專利名稱：人CD3+CD8+γδT淋巴細(xì)胞的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種T淋巴細(xì)胞的保存方法，特別涉及人⑶3+⑶S+ysT淋巴細(xì)胞的保存方法。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞是具有特異免疫識(shí)別功能的細(xì)胞系，人和哺乳類動(dòng)物的淋巴細(xì)胞系是由形態(tài)相似、功能各異的不均一細(xì)胞群所組成。按其個(gè)體發(fā)生、表面分子和功能的不同，可將淋巴細(xì)胞系分為τ細(xì)胞和B細(xì)胞二個(gè)亞群。其中的T細(xì)胞是由一群功能不同的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞組成，由于它在胸腺內(nèi)分化成熟故稱為T細(xì)胞。成熟T細(xì)胞由胸腺遷出，移居于周圍淋巴組織中淋巴節(jié)的副皮質(zhì)區(qū)和脾白髓小動(dòng)脈的周圍。不同功能成熟的T細(xì)胞均屬小淋巴細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)上不能區(qū)分，但可借其細(xì)胞膜表面分子不同加以鑒別。在T細(xì)胞發(fā)育不同階段以及成熟T細(xì)胞在靜止期和活化期，其細(xì)胞膜分子表達(dá)的種類和數(shù)量均不相同。由于這些分子在T細(xì)胞表面相當(dāng)穩(wěn)定，故可視為T細(xì)胞的表面標(biāo)志，可以用以分離、鑒定不同功能的T 細(xì)胞。這些分子的單克隆抗體對(duì)臨床相關(guān)疾病的診斷和治療也具有重要應(yīng)用價(jià)值。其中， TCR(Τ cell receptor)是T細(xì)胞識(shí)別蛋白抗原的特異性受體，不同的T細(xì)胞克隆其抗原識(shí)別受體的分子結(jié)構(gòu)也是不相同的。TCR有兩種類型，均由兩條不同的跨膜的多肽鏈組成，即 α β TCR和γ δ TCR0大多數(shù)成熟T細(xì)胞(約占95% )的TCR分子是由α和β 二條異二聚體肽鏈組成的α β TCR分子。TCR γ δ細(xì)胞多見于胸腺內(nèi)早期T細(xì)胞(⑶4_，⑶8_，TCR Y S+)，而在人周圍血成熟T細(xì)胞(⑶3+，TCR γ δ+)中所占的比例甚少，約為 10%。 對(duì)這種新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞的生理功能尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞的保存方法。本發(fā)明所提供的人⑶3+CD8+Y sT淋巴細(xì)胞的保存方法，包括如下步驟將人CD3+CD8+Y sT淋巴細(xì)胞在由如下配比的物質(zhì)組成的無菌保存液中保存枸櫞酸鈉 (C6H5Na3O7 ·2Η20) 13. 2g、枸櫞酸(C6H8O7 ·Η20)4· 8g、葡萄糖(C6H12O6 ·Η20) 14. 7g 和水 1000ml。所述人⑶3+CD8+Y sT淋巴細(xì)胞在所述無菌保存液中的含量是(2- X IO9個(gè)細(xì)胞/ L；所述人⑶3+⑶8+Y 5T淋巴細(xì)胞表達(dá)如下三種T淋巴細(xì)胞膜分子人白細(xì)胞分化抗原⑶3、人白細(xì)胞分化抗原⑶8和人Y sT細(xì)胞受體。所述無菌保存液的ρΗ是7. 2-7. 4。所述保存的溫度為2_8°C，最好是4°C。在上述溫度和培養(yǎng)基中，所述保存的時(shí)間為可為12-M小時(shí)，如M小時(shí)。實(shí)驗(yàn)證明，人⑶3+CD8+Y sT淋巴細(xì)胞在上述無菌保存液中在4°C保存M小時(shí)，仍表達(dá)如下三種T淋巴細(xì)胞膜分子人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人ysT細(xì)胞受體。


圖1為肺癌病史2年的男患者人⑶3+CD8+Y sT淋巴細(xì)胞治療前后CT檢查對(duì)比。箭頭示肺癌病灶及轉(zhuǎn)移灶A(yù)為肺窗的CT檢查結(jié)果上左為2009. 08. 04日輸注實(shí)施例1分離的人⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞前的結(jié)果上右為2009. 09. 22日的CT檢查結(jié)果下左為2009. 11. 19日的CT檢查結(jié)果下右為2010. 03. 07日的CT檢查結(jié)果B為縱隔窗的CT檢查結(jié)果上左為2009. 08. 04日輸注實(shí)施例1分離的人⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞前的結(jié)果上右為2009. 09. 22日的CT檢查結(jié)果下左為2009. 11. 19日的CT檢查結(jié)果下右為2010. 03. 07日的CT檢查結(jié)果C為轉(zhuǎn)移胸椎病灶逐漸硬化的CT檢查結(jié)果從左至右依次為2009. 08. 04日輸注實(shí)施例1分離的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞前的結(jié)果、2009. 09. 22日的CT檢查結(jié)果、2009. 11. 19日的CT檢查結(jié)果和2010. 03. 07日的CT
檢查結(jié)果D為轉(zhuǎn)移肋骨逐漸變小硬化的CT檢查結(jié)果從左至右依次為2009. 08. 04日輸注實(shí)施例1分離的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞前的結(jié)果、2009. 09. 22日的CT檢查結(jié)果、2009. 11. 19日的CT檢查結(jié)果和2010. 03. 07日的CT
檢查結(jié)果E為轉(zhuǎn)移椎體逐漸硬化的CT檢查結(jié)果從左至右依次為2009. 08. 04日輸注實(shí)施例1分離的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞前的結(jié)果、2009. 09. 22日的CT檢查結(jié)果、2009. 11. 19日的CT檢查結(jié)果和2010. 03. 07日的CT
檢查結(jié)果F為各胸椎骨質(zhì)破壞區(qū)逐漸密度增高硬化的CT檢查結(jié)果從左至右依次為2009. 08. 04日輸注實(shí)施例1分離的人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞前的結(jié)果、2009. 09. 22日的CT檢查結(jié)果、2009. 11. 19日的CT檢查結(jié)果和2010. 03. 07日的CT
檢查結(jié)果圖2為肺癌病史6年的女患者人⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞治療前后CT檢查對(duì)比圖3A為人⑶3+CD8+Y、淋巴細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)人白細(xì)胞分化抗原⑶3的表達(dá)情況圖;3B為人⑶3+CD8+Y、淋巴細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)人白細(xì)胞分化抗原⑶8的表達(dá)情況圖3C為人⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)人Y 5T細(xì)胞受體的表達(dá)情況
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。RPMI 1640為GENMED公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號(hào)為GMS12049. 2A ；人AB血漿購自北京紅十字血液中心；注射用重組人白細(xì)胞介素-2(國藥準(zhǔn)字S10970016)。實(shí)施例1、人⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞的保存1、人CD3+CD8+YST淋巴細(xì)胞的分離1)將血站在6- 內(nèi)采集的人三聯(lián)袋血液配平后放置在大容量冷凍離心機(jī)內(nèi)，以離心力1160Xg，溫度4士2°C，離心8分鐘。2)停機(jī)后輕輕取出血袋置于分漿夾上，將上層血漿連同白膜層及靠近白膜層 1. 5-2. Ocm的紅細(xì)胞一起擠入轉(zhuǎn)移袋內(nèi)。3)將離心機(jī)按要求預(yù)熱(溫度22士2°C )。4)將多聯(lián)袋中保養(yǎng)液加入紅細(xì)胞中成為少漿血，用高頻熱合機(jī)將少漿血切斷。剩余二聯(lián)袋配平后，以；3500轉(zhuǎn)，溫度22 士 2°C，離心8分鐘。5)離心后分出上層血漿至轉(zhuǎn)移袋，留下約15ml血漿，剩下的血漿及白膜層即為白細(xì)胞血小板懸液。6)制備完畢，微機(jī)錄入后立即入待檢庫于22士2°C血小板振蕩保存箱中保存。保存有效期為Mh。7)采用FicolΙ-hypaque法從白細(xì)胞血小板懸液分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。具體方法如下用PBS將白細(xì)胞血小板懸液1倍稀釋后，加到Ficoll-hypaque分離液上，稀釋的白細(xì)胞血小板懸液分離液約為1 1。用水平離心機(jī)以2000r/min離心20min離心后，單個(gè)核細(xì)胞位于血漿和分離液的界面層，吸取界面單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS稀釋后2000r/min離心IOmin洗二次。8)將所分離的PBMC培養(yǎng)于37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為人⑶3+⑶8+Y s T淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基。該人⑶3+⑶S+ysT淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基是在RPMI 1640培養(yǎng)基中添加人AB血漿、異戊烯焦磷酸和人白細(xì)胞介素-2 (IL-幻得到的培養(yǎng)基，人AB血漿在該人CD3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是10 % (體積百分濃度)，異戊烯焦磷酸在該人CD3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是100 μ g/L，人白細(xì)胞介素-2在該人 ⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基中的濃度是60萬U/L。該人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基的PH為7. 2-7. 4。每2-3天在該人⑶3+CD8+Y 5T淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基中傳代一次， 使細(xì)胞濃度維持在(5 10) X IO5個(gè)細(xì)胞/mL。每次傳代培養(yǎng)的條件均為37°C，5% C02。傳 5代得到人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞。該人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞用抗人⑶3單克隆抗體通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)人白細(xì)胞分化抗原CD3的表達(dá)情況，用抗人CD8單克隆抗體通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)人白細(xì)胞分化抗原CD8的表達(dá)情況，用抗人TCR γ δ單克隆抗體通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)人ysT細(xì)胞受體的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3Α、圖;3Β和圖3C所示，表明該人⑶3+⑶S+ysT淋巴細(xì)胞表達(dá)人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人ysT細(xì)胞受體。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明該人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞的純度達(dá)到95%。2、人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞的活性均經(jīng)過一個(gè)療程的化療(一周1次化療，共6周)的53例腫瘤患者，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。治療組22例腫瘤患者，其中臨床診斷為胃癌患者5例，臨床診斷為結(jié)腸癌患者6例，臨床診斷為肺癌患者11例。對(duì)照組31例，其中臨床診斷為胃癌患者7例，臨床診斷為結(jié)腸癌患者8例，臨床診斷為肺癌患者16例。將步驟1得到的人⑶3+CD8+Y S T淋巴細(xì)胞加入由如下配比的物質(zhì)組成的無菌保存液(血液保存液II)中進(jìn)行保存枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7 · 2Η20) 13. 2g、枸櫞酸 (C6H8O7 -H2O) 4. 8g、葡萄糖(C6H12O6 -H2O) 14. 7g 和水 1000ml。該無菌保存液的 pH 是 7. 2-7. 4。 人CD3+CD8+YST淋巴細(xì)胞在該無菌保存液的含量是(2-3) X IO7個(gè)細(xì)胞/(30-50)ml。在4°C 保存10-12小時(shí)，作為給患者回輸?shù)娜刷?+⑶S+ysT淋巴細(xì)胞懸液。治療組的22例腫瘤患者化療藥停止后72小時(shí)給予靜脈回輸上述人⑶3+CD8+Y 5T 淋巴細(xì)胞懸液。每位患者一次性輸入30-50ml上述人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞懸液，在30分鐘內(nèi)輸完。即每位患者一次性輸入上述人⑶3+⑶S+ysT淋巴細(xì)胞(2- X IO7個(gè)細(xì)胞。對(duì)照組的患者在化療后不進(jìn)行治療。各位患者在化療前、化療藥停止后72小時(shí)人CD3+CD8+Y 5T 淋巴細(xì)胞回輸前、人⑶3+⑶8+YST淋巴細(xì)胞回輸后3天檢測(cè)外周血象WBC、PLT。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞回輸后腫瘤患者的外周血WBC、PLT升高明顯， *P < 0. 05。說明人⑶3+⑶8+Y sT淋巴細(xì)胞可明顯緩解骨髓抑制(表1)。表1治療組和對(duì)照組化療后外周血象WBC、PLT變化情況
權(quán)利要求
1.人T淋巴細(xì)胞的保存方法，包括如下步驟將人T淋巴細(xì)胞在由如下配比的物質(zhì)組成的無菌保存液中保存枸櫞酸鈉13. 2g、枸櫞酸4. Sg、葡萄糖14. 7g和水IOOOml ；所述人T淋巴細(xì)胞在所述無菌保存液中的含量是(2- X IO9個(gè)細(xì)胞/L ； 所述人T淋巴細(xì)胞表達(dá)如下三種T淋巴細(xì)胞膜分子人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人Y sT細(xì)胞受體； 所述無菌保存液的PH是7. 2-7. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述保存的溫度為2-8°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述保存的溫度為4°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述保存的時(shí)間為12-M小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述保存時(shí)間為M小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了人CD3+CD8+γδT淋巴細(xì)胞的保存方法。該人CD3+CD8+γδT淋巴細(xì)胞的保存方法，包括如下步驟將人CD3+CD8+γδT淋巴細(xì)胞在由如下配比的物質(zhì)組成的無菌保存液中保存枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)13.2g、枸櫞酸(C6H8O7·H2O)4.8g、葡萄糖(C6H12O6·H2O)14.7g和水1000ml；所述人CD3+CD8+γδT淋巴細(xì)胞表達(dá)如下三種T淋巴細(xì)胞膜分子人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人γδT細(xì)胞受體；所述無菌保存液的pH是7.2-7.4。人CD3+CD8+γδT淋巴細(xì)胞在上述無菌保存液中在4℃保存24小時(shí)，仍表達(dá)如下三種T淋巴細(xì)胞膜分子人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人γδT細(xì)胞受體。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102265819SQ20111016269
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者劉 英, 初碧珠, 蔣宇揚(yáng), 陳喆 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院