10或更多核苷酸，并含有與插入序列鄰接的、來(lái)自事件MIR604的側(cè)翼DNA的至少一個(gè)核苷酸。這種核苷酸序列可用于鑒別事件MIR604。來(lái)自MIR604事件的基因組DNA的核酸擴(kuò)增產(chǎn)生擴(kuò)增子，其含有這種鑒別性的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，所述核酸分子含有這樣的核苷酸序列，該序列含有至少一個(gè)選自SEQ ID NO=USEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列的、事件 MIR604的接點(diǎn)序列，其中該接點(diǎn)序列跨越插入至玉米基因組的異源表達(dá)盒和位于插入位點(diǎn)側(cè)翼的玉米基因組的DNA之間的接點(diǎn)，并且可用于鑒別該事件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將異源DNA分子連接至玉米事件MIR604的玉米植物基因組的分離的核酸，其含有從SEQ ID NO=USEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列中選擇的約 11-約20個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子含有選自SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列的擴(kuò)增子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測(cè)事件MIR604的側(cè)翼序列引物。這種側(cè)翼序列引物含有分離的核酸序列，該分離的核酸序列含有來(lái)自SEQ ID N0:3(在此隨意指定為5'側(cè)翼序列)的核苷酸1-801或其互補(bǔ)序列的至少10-15個(gè)連續(xù)核苷酸。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，側(cè)翼序列引物選自 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15 及其互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括側(cè)翼序列引物，所述的側(cè)翼序列引物含有來(lái)自 SEQ ID NO :4(在此隨意指定為3'側(cè)翼序列)的核苷酸507-1570或其互補(bǔ)序列的至少 10-15個(gè)連續(xù)核苷酸。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，側(cè)翼序列引物選自SEQ ID NO 39,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO 46及其互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括多核苷酸引物對(duì)，其含有第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，它們可在存在樣品中的玉米事件MIR604 DNA模板時(shí)一起發(fā)揮作用而產(chǎn)生可用于鑒別玉米事件MIR604的擴(kuò)增子，其中第一引物序列是位于插入至玉米事件 MIR604的玉米植物基因組中的異源DNA序列插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組或是與其互補(bǔ)的序列，第二多核苷酸引物序列是插入至玉米事件MIR604的玉米植物基因組中的異源DNA 序列或是與其互補(bǔ)的序列。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，第一多核苷酸引物含有來(lái)自SEQ ID NO :3的位置 1-801或其互補(bǔ)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。在這個(gè)實(shí)施方案的其它方面，第一多核苷酸引物含有在SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15或其互補(bǔ)序列中列出的核苷酸序列。 在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面，第一多核苷酸引物含有來(lái)自SEQ ID NO :4的位置507-1570或其互補(bǔ)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。在該實(shí)施方案的另一方面，第一多核苷酸引物含有在 SEQ ID NO39,SEQ ID NO40,SEQ ID NO41,SEQ ID NO 42,SEQ ID NO43,SEQ ID N0: 44、SEQ ID NO 45, SEQ ID NO :46或其互補(bǔ)序列中列出的核苷酸序列。而在該實(shí)施方案的另一方面，第二多核苷酸引物含有來(lái)自SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO 60,SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63 或其互補(bǔ)序列的至少 10 個(gè)連續(xù)核苷酸。在這個(gè)實(shí)施方案的其它方面，第二多核苷酸引物含有在SEQ ID N0:16至SEQ ID N0 38或其互補(bǔ)序列中列出的核苷酸序列。在該實(shí)施方案的另一方面，在SEQ ID NO :15中列出的第一多核苷酸引物和在SEQ ID NO 中列出的第二多核苷酸引物在存在樣品中玉米事件MIR604 DNA模板的情況下一起發(fā)揮作用，產(chǎn)生(如實(shí)施例4中描述的)可鑒別玉米事件MIR604的擴(kuò)增子。在這個(gè)實(shí)施方案的另一方面，在SEQ ID NO 45中列出的第一多核苷酸引物和在SEQ ID NO 27中列出的第二多核苷酸引物在存在樣品中玉米事件MIR604 DNA模板的情況下一起發(fā)揮作用，產(chǎn)生 (如實(shí)施例4中描述的)可鑒別玉米事件MIR604的擴(kuò)增子。當(dāng)然，獲得進(jìn)一步向外移動(dòng)到位于插入的異源DNA序列任一末端側(cè)翼的基因組序列內(nèi)的額外序列用作如下這樣的引物序列完全處于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，所述的引物序列可用于這種用于擴(kuò)增可鑒別MIR604事件的序列的引物對(duì)中。為本公開的目的，短語(yǔ)“進(jìn)一步向外移動(dòng)到位于插入的異源DNA序列任一末端側(cè)翼的基因組序列內(nèi)”特定地指從插入的異源DNA序列的末端(插入的DNA序列鄰接天然的基因組DNA序列的點(diǎn))順序地離開，并向外移動(dòng)到該異源DNA序列插入的特定染色體的基因組DNA內(nèi)。優(yōu)選地，與插入序列的一部分對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的引物序列應(yīng)該引導(dǎo)DNA或RNA的新生鏈的朝最近的側(cè)翼序列接點(diǎn)轉(zhuǎn)錄延伸。因此，與基因組側(cè)翼序列的一部分對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的引物序列應(yīng)該引導(dǎo)DNA或RNA的新生鏈的朝最近的側(cè)翼序列接點(diǎn)轉(zhuǎn)錄延伸。引物序列可以是插入至植物染色體中的異源DNA序列或基因組側(cè)翼序列，或者可以是與該序列互補(bǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，取決于將要通過(guò)使用一組嵌套引物獲得的產(chǎn)物的特性，引物序列需要是如插入的異源DNA序列內(nèi)所示的或如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4中所示的序列或需要與其互補(bǔ)的益處，其中所述的嵌套引物旨在用于擴(kuò)增含有基因組DNA序列和插入的異源DNA序列之間接頭的特定的側(cè)翼序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在生物學(xué)樣品中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于事件MIR604的DNA 的存在的方法，其中該方法包括(a)將含有DNA的樣品與探針接觸，所述的探針可在高嚴(yán)格條件下與來(lái)自玉米事件MIR604的基因組DNA雜交并且在高嚴(yán)格條件下不與對(duì)照玉米植物的DNA雜交；(b)讓樣品和探針接受高度嚴(yán)格雜交條件；并且(c)檢測(cè)探針與DNA的雜交。在該實(shí)施方案的一方面，擴(kuò)增子含有選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :4及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在生物學(xué)樣品中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于MIR604事件的DNA 的存在的方法，其中所述的方法包括a)將含有DNA的樣品與探針接觸，所述的探針可在高嚴(yán)格條件下與來(lái)自玉米事件MIR604的基因組DNA雜交并且在高嚴(yán)格條件下不與對(duì)照玉米植物的DNA雜交；(b)讓樣品和探針接受高度嚴(yán)格雜交條件；并且(c)檢測(cè)探針與DNA的雜交。檢測(cè)可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法，包括但不限于熒光方法、化學(xué)發(fā)光方法、放射學(xué)方法、免疫學(xué)方法或其它方法來(lái)進(jìn)行。在其中旨在將雜交用作擴(kuò)增特定序列的手段以產(chǎn)生可用于鑒定MIR604玉米事件的擴(kuò)增子的情況中，通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任何手段的擴(kuò)增子的產(chǎn)生和檢測(cè)旨在指示與一個(gè)靶標(biāo)序列(使用一個(gè)探針或引物時(shí))或多個(gè)靶標(biāo)序列(使用兩個(gè)或更多的探針或引物時(shí))的期望的雜交。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”旨在包括含有或懷疑含有這樣的核酸的樣品，所述的核酸含有某點(diǎn)任意一側(cè)的5-10個(gè)核苷酸，在所述的點(diǎn)處，插入的異源DNA序列的兩個(gè)末端的一個(gè)或另一個(gè)與該異源DNA序列插入的染色體內(nèi)的基因組 DNA序列接觸，這里將所述的核酸也稱為接點(diǎn)序列。另外，接點(diǎn)序列可含有少至兩個(gè)核苷酸 即側(cè)翼基因組DNA內(nèi)的第一個(gè)核苷酸和與該核苷酸鄰接并共價(jià)地連接的插入的異源DNA序列內(nèi)的第一個(gè)核苷酸。然而在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)MIR604核酸存在的試劑盒，其中該試劑盒包含至少一種具有足夠長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸的核酸分子及其它實(shí)現(xiàn)核酸雜交或擴(kuò)增所必需的材料，其中所述的連續(xù)核苷酸與選自SEQ ID NO=USEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的核苷酸序列同源或互補(bǔ)，所述核酸分子用作事件MIR604 特異性的DNA引物或探針?？墒褂枚喾N檢測(cè)方法，包括TAQMAN(Perkin Elmer)、熱擴(kuò)增法、 連接酶鏈反應(yīng)、Southern雜交、ELISA法以及比色和熒光檢測(cè)法。特別是，本發(fā)明提供了用于在含有來(lái)自MIR604的基因組核酸的樣品中檢測(cè)靶標(biāo)序列，即至少一個(gè)插入DNA和MIR604 玉米植物的基因組DNA的接點(diǎn)的存在的試劑盒。該試劑盒包括至少一個(gè)能結(jié)合至靶位點(diǎn)或基本鄰接靶位點(diǎn)的序列的多核苷酸和至少一種用于檢測(cè)多核苷酸與靶位點(diǎn)結(jié)合的手段。該檢測(cè)方法可以是熒光法、化學(xué)發(fā)光法、比色法或同位素法并至少可以與用于檢測(cè)該結(jié)合的免疫法結(jié)合使用。也考慮了一種試劑盒，其能利用兩種或多種多核苷酸序列在樣品中檢測(cè)靶標(biāo)位點(diǎn)(即插入的DNA和MIR604玉米植物的基因組DNA的至少一個(gè)接點(diǎn))的存在，所述的多核苷酸序列一起能結(jié)合至與約100個(gè)靶標(biāo)序列的堿基對(duì)，或約200個(gè)靶標(biāo)序列的堿基對(duì)，或約500個(gè)靶標(biāo)序列的堿基對(duì)或約1000個(gè)靶標(biāo)序列的堿基對(duì)鄰接或在其中的核苷酸序列，并且所述的核苷酸序列能朝向彼此延伸以形成至少含有該靶位的擴(kuò)增子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)事件MIR604蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)從玉米事件MIR604組織的樣品中提取蛋白質(zhì)；(b)使用包括特異于MIR604事件產(chǎn)生的殺蟲蛋白或選擇性標(biāo)記蛋白的抗體的免疫法，測(cè)定提取的蛋白質(zhì)；和 (c)檢測(cè)上述的抗體與殺蟲蛋白或選擇性標(biāo)記蛋白的結(jié)合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括含有轉(zhuǎn)基因事件MIR604的基因型的玉米植物或其部分，其中該基因型含有在 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 中列出的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，玉米植物來(lái)自近交玉米系 CG5NA58、CG5NA58A、CG3ND97、CG5NA01、CG5NF22、CG4NU15、CG00685、CG00526、CG00716、 NP904, NP948、NP934、NP982、NP99U NP993、NP2010、NP2013、NP2015、NP2017、NP2029、 NP2031、NP2034、NP2045、NP2052、NP2138、NP2151、NP2166、NP2161、NP2171、NP2174、NP2208、 NP2213、NP2222、NP2275、NP2276、NP2316、BCTT609、AF031、H8431，894、BUTT201、R327H、 2044BT和2070BT。然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，MIR604基因型可以漸滲入至能與玉米雜交的任何植物品種，包括野生玉米物種，因而該實(shí)施方案的優(yōu)選近交系并不意味著限制。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括至少包含連接在一起形成連續(xù)核苷酸序列的第一和第二 DNA序列的玉米植物，其中第一 DNA序列在接點(diǎn)序列內(nèi)并含有至少約11個(gè)選自 SEQ ID NO 3 的核苷酸 792-811 ；SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 的核苷酸 497-516 ；及其互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸，其中第二 DNA序列在選自SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID N0:61、SEQ ID NO 62, SEQ ID NO :63 及其互補(bǔ)序列的異源插入DNA序列內(nèi)；并且其中第一和第二 DNA序列可用作在生物學(xué)樣品中檢測(cè)玉米事件MIR604的核酸序列存在的核苷酸引物或探針。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，核苷酸引物在DNA擴(kuò)增方法中用于從提取自玉米植物的模板DNA擴(kuò)增靶標(biāo)DNA序列，并且通過(guò)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的DNA序列的擴(kuò)增子可將該玉米植物從其它玉米植物中鑒定出來(lái)。本發(fā)明的玉米植物還可以通過(guò)如下方式表征用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI消化植物的基因組DNA，并在高度嚴(yán)格條件下，使用cry3A055-特異性探針雜交，產(chǎn)生單個(gè) cry3A055雜交條帶。在此作為實(shí)例的是含有SEQ ID NO 56或SEQ ID 59中列出的核苷酸序列的cry3A055探針。本發(fā)明的玉米植物還可以通過(guò)如下方式表征用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI消化植物的基因組DNA，并在高度嚴(yán)格條件下，使用pmi-特異性探針雜交，產(chǎn)生單個(gè)pmi雜交條帶。 在此作為實(shí)例的是含有SEQ ID NO 62中列出的核苷酸序列的pmi探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種玉米植物，其中MIR604基因型賦予該玉米植物對(duì)昆蟲的抗性或使之具有利用甘露糖的能力。在該實(shí)施方案中的一個(gè)方面，賦予玉米植物對(duì)昆蟲的抗性的基因型含有cry3A055基因。在該個(gè)實(shí)施方案中的另一個(gè)方面，賦予玉米植物利用甘露糖的能力的基因型含有pmi基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供源于事件MIR604玉米植物、組織或種子的生物學(xué)樣品，其中該樣品含有如下核苷酸序列，該序列是選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列或是與其互補(bǔ)的序列，并且其中該序列在樣品中是可采用核酸擴(kuò)增或核酸雜交方法檢測(cè)的。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該樣品選自玉米粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉和被完全或部分地加工而含有玉米產(chǎn)品的谷類食品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供源于含有如下核苷酸序列的事件MIR604玉米植物、組織或種子的提取物，所述的核苷酸序列是選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列或是與其互補(bǔ)的序列。在該實(shí)施方案中的一個(gè)方面，該序列在提取物中是可采用核酸擴(kuò)增或核酸雜交的方法檢測(cè)的。在該實(shí)施方案的另一方面，該樣品選自玉米粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉和被完全或部分地加工而含有玉米產(chǎn)品的谷類食品。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生至少抗玉米根蟲侵染的玉米植物的方法，方法包括(a)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物進(jìn)行有性雜交，其中所述的第一或第二親本玉米植物含有玉米事件MIR604的DNA，從而產(chǎn)生大量的第一代子代植物；(b) 選擇至少抗玉米根蟲侵染的第一代子代植物；(c)將此第一代子代植物自交，從而產(chǎn)生大量的第二代子代植物；和(d)從第二代子代植物中選擇至少抗玉米根蟲侵染的植物；其中該第二代子代植物含有選自SEQID NO :1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生雜種玉米種子的方法，方法包括(a)種植含有選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的核苷酸序列的第一近交玉米系的種子，以及具有不同基因型的第二近交系的種子；(b)栽培從上述種植得到的玉米植物直到其開花；(C)將上述的玉米近交系之一的植物的花去雄；(d)讓這兩種不同的近交系相互有性雜交；和(e)收獲因而產(chǎn)生的雜種種子。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，第一近交玉米系提供母本。在該實(shí)施方案的另一方面，第一近交玉米系提供父本。本發(fā)明還包括通過(guò)此實(shí)施方案的方法產(chǎn)生的雜種種子和由該種子生長(zhǎng)得到的雜種植物。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將意識(shí)到，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型可以通過(guò)育種而漸滲至含有不同轉(zhuǎn)基因基因型的其它玉米系中。例如，含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因基因型的玉米近交系可以與含有本領(lǐng)域已知的抗鱗翅目抗性Btll事件的轉(zhuǎn)基因基因型的玉米近交系雜交，從而產(chǎn)生含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因基因型和Btll轉(zhuǎn)基因基因型兩者的玉米種子。能與本發(fā)明近交系雜交的其它轉(zhuǎn)基因事件的實(shí)例包括草甘膦耐受性事件GA21和NK603、草甘膦耐受性 /鱗翅目昆蟲抗性的M0N802事件、鱗翅目昆蟲抗性的DBT418事件、鱗翅目昆蟲抗性的事件DAS-06275-8、雄性不育事件MS3、膦絲菌素耐受性事件B16、鱗翅目昆蟲抗性的事件MON 80100、膦絲菌素耐受性事件T14和T25、鱗翅目昆蟲抗性的事件176和鞘翅目昆蟲抗性的事件M0N863，上述的所有事件是本領(lǐng)域已知的。另外應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，也可以與本發(fā)明轉(zhuǎn)基因基因型構(gòu)成其它組合并因而不應(yīng)將這些實(shí)施例看作限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認(rèn)識(shí)到，含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因基因型的轉(zhuǎn)基因玉米種子可以用各種處理種子的化學(xué)藥品劑(包括殺蟲劑)來(lái)處理以增強(qiáng)或協(xié)同地加強(qiáng)Cry3A055蛋白質(zhì)的殺蟲活性。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米種子可以用商品化殺蟲劑Cruiser 處理。這種組合可用于增加活性譜并增加所表達(dá)的蛋白和化學(xué)藥品的效力。育種采用本領(lǐng)域公認(rèn)的育種技術(shù)可將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型漸滲至任何近交玉米或雜種玉米中。植物育種的目的是將多種期望的性狀組合在單個(gè)品種或雜種中。對(duì)于大田作物，這些性狀可包括對(duì)昆蟲和疾病的抗性、對(duì)除草劑的耐受性、對(duì)熱和干旱的耐受性、縮短農(nóng)作物成熟的時(shí)間、更高產(chǎn)量和更好的農(nóng)藝學(xué)品質(zhì)。隨著許多農(nóng)作物的機(jī)械收割，植物特性例如萌發(fā)和立株(stand establishment)、生長(zhǎng)速率、成熟期以及株高和穗高的均一性是重要的。大田作物通過(guò)利用植物的授粉方法的技術(shù)來(lái)育種。如果來(lái)自一朵花的花粉轉(zhuǎn)移至自身或相同植物的另一朵花時(shí)，植物是自花授粉。如果花粉來(lái)自不同植物的花則植物是異花授粉。經(jīng)過(guò)多代自花授粉并選擇某類型的植物在幾乎所有基因座變成純合并產(chǎn)生均一的純育子代群。兩種不同純合系之間的雜交產(chǎn)生均一的雜種植物群，該雜種植物群的許多基因座可能是雜合的。各在許多基因座是雜合的兩種植物，其雜交將產(chǎn)生不均一的一群在遺傳學(xué)上不同的雜種植物。玉米可以通過(guò)自花授粉和異花授粉技術(shù)育種。玉米在相同的植株上具有分開的雄花和雌花，它們分別位于雄花穗和雌穗上。當(dāng)風(fēng)將花粉從雄花穗吹到雌穗頂端伸出的穗絲上時(shí)則玉米植物中發(fā)生自然授粉。一種在植物中控制雄性能育性的可靠方法為改良植物育種提供了機(jī)會(huì)。這對(duì)依賴某種雄性不育體系的玉米雜種的開發(fā)來(lái)說(shuō)尤其是如此。存在多種可選方案供育種者控制雄性能育性，例如手工或機(jī)械去雄(或去除雄花穗)、細(xì)胞質(zhì)雄性不育性、遺傳性雄性不育性、殺配子劑，等等。雜種玉米種子典型地通過(guò)雄性不育體系結(jié)合手工或機(jī)械去除雄花穗來(lái)產(chǎn)生。將兩種近交系在田間作交替的帶狀種植，并將帶花粉的雄花穗從一種近交系(雌株)中去除。 假設(shè)充分地與外來(lái)的玉米花粉源隔離，去除雄花穗的近交系的雌穗將只從所述另一近交系 (雄株)獲得受精，因此得到的種子是雜種并將會(huì)形成雜種植物。通過(guò)使用本領(lǐng)域賦予遺傳雄性不育的許多方法之一(各具有自身的優(yōu)缺點(diǎn))可以避免采用這種費(fèi)力的、并有時(shí)不可靠的去除雄花穗方法。這些方法使用多種途徑，例如將編碼與雄性組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合的細(xì)胞毒性物質(zhì)的基因遞送入植物，或者反義系統(tǒng)(其中鑒別對(duì)生育力具有決定性的基因并將該基因的反義物插入進(jìn)該植物中)(見(jiàn)=Fabinjanski 等人，EPO 89/3010153. 8 publication no. 329，308和PCT application PCT/CA90/00037, 發(fā)表為 WO 90/08828)。玉米近交系的開發(fā)雄性不育的近交系的使用僅是開發(fā)玉米雜種的一個(gè)因素。本領(lǐng)域已知并用于玉米植物育種計(jì)劃的植物育種技術(shù)包括但不限于輪回選擇(recurrent selection)、回交、 譜系育種、限制性長(zhǎng)度多態(tài)性增強(qiáng)的選擇(restriction length polymorphism enhanced selection)、遺傳標(biāo)記增強(qiáng)的選擇和轉(zhuǎn)化。玉米植物育種計(jì)劃中玉米雜種的開發(fā)需要(一般而言)開發(fā)純合近交系，將這些系雜交并評(píng)價(jià)該雜交。譜系育種和輪回選擇育種方法用于從繁殖種群開發(fā)近交系。玉米植物育種計(jì)劃將來(lái)自兩種或更多種近交系或各種其它的種質(zhì)源(germplasm source)的遺傳背景組合成繁殖庫(kù)(breeding pool)，通過(guò)自交和選擇期望的表現(xiàn)型而從上述的繁殖庫(kù)中開發(fā)新的近交系。將新的近交系與其它近交系雜交并評(píng)價(jià)從這些雜交得到的雜種以確定那些雜種中哪些具有商業(yè)潛力。植物育種和雜種開發(fā)(如在玉米植物育種計(jì)劃中實(shí)踐的)是昂貴并耗時(shí)的過(guò)程。譜系育種開始于兩種基因型的雜交，所述的基因型各可以具有一種或多種另一基因型缺少的期望的特性或者兩種基因型彼此互補(bǔ)。如果這兩種最初的親本不能提供所有期望的特性，則可將其它的來(lái)源包括于繁殖種群中。在譜系法中，將優(yōu)良的植株自交并在連續(xù)世代中選擇。在隨后的世代中，由于自花授粉和選擇而使雜合情況讓位于純合品系。 典型地，在育種的譜系法中進(jìn)行五代或更多代的自交和選擇F1 — F2 ；F2 — F3 ；F3 — F4 ； F4 — F5 等。輪回選擇育種、回交可以例如用于改善近交系和使用這些近交系得到的雜種?；亟豢捎糜趯⑻囟ㄆ谕男誀顝囊环N近交系或來(lái)源轉(zhuǎn)移至缺少該性狀的近交系。這可以例如通過(guò)首先將優(yōu)良的近交系(輪回親本)與攜帶編碼目的性狀的合適基因的供體近交系(非輪回親本)雜交而完成。然后將這種雜交得到的子代與優(yōu)良的輪回親本回交，隨后在得到的子代中選擇具有從非輪回親本轉(zhuǎn)移的期望的性狀的子代。在五代或更多代的回交和選擇期望的性狀后，子代中控制被轉(zhuǎn)移的性狀的基因座將是純合的，但基本上所有其它的基因?qū)⑴c優(yōu)良的親本一樣。然后將最后的回交世代自交以產(chǎn)生對(duì)于被轉(zhuǎn)移的基因而言的純育子代。從含有所轉(zhuǎn)移的基因的近交系開發(fā)的雜種基本上與從沒(méi)有該轉(zhuǎn)移基因的相同近交系開發(fā)的雜種相同。原種(elite)近交系，即純育、純合的近交系，也可用作育種的起始材料或開發(fā)其它近交系的源群體。這些源于原種近交系的近交系可使用先前描述的譜系育種和輪回選擇育種方法開發(fā)。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)回交育種在玉米植物育種計(jì)劃中用于產(chǎn)生這些衍生系時(shí)，原種近交系可用作親本系或起始材料或源群體并可用作供體親本或輪回親本。玉米雜種的開發(fā)單交玉米雜種由兩種近交系雜交產(chǎn)生，這兩種近交系各具有與對(duì)方的基因型補(bǔ)充的基因型。第一代雜種子代命名為F1。在玉米植物育種計(jì)劃中商品化雜種的開發(fā)只尋求 Fl雜種植物。優(yōu)選的Fl雜種比它們的近交親本更有活力。這種雜種優(yōu)勢(shì)(hybridvigor或 heterosis)可以在許多多基因性狀，包括增加的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和增加的產(chǎn)量中顯示。在玉米植物育種計(jì)劃中玉米雜種的開發(fā)包括三個(gè)步驟(1)從各種種質(zhì)庫(kù)中選擇植物用于最初育種雜交；( 將從該育種雜交選擇的植物自交幾代以產(chǎn)生一系列的近交系，它們雖然彼此不同，但是純育的，并且是高度均質(zhì)的；并且(3)將選擇的近交系與不同的近交系雜交以產(chǎn)生雜種子代(F1)。在玉米的近交過(guò)程中，該系的優(yōu)勢(shì)降低。當(dāng)兩種不同的近交系雜交產(chǎn)生雜種子代(F1)時(shí)優(yōu)勢(shì)得以恢復(fù)。近交系的純合性和同質(zhì)性的重要價(jià)值是，一對(duì)確定的近交系之間的雜種將總是一樣的。一旦產(chǎn)生優(yōu)良雜種的近交系已經(jīng)確定，只要維持近交系親本的同質(zhì)性則可無(wú)限地再生產(chǎn)雜種種子。Fl雜種顯示的許多雜種優(yōu)勢(shì)在下一代(F2)中喪失。因此，雜種的種子不用于培植原種。雜種種子的產(chǎn)生需要除去或失活由母本產(chǎn)生的花粉。不完全地除去或失活該花粉提供了自花授粉的可能。這種非有意的自花授粉產(chǎn)生的種子可能會(huì)無(wú)意識(shí)地收獲并與雜種種子一起包裝。一旦種植該種子，可以鑒定并選出這些自花授粉的植株。這些自花授粉的植株在遺傳上等價(jià)于用于產(chǎn)生雜種的雌性近交系。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，前述的方法只是可以通過(guò)依賴于將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因型漸滲入至其它玉米系的那些手段獲得本發(fā)明的近交系的各種方法中的一些方法。其它的方法也是可獲得的，并且上述的實(shí)例只用作舉例說(shuō)明。
實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)參考下面詳細(xì)的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述。除非另外說(shuō)明，否則提供下列的實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明目的，并不旨于限定。在此使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并由 Ausubel (編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994) ；J. Sambrook ^A Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor, NY : Co Id Spring Harbor Laboratory Press (2001)； 以及 Τ. J. Silhavy> Μ. L. Berman 禾口 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)描述。實(shí)施例1. MIR604事件的轉(zhuǎn)化和選擇MIR604事件通過(guò)近交玉米(玉蜀黍)系A(chǔ)188的農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。I-型胚性(ambryogenic)愈傷組織用來(lái)自質(zhì)粒pZiC6的DNA片段(
圖1)，基本上如Negrotto等人描述的方法(Plant CellReports 19 =798-803,2000)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將此文獻(xiàn)在此引入作為參考。pZiC6包含含有串聯(lián)表達(dá)盒的核苷酸序列。第一個(gè)表達(dá)盒由有效連接至cry3A055編碼序列的MTL啟動(dòng)子序列(美國(guó)專利6，018，099)組成，其中cry3A055編碼序列進(jìn)一步有效連接至胭脂堿合酶3'末端轉(zhuǎn)錄終止序列和多腺苷酸化序列。第二個(gè)表達(dá)盒由有效連接至pmi編碼序列的玉米泛素(ubiquitin)啟動(dòng)子(ZmUbHnt) (Christensen等人，1992 PMB 18 675)組成，其中的pmi編碼序列進(jìn)一步有效連接至胭脂堿合酶3'末端轉(zhuǎn)錄終止序列和多腺苷酸化序列。將未成熟胚從8-12天齡的穗中切取并用新鮮培養(yǎng)基漂洗以便預(yù)備用于轉(zhuǎn)化。將胚與包含轉(zhuǎn)化載體PZIC6的農(nóng)桿菌細(xì)胞懸液混合，渦旋30秒，并再將其溫育5分鐘。吸去過(guò)量的農(nóng)桿菌溶液并然后將胚移至裝有非選擇性培養(yǎng)基的平板上。將胚和剩余的農(nóng)桿菌于 22°C在黑暗中共培養(yǎng)2-3天。將胚轉(zhuǎn)移至補(bǔ)加有羧噻吩青霉素鈉(ticarcillin) (IOOmg/ ml)和硝酸銀(1.6mg/l)的培養(yǎng)基中并在黑暗中培養(yǎng)10天。將產(chǎn)生胚性愈傷組織的胚轉(zhuǎn)移至含有甘露糖的細(xì)胞培養(yǎng)基中。通過(guò)TAQMAN PCR分析(見(jiàn)實(shí)施例2)測(cè)驗(yàn)再生的小植株是否存在pmi和 cry3A055基因，也測(cè)驗(yàn)其是否不存在抗生素抗性壯觀霉素(spectinomycin) (spec)基因。 將對(duì)于兩種轉(zhuǎn)基因呈陽(yáng)性并對(duì)spec基因呈陰性的植株轉(zhuǎn)移至溫室進(jìn)一步繁殖。使用對(duì)抗玉米根蟲的昆蟲生物測(cè)定法鑒定并篩選陽(yáng)性的事件。通過(guò)TAQMAN分析表征殺昆蟲的事件的拷貝數(shù)?；诰哂修D(zhuǎn)基因的單拷貝、通過(guò)ELISA鑒定的好的蛋白質(zhì)表達(dá)以及對(duì)抗玉米根蟲的好的殺昆蟲活性而選擇MIR604用于進(jìn)一步分析。將Ttl MIR604與近交玉米系CG00526回交，產(chǎn)生T1群體。將T1植株自花授粉產(chǎn)生 T2代，并且重復(fù)該過(guò)程產(chǎn)生T3代。采用T3植株的子代檢驗(yàn)鑒定純合的(轉(zhuǎn)化的)家族。將 MIR604-轉(zhuǎn)化的CG005^近交系與其它原種近交系雜交產(chǎn)生用于進(jìn)一步研究的雜種。實(shí)施例2.通過(guò) TAQMAN PCR 檢測(cè) MIR604TAQMAN 分析基本上如 hgham 等人(Biotechniques，31 132-140，2001)描述的方式進(jìn)行，在此將該文獻(xiàn)引入作為參考。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用Puregence 基因組DNA提取試劑盒(Gentra Systems, Minneapolis, MN)，除了所有的步驟在1.2ml 96孔的平板中進(jìn)行外， 基本上根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植物的葉中分離基因組DNA。將干燥后的DNA沉淀物再懸浮于TE緩沖液(IOMm Tris-HCl，pH8. 0，ImM EDTA)中。TAQMAN PCR反應(yīng)在96孔平板中進(jìn)行。對(duì)于內(nèi)源玉米基因?qū)φ眨O(shè)計(jì)特異于玉米醇脫氫酶(adh)基因(Genbank登記號(hào)AF04^%)的引物和探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解， 其它玉米基因也可以用作內(nèi)源對(duì)照。進(jìn)行多元反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增cry3A055和adh或pmi和 adh。對(duì)于每種樣品，母混合物(master mixture)通過(guò)將20 μ L提取的基因組DNA與35 μ L 2 X TAQMAN通用PCR Master Mix (Applied Biosystems)混合并補(bǔ)加引物至每種終濃度為 900nM、補(bǔ)加探針至每種終濃度為IOOnM以及補(bǔ)加水至終體積70 μ L而產(chǎn)生。將這種混合物分成同樣的3份，每份20yL于96-孔擴(kuò)增平板中并用光學(xué)透明的熱封薄膜(Marsh Bio Products)密封。使用下面的擴(kuò)增參數(shù)在ABI Prism 7700儀中進(jìn)行PCR 在50°C下2分鐘和在95°C下10分鐘，隨后做35次循環(huán)，每次在95°C下15秒鐘和在60°C下1分鐘。TAQMAN分析的結(jié)果表明事件MIR604具有cry3A055基因的一個(gè)拷貝和pmi基因的一個(gè)拷貝。使用的合適的引物/探針序列組合的實(shí)例是
權(quán)利要求
1.多核苷酸引物對(duì)，其含有第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，它們?cè)诖嬖谟衼?lái)自MIR604轉(zhuǎn)基因玉米植物的DNA模板時(shí)一起發(fā)揮作用而產(chǎn)生含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2或者其互補(bǔ)序列的擴(kuò)增子，其中a.第一多核苷酸引物序列是位于插入至玉米事件MIR604的MIR604玉米植物基因組中的異源DNA序列插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組或與該位于異源DNA序列插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組互補(bǔ)；并且b.第二多核苷酸引物序列是插入至MIR604玉米植物基因組中的異源DNA序列或與該異源DNA序列互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸引物對(duì)，其中a.第一多核苷酸引物含有至少10個(gè)來(lái)自SEQID NO 3中列出的位置1-801的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列，或者含有至少10個(gè)來(lái)自SEQ ID NO 4中列出的位置507-1570的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列；并且b.第二多核苷酸引物含有SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO :62 或 SEQ ID NO :63 或者 SEQ ID NO :58 至 SEQ ID NO :63 中任一個(gè)的互補(bǔ)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸引物對(duì)，其中第一多核苷酸引物含有選自SEQID NO 7 至SEQ ID NO 15及SEQ ID NO 7至SEQ ID NO 15的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸引物對(duì)，其中第一多核苷酸引物含有選自SEQID N0:39 至SEQ ID NO 46及SEQ ID NO 39至SEQ ID NO 46的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸引物對(duì)，其中第二多核苷酸引物含有選自SEQID N0 16 至SEQ ID NO 38及SEQ ID NO 16至SEQ ID NO 38的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸引物對(duì)，其中第一多核苷酸引物在SEQID N0:15中列出，而第二多核苷酸引物在SEQ ID N0:28中列出。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸引物對(duì)，其中第一多核苷酸引物在SEQID N0:45中列出，而第二多核苷酸引物在SEQ ID N0:27中列出。
8.一種檢測(cè)來(lái)自MIR604轉(zhuǎn)基因玉米植物的DNA存在的方法，所述的方法包括a.將該樣品與第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物接觸，所述的第一和第二多核苷酸引物能在存在來(lái)自MIR604轉(zhuǎn)基因玉米植物的DNA模板時(shí)，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中一起發(fā)揮作用而產(chǎn)生能鑒別該MIR604玉米植物的擴(kuò)增子；b.進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生該擴(kuò)增子；和c.檢測(cè)該擴(kuò)增子，其中第一多核苷酸引物含有這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列是位于插入至玉米事件 MIR604的玉米植物基因組中的異源DNA序列插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組或與該位于異源DNA序列插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米植物基因組互補(bǔ)；并且第二多核苷酸引物含有這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列是插入至MIR604玉米植物基因組中的異源DNA序列或與該異源DNA序列互補(bǔ)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中該擴(kuò)增子含有選自SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4及SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 4的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中第一多核苷酸引物含有包含至少10個(gè)來(lái)自SEQIDNO 3中列出的位置1-801的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列，或者含有至少10個(gè)來(lái)自SEQ ID NO 4中列出的位置507-1570的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中第一多核苷酸引物序列選自SEQID N0:7至SEQ ID NO 15 及 SEQ ID NO 7 至 SEQ ID NO 15 的互補(bǔ)序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中第一多核苷酸引物序列選自SEQID N0:39至SEQ ID NO 46 及 SEQ ID NO 39 至 SEQ ID NO 46 的互補(bǔ)序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中第二多核苷酸引物含有這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列包含 SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID N0:61、SEQ ID NO :62 或 SEQ ID NO 63或者SEQ ID NO 58至SEQ ID NO 63中任一個(gè)的互補(bǔ)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中第二多核苷酸引物序列選自SEQID N0:16至SEQ ID NO 38 及 SEQ ID NO 16 M SEQ ID NO 38 的互補(bǔ)序列。
15.一種在生物學(xué)樣品中檢測(cè)來(lái)自MIR604轉(zhuǎn)基因玉米植物的DNA的方法，所述的方法包括a.將含有DNA的樣品與多核苷酸探針接觸，所述探針能在高度嚴(yán)格條件下與MIR604 DNA雜交并且在高度嚴(yán)格條件下不與來(lái)自不同于MIR604的玉米植物的DNA雜交；b.將樣品和探針接受所述高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件；和c.檢測(cè)探針與事件MIR604DNA的雜交。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中該探針含有選自SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4及SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 4的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件包括于50°C，在7% 十二烷基硫酸鈉、0.5M NaPO4UmM EDTA中雜交，并于65°C，在0. 1 XSSC、0. 1 %十二烷基硫酸鈉中洗滌。
全文摘要
公開了一種命名為MIR604的新的轉(zhuǎn)基因玉米事件。本發(fā)明涉及產(chǎn)生MIR604事件的、插入至玉米基因組中的重組構(gòu)建體的DNA序列和插入位點(diǎn)側(cè)翼基因組序列的DNA序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)MIR604的DNA序列存在的測(cè)定法，涉及含有MIR604基因型的玉米植物和玉米種子，并涉及通過(guò)將含有MIR604基因型的玉米植物與自身或另一玉米品種雜交來(lái)產(chǎn)生玉米植物的方法。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102260668SQ201110116310
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者E·陳, H·斯坦納, M·梅格希吉 申請(qǐng)人:辛根塔參與股份公司