專利名稱：賦予植物黃萎病抗性的Gbvdr5基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一個賦予植物黃萎病抗性的必^ZrS基因及應(yīng)用，涉及植物基因克隆以及功能分析，屬于植物基因工程領(lǐng)域。用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物抗病性和其他有益生產(chǎn)性狀。背景技術(shù)：
黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae )和黑白輪枝菌(Jerticillium albo-atrum)侵染引起的廣泛存在于世界各地區(qū)的最嚴(yán)重的土傳真菌性維管束系統(tǒng)病害。病原物以微菌核(microsclerotia)形式長期存在于土壤中，受到根分泌物的刺激而萌發(fā)，形成的芽管侵染植物根部，在根部皮層的細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)生長，最終蔓延到木質(zhì)部以及整個植株(Veronese P, Narasimhan M L, Stevenson R A, et al. Identification of a locus controlling Verticillium disease symptom response in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2003，35:574 - 587.)。黃萎菌屬非專性寄生菌，寄主十分廣泛，不同菌系間致病力懸殊。病原菌在寄主植物上所表現(xiàn)的致病性差異是病原菌與寄主植物互作的程度不同所造成的，在與寄主相互作用、協(xié)同進化及生態(tài)環(huán)境差異的影響下，常產(chǎn)生生理分化，出現(xiàn)新的致病類型。對于棉花黃萎病的分類，根據(jù)病菌侵染后引起棉花葉片落葉與否， 把病菌分為落葉型或非落葉型；用病菌人工接種棉花品種后，根據(jù)品種的抗感反應(yīng)，將病菌分為致病力強、中、弱等不同的致病類群。張?zhí)煺娴扔肦APD指紋圖譜聚類分析將我國棉花黃萎病菌株劃分為8類，但是同一類中可能同時含有強中弱致病菌，說明黃萎病致病機制十分復(fù)雜(張?zhí)煺?，周兆華，閔留芳，等.棉花對黃萎病的抗性遺傳模式及抗(耐)病品種的選育技術(shù).作物學(xué)報，26 (6) 673-680.)。關(guān)于黃萎病的抗性機制一直都存在兩種不同的結(jié)論一種認(rèn)為陸地棉的抗(耐) 病性為質(zhì)量性狀遺傳，另一種認(rèn)為黃萎病抗(耐)性屬于數(shù)量性狀遺傳。但是通過大量的實驗證明，溫室或生長室單一菌系苗期接種鑒定時，多傾向于抗性由顯性單基因控制， 而在田間病圃鑒定并在生長后期調(diào)查時，多傾向于抗性呈數(shù)量性狀遺傳，加性、顯性和上位性基因效應(yīng)都存在，但以加性效應(yīng)為主。這表明不同菌系的抗性品種可能存在不同的抗性基因(房衛(wèi)平，祝水金，季道藩.棉花黃萎病菌與抗黃萎病遺傳育種研究進展.棉花學(xué)報，2001，13(2) 116-120.)。黃萎病菌的寄主范圍極為廣泛，早期報道的寄主植物達660種，在農(nóng)作物中除了侵染棉花之外，常見的侵染寄主還有番茄、土豆、茄子、花生、橄欖等，但是一般不侵染禾本科的植物(趙鳳軒，戴小楓.棉花黃萎病菌的侵染過程.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2009, 28(4), 786-792)。在對黃萎病的研究中，由于生產(chǎn)中黃萎病對于棉花，番茄的影響較大，所以相關(guān)研究最多。擬南芥作為模式植物，由于其易感黃萎病，研究方便快捷，其與黃萎病的互作、生理生化影響等都可以作為研究其他植物的借鑒，所以關(guān)于擬南芥對黃萎病的相關(guān)抗性研究也較多。如通過對擬南芥相關(guān)突變體進行研究，發(fā)現(xiàn)乙烯和ABA信號通路突變體的抗性明顯增強，說明乙烯和ABA信號通路影響黃萎病抗性，而水楊酸(SA) 和茉莉酸甲酯(MJ)信號通路與黃萎病抗性并沒有明顯關(guān)系(Veronese P, Narasimhan M
3L, Stevenson, R A, et al. Identification of a locus controlling Verticillium disease symptom response in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2003, 35:574 - 587； Pantelides I, Tjamos S E, Paplomatas E J. Ethylene perception via ETRl is required in Arabidopsis infection by Verticillium dahliae. Molecular Plant Pathology, 2010，11: 191-202)。很多抗病基因在擬南芥上最先進行驗證，不僅快捷而且可以有效地應(yīng)用于生產(chǎn)。棉花非共生血紅蛋白基因(必//似)受病原菌誘導(dǎo)增量表達，將該基因在擬南芥中過量表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對假單胞桿菌和黃萎病的抗性大大增強(Qu Zhan-Liang, Zhong Nai-Qin, Wang Hai-Yun, et al. Ectopic Expression of the Cotton Non-symbiotic Hemoglobin Gene GhHbdl Triggers Defense Responses and Increases Disease Tolerance in Arabidopsis. Plant and Cell Physiology, 47(8):1058-1068)。一直以來，黃萎病抗性基因的克隆都是抗病研究的熱點與難點，2001年抗病基因克隆在番茄中取得了突破，Kawchuk等利用圖位克隆從番茄抗黃萎病材料中克隆了抗病基因Vel，Ve2。它們屬于表面受體蛋白(RLPs)，具有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外富含亮氨酸重復(fù) (LRRs)結(jié)構(gòu)域。通過LRRs這種結(jié)構(gòu)識別并結(jié)合病原物蛋白質(zhì)，參與抗病信號傳遞，誘導(dǎo)植物防衛(wèi)基因的表達，使植物獲得系統(tǒng)抗性。已經(jīng)證明該類蛋白在植物很多抗病過程中起著重要的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)這2個基因位于一個位點，分別轉(zhuǎn)入感病土豆中，轉(zhuǎn)Vel 和Ve2基因的土豆都表現(xiàn)為抗黃萎病生理小種1 (Kawchuk L M, Hachey J, Lynch D R, et al. Tomato Ve disease resistance genes encode cell surface-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 1999，98(11) : 6511-6515·)。但是后來的研究卻發(fā)現(xiàn)，只有 Vel具有抗性，Ve2沒有抗性。Fradin等對番茄4個抗病品種和2個感病品種的Vel和Ve2 進行序列比較分析，發(fā)現(xiàn)在所有感病品種中，Vel基因都在1220bp處出現(xiàn)終止密碼子，而抗病品種的Vel基因都有完整的讀碼框(Fradin E F, Zhang Z, Juarez Ayala J C, et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Vel. Plant Physiology, 2009, 150:320-332. 7)。Ve基因的克隆使利用轉(zhuǎn)基因獲得抗性材料成為可能。陳玉輝等將來源于水茄的Vel相似基因MVe轉(zhuǎn)化番茄，轉(zhuǎn)基因番茄葉片總可溶蛋白具有抑制番茄黃萎病菌生理小種1生長的作用(陳玉輝，趙凌俠，柴友榮，等.抗黃萎病基因MVe轉(zhuǎn)化番茄的研究.園藝學(xué)報，2008，35(5) 693-700)。黃萎病嚴(yán)重威脅棉花、番茄等農(nóng)作物產(chǎn)量與品質(zhì)，已經(jīng)成為農(nóng)作物生產(chǎn)的重要限制因子之一。發(fā)掘和推廣抗黃萎病能力強的品種一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個重要課題。但是抗黃萎病資源缺乏，是棉花抗黃萎病育種的主要限制。我國現(xiàn)存棉花品種資源中高抗黃萎病的資源多為海島棉W barbadense L)，如海島棉品種H71M高抗落葉型和非落葉型黃萎病(朱龍付，涂禮莉，張獻龍，等.黃萎病菌誘導(dǎo)的海島棉抗病反應(yīng)的SSH文庫構(gòu)建及分析.遺傳學(xué)報，2005，32 (5) 5觀-532)。雖然海島棉抗性很好、植株高大、生長勢強，但是其生育期很長、鈴小、在我國大部分棉區(qū)不僅成熟晚、而且產(chǎn)量較低。另外，利用常規(guī)雜交育種方法將海島棉中的抗性基因轉(zhuǎn)入陸地棉，要進行大量的雜交，再進行多代回交和定向選擇等育種方法，這需要很長時間和巨大的工作量，而植物基因工程的發(fā)展則為培育抗病品種提供了一條嶄新的途徑。通過對棉花黃萎病抗性機制進行多年分析，確認(rèn)棉花基因組中可能存在多個抗病基因，這些抗病基因?qū)Σ煌牟≡》N具有專一抗性。而Ve基因?qū)儆赗LPs類基因，這類基因多以基因簇形式存在，這種結(jié)構(gòu)特征為專一性識別病原菌小種提供條件。另外，棉花轉(zhuǎn)基因方法的不斷成熟完善為轉(zhuǎn)基因育種提供了重要的保證，通過多基因轉(zhuǎn)化或聚合育種，將多個抗性基因轉(zhuǎn)化得到抗性更為良好可以應(yīng)用于育種的核心種質(zhì)，可以大大加快育種進程，是未來抗病育種的一個長期趨勢。黃萎病病原菌變化多變異快，只有從抗性棉花材料中分離出更多的抗性基因，才能為進一步研究其抗性機制并利用轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制抗性新種質(zhì)成為可能。棉花黃萎病抗性基因Gbvdr5的分離可以進一步豐富抗性基因資源，其功能研究為該類基因的進一步利用奠定基礎(chǔ)。三、發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供了一個賦予植物黃萎病抗性的Gbvdr5基因，該基因編碼一個表面受體蛋白基因。該基因受黃萎病病原菌誘導(dǎo)后表達量顯著增加。該基因過量表達可以顯著提高受體植物對落葉和非落葉型黃萎病病原菌V991和Bp2的抗性?？梢岳帽景l(fā)明基因構(gòu)建成各種植物表達載體，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種以提高作物抗病性狀。技術(shù)方案
本發(fā)明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一個棉花抗病相關(guān)基因必^ZrS屬于植物基因工程領(lǐng)域，該基因來源于海島棉品種H7124。必rai^是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列或部份DNA序列； 2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE (15mM NaCl, ImM NaH2PO4, 0. ImM EDTA)、 0. IXSSC (15mM NaCl, 1. 5mM檸檬酸鈉)、0. SDS (十二烷基磺酸鈉)的溶液中，65°C條件下洗膜。序列表中的SEQ ID NO. 1由3234個堿基組成，自5，端第1位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點，記為+1 ；第3234位堿基為轉(zhuǎn)錄終止位點。完整編碼框長度為3234個堿基，編碼蛋白含1078個氨基酸，分子量為118KD，等電點為6. 32。盡管該基因與Vel、Ve2的相似性只有 50%左右，但它與LRR-TM類抗病基因結(jié)構(gòu)類似，同樣含有LRR重復(fù)單元和跨膜區(qū)。比較分析發(fā)現(xiàn)該基因含有12個LRR保守結(jié)構(gòu)域，N端和C端各有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，將該基因命名為 GbVdr50本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因的表達載體和宿主菌以及擴增該基因的任一片段的引物。本發(fā)明賦予植物黃萎病抗性的必κ ^基因，該基因受棉花黃萎病強致病力菌株 V991 (徐榮旗，汪佳妮，陳捷胤等.棉花黃萎病菌T-DNA插入突變體表型特征和側(cè)翼序列分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(3): 489-496)和Bp2 (張?zhí)煺?，周兆華，閔留芳，等. 棉花對黃萎病的抗性遺傳模式及抗(耐)病品種的選育技術(shù).作物學(xué)報，2000，26(6): 673-680)的誘導(dǎo)后表達量增加，將必κ ^與35S啟動子構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥植株，結(jié)果該基因過量表達可以明顯延遲黃萎病發(fā)病，并大幅降低病指，說明該基因具有對棉花黃萎病強致病力菌株V991和Bp2的抗性?？梢岳帽景l(fā)明基因構(gòu)建成各種植物表達載體，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種以提高黃萎病相關(guān)寄主植物的抗病性狀或用在棉花黃萎病抗性改良中。Gbvdr5的功能研究可為揭示其表達調(diào)控機理以及具體功能打下基礎(chǔ)，還可應(yīng)用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。有益效果
1、本發(fā)明獲得了一個全新的賦予植物黃萎病抗性的必^ZrS基因。本發(fā)明獲得的必廠基因來源于高抗黃萎病材料海島棉品種H7124，該基因是一個全新的受體蛋白類基因，BLAST搜索沒有與其高度同源的相似基因。該基因受棉花黃萎病病原菌誘導(dǎo)后表達量明顯上升。將必κ ^與35S啟動子構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥植株，結(jié)果該基因過量表達可以明顯延遲黃萎病發(fā)病，并大幅降低病指，說明其具有對棉花黃萎病強致病力菌株V991 和Βρ2的抗性。Gbvdr5的分離可以進一步豐富抗性基因資源，其功能研究為該類基因的進一步利用奠定基礎(chǔ)。、本發(fā)明有助于更好地了解抗病基因的作用機制。Gbvdr5的克隆為進一步了解病原菌與抗病基因互作，抗病信號傳導(dǎo)通路奠定基礎(chǔ)。必κ ^是怎樣將抗性信號傳導(dǎo)的，哪些基因參與了信號傳導(dǎo)過程，可以利用該基因過量表達植株進行進一步分析，從而獲得抗性信號傳導(dǎo)通路，所以必κ ^的分離以及功能鑒定為研究抗病基因的作用機制奠定基礎(chǔ)。、本發(fā)明應(yīng)用于黃萎病抗性育種。必κ ^抗性效果良好，并且明顯延遲落葉和非落葉型黃萎病發(fā)病時間，并且大幅降低病指，所以在育種中有較大的應(yīng)用價值。四

圖1 G_r5,番茄和番茄feJ 的氨基酸序列相似性比較。VeJ (索取號 AF272367_1), Ve2 (索取號AF365929_1 )。圖2 GbVdr5的結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。LRR為富含亮氨酸重復(fù)序列。圖3偽在不同器官中的表達。偽Κ ^為目的基因，組蛋白為內(nèi)參。圖4棉花黃萎病病原菌處理Η71Μ后2d和4d后偽Κ ^的表達。CK，水處理； V991-2d, V991-4d，落葉型強致病力菌株V991處理2天和4天；Bp2_2d，Bp2_4d 非落葉型強致病力菌株Bp2處理2天和4天；M，Marker。圖 5過量表達載體 PCAMBIA2301-35S-GbVdr5 的構(gòu)建。圖6必Κ ^轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測。A，DNA水平檢測；B，RNA水平檢測；Μ， Marker: λ -EcoT14 I digest (TAKARA 公司，產(chǎn)品編號D3401A)。CK1，CK2 為未轉(zhuǎn)化植株； 1-9為卡那霉素篩選出的抗性轉(zhuǎn)化株。圖7落葉型和非落葉型黃萎病菌系V991和Bp2處理GbVdr5轉(zhuǎn)化植株和對照株的平均病指調(diào)查。17d，20d, 23d，26d分別為接種后天數(shù)；CK為未轉(zhuǎn)化植株-,GbVdr5為轉(zhuǎn)化株。圖8必Κ ^提高受體植物的黃萎病抗性。Α，C分別為用落葉型和非落葉型強致病力菌株V991和Βρ2接種未轉(zhuǎn)化株(CK)后的表型；B，D分別為用落葉型和非落葉型強致病力菌株V991和Βρ2接種必^ZrS轉(zhuǎn)化株后的表型。五具體實施例方式
下述實施方式中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物序列均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。本實驗中基因來源于海島棉品種Η7124 (Gossypium barbadense )，該品種高抗黃萎病。擬南芥品種為哥倫比亞型，該品種易感黃萎病(Lin X，Kaul S, Rounsley S, Shea TP, et al. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaiiana. Nature 1999； 16;402(6763):761-8.)。(一)棉花GbVdr5克隆以及序列分析
根據(jù)Gene Index中一段棉花EST序列(登錄號TC121084)設(shè)計引物5’ -TTCTGGTCCAATACCATCATTCT-3，，5，-CTTAGATTCAGTACTCCAAGAGA-3，擴增陸地棉 DNA 模板，得到約1Kb左右條帶，將該片段測序，發(fā)現(xiàn)其與原來的EST片段只有76%的相似度， 該片段編碼1個全新的棉花表面受體蛋白基因，根據(jù)該片段設(shè)計引物通過染色體步移進一步得到了該基因的全長序列，將該基因命名為^KiZrJ (專利棉花黃萎病抗病相關(guān)基因fi^Ki/rJ 及其應(yīng)用，申請?zhí)?01110066390. 9)。由于這類表面受體蛋白基因在基因組中有很多相似序列，為了得到更多的這類基因，根據(jù)必Ki/rJ 設(shè)計引物(ihVdr2-F595:5’ -CTTGATGGGGTGAATATTAGAGCA-3，，GhVdr2-R1021 :5，-ATTGCCCAAGGTTACCGATAGAAT-3，擴增陸地棉D(zhuǎn)NA模板。用得到的約400bp片段作為探針篩選棉花BAC(細(xì)菌人工染色體組)文庫(構(gòu)建文庫所用棉花品種為maxxa，文庫來源于Clemson University)，共得到40個BAC陽性克隆。對陽性克隆C9進行序列分析發(fā)現(xiàn)，它含有1個具有完整閱讀框的表面受體蛋白基因，該基因編碼的氨基酸序列與必Ki/rJ 具有63%的相似性。為了進一步得到H71M中該基因的序列，設(shè)計擴增基因全長的引物 F64- BamHl 5，_CTTGGATCC GCATACATTGTAGCGTGAGATAA-3，， R3488-Kpnl: 5，- CTAAGGTACC AAAACAGCATACAGTGGAAACAG-3，。引物末端分別帶有限制性內(nèi)切酶BamHl和Kpnl的識別位點，為構(gòu)建植物表達載體做準(zhǔn)備。用這對引物擴增海7124的cDNA模板，在25μ 1反應(yīng)體系中加入cDNA模板1μ 1，引物各5 nmol,5y 1 5XprimeSTAR buffer (Mg2+ plus) PCR 緩沖液，0· 2 mM dNTP, 1 U primeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa 公司)進行 PCR 擴增。PCR 擴增條件為-MV 3，后 94°C 45，，，56°C 45’’，72°C 3’，循環(huán)36次，再72°C延伸10’。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測。得到約 3. 5Kb片段，將該片段進行末端加A處理(北京天恩澤基因科技有限公司)并與pGEM-T easy 載體(Promega公司)連接。連接產(chǎn)物用JM1090 (北京全式金生物技術(shù)有限公司)感受態(tài)細(xì)胞進行熱激轉(zhuǎn)化。測序由上海英俊生物工程公司完成。用DNA club進行基因開放閱讀框的確定，用DNAMAN進行序列比較分析，同時利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)進行BLAST分析。數(shù)據(jù)庫ExPASy (http://Cn. expasy. org/)進行蛋白等電點以及分子量的相關(guān)分析。分析結(jié)果表明擴增得到的片段長度為3572bp，自5’端第188位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點，記為+1 ；第3421位堿基為轉(zhuǎn)錄終止位點。編碼蛋白含1078個氨基酸，分子量為118KD，等電點為6. 32。相似性分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白與番茄Vel和似的相似性為50%左右(圖1)，將該基因命名為GbVdr5，為序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。 利用SMART (http://smart, embl-heidelberg. de/)進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和功能分析，該基因含有12個LRR保守結(jié)構(gòu)域，N端和C端各有1個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)，這些結(jié)構(gòu)域的存在說明該基因為IfRLP (表面受體類蛋白)類基因。(二)棉花(ibVdr5在不同器官中的表達量分析
在H7124同一棉花植株上，采集植株的葉片、花蕾、根、莖、種子以及棉纖維，其中棉纖維和種子的取樣時間為開花后15 d。用CTAB法提取總RNA (駱萍，王國棟，陳曉亞.亞洲棉C4H同源cDNA的分離和表達特征分析.植物學(xué)報，2001，43(1): 77-81.)。用 RQl DNnase (Promega公司)處理棉花各器官的總RNA，參照CL0NTECH公司的“SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit”的說明書中3，RACE模板制備方法來制備RT-PCR模板。反轉(zhuǎn)錄引物為(5，AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC (T) 30N-1N 3，)。用于半定量 RT-PCR 的基因特異引物為必 Ki/r5"-2050F 5 ’ -ATCGATATGCAGCAGTACATCTCTT-3 ’，Gb Ki/r5"-2550R 5，-CTCTAACAGGTTACTATATGGGTTA-3，。根據(jù)棉花持家基因組蛋白設(shè)計的引物HF 5，-GAAGCCTCATCGATACCGTC- 3，和 HR :5，-CTACCACTACC ATCATGGC- 3，作為參照以及檢測是否有DNA污染。用這兩對引物分別擴增H71M的cDNA模板，在25 μ 1反應(yīng)體系中加入 cDNA 模板 1 μ 1，引物各 5 nmol，2. 5 μ 1 10XPCR 緩沖液，0. 2 mM dNTP, 1. 5 mM MgCl2, 1 U rTaq (iTaKafci公司)進行PCR擴增。擴增條件為94°C 3，后94°C 45，，，56°C 45" ,72°C 1，，循環(huán)；35次，再72°C延伸10，。組蛋白擴增條件為94°C 3，后94°C 45，，， 56°C 45’ ’，720C 1，，循環(huán)23次，再72°C延伸10'。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測。棉花組蛋白擴增長度為300bp，必Κ ^擴增長度為500bp。以棉花組蛋白作為參照，對必Κ ^ 在葉片、花蕾、根、莖、種子以及棉纖維的表達分析發(fā)現(xiàn)，其在各個器官中的表達量不同，莖， 種子和纖維中的表達量要高于葉，蕾和根(圖3)。(三)棉花GbVdr5的誘導(dǎo)表達分析
將脫絨H71M種子直接播種于營養(yǎng)土中。待棉苗長到2 3片真葉時進行處理， 每盆1-2顆棉苗。病原菌誘導(dǎo)條件為菌株為落葉型和非落葉型強致病力病原菌V991和Bp2。病原菌經(jīng)PDA平板活化后，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養(yǎng)液(g/1) =NaNO3 2g、K2HP04 lg、 MgS04-7H20 0.5g、KCl 0. 5g、FeS04_7H20 0. Olg、蔗糖 30g，25 "C, 180 r .min 培養(yǎng) 5-6 d， 用紗布過濾培養(yǎng)液，鏡檢并用血球計數(shù)板計數(shù)。誘導(dǎo)方法為棉花苗期孢子懸浮液灌根法，每盆接種孢子數(shù)為1 X108。誘導(dǎo)時間分別為2d和4d。分別采集未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后棉花材料的莖，總RNA提取以及RT-PCR模板制備方法見上文。表達分析結(jié)果顯示V991和Bp2處理 2d后表達量未見明顯變化，而兩種病原菌處理4d后，在莖中基因表達量都明顯增加，其中 V991處理后增加量更大一些(圖4)。(四)必Κ ^基因過量表達載體的構(gòu)建以及植物轉(zhuǎn)化
用BamHl和Kpnl分別酶切含有G_r5基因的陽性克隆載體和植物表達載體 PCAMBIA2301 (中國質(zhì)粒載體菌株基因庫對外提供，http//biovector. blog. 163. com/)，分別回收3. 4Kb和13Kb的目的片段。將兩個片段用T4 Iigase連接(Promega公司)并轉(zhuǎn)化 JM1090感受態(tài)，獲得的陽性克隆即為含有CaMV 35S啟動子和必Κ ^基因片段的重組載體， 命名為PCAMBIA2301-35S-^Ki/r5(圖5)，用凍融法將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404(中國質(zhì)粒載體菌株基因庫對外提供，http://biovector. blog. 163. com/)。用花浸染方法(Clough S J, Bent A F. Floral dip A Simplified Method for Agrobacteriua-Wediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 1998; 16:735-743)轉(zhuǎn)化擬南芥，分單株收獲擬南芥種子。將所有種子在含有40 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選，挑選綠色植株移栽至營養(yǎng)土中生長。用PCR方法分別在DNA和RNA水平上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入以及是否成功表達。通過PCR鑒定，共獲得9株含有必Κ ^基因的轉(zhuǎn)化株，利用RT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)其中有7株目的基因可以表達(圖6)。收獲轉(zhuǎn)基因工程植株種子。將轉(zhuǎn)基因工程植株種子Tl代播種于含有40 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基。挑選綠色植株移栽至營養(yǎng)土中生長并用于抗病性鑒定。(五)Tl代轉(zhuǎn)化株的抗病性鑒定對7株必Κ ^基因可以正常表達的轉(zhuǎn)化株系進行抗病性鑒定。將經(jīng)含有卡那霉素的 MS培養(yǎng)基篩選的綠苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中，每盆移栽4株幼苗。待擬南芥生長1個月后進行抗病性鑒定。所用菌株分別為落葉型和非落葉型強致病力病原菌V991和Βρ2(徐榮旗，汪佳妮， 陳捷胤等.棉花黃萎病菌T-DNA插入突變體表型特征和側(cè)翼序列分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010,43(3):489-496;張?zhí)煺?，周兆華，閔留芳，等.棉花對黃萎病的抗性遺傳模式及抗(耐)病品種的選育技術(shù).作物學(xué)報，2000，26(6): 673-680)。病原菌經(jīng)PDA平板活化后，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養(yǎng)液，25 180 r min培養(yǎng)5_6 d，用紗布過濾培養(yǎng)液，鏡檢并用血球計數(shù)板計數(shù)。誘導(dǎo)方法為苗期孢子懸浮液灌根法，每盆接種孢子數(shù)為1 X IO70每個轉(zhuǎn)基因株系每種病原菌的鑒定株數(shù)需大于M株，接種后每天觀察病害的發(fā)生情況，在15天后就可以明顯看見發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為葉片黃化，萎蔫，生長延緩。病指按照以下標(biāo)準(zhǔn)進行鑒定，0級無病植株；1級0. 1 % 25 %葉片發(fā)病的植株；2級25 % 50 %葉片發(fā)病的植株；3級50 % 75 %葉片發(fā)病的植株；4級75 %以上葉片發(fā)病的植株?？共⌒澡b定結(jié)果顯示，在病原菌接種后17，20，23J6天后，對于落葉型黃萎病V991，對照病指分別達到56%, 61%, 78%和83% ；
而轉(zhuǎn)基因株系的平均病指僅分別為11. 5%，13%，33. 5%和45. 5%。對于非落葉型黃萎病 Bp2，在病原菌接種后17，20，23，26天后，對照病指分別達到35%，47%，70%和85%
轉(zhuǎn)基因株系的平均病指僅為6%，10%, 24%和37. 5%?？共⌒澡b定說明G_r5不僅可以延遲發(fā)病時間，而且可以使病指顯著降低(圖7)。從表型上看，未轉(zhuǎn)化植株葉片明顯黃化萎蔫，植株生長延緩，開花時間提前，但是花多為不育到最后不能結(jié)實。而轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)病癥的時間明顯延遲，雖然葉片也出現(xiàn)部分黃化，但是病癥擴展緩慢，而且植株可以正常結(jié)實 (圖8 )，說明必Vdr5可以賦予受體植株黃萎病抗性。
權(quán)利要求
1.賦予植物黃萎病抗性的必^ZrS基因，是下述核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；可與序列表中SEQ ID NO. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，與序列表中SEQID N0.1限定的DNA序列雜交的條件為0. IXSSPE或0. 1XSSC、0. SDS的溶液中，65°C條件下洗膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，該基因編碼一個表面受體蛋白，該蛋白具有12個LRR保守結(jié)構(gòu)域，N端和C端各有1個跨膜結(jié)構(gòu)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，該基因受棉花黃萎病強致病力菌株 V991和Bp2誘導(dǎo)后表達量明顯增加。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，該基因具有對棉花黃萎病強致病力菌株V991和Bp2的抗性。
6.含有權(quán)利要求1 5之一所述基因的表達載體。
7.含有權(quán)利要求1 5之一所述基因的宿主菌。
8.權(quán)利要求1 5之一所述基因在植物抗性改良中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為黃萎病相關(guān)寄主植物。
10.權(quán)利要求1 5之一所述基因在棉花黃萎病抗性改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及賦予植物黃萎病抗性的Gbvdr5基因及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。Gbvdr5基因是從抗黃萎病材料海島棉品種H7124中獲得的一個表面受體蛋白基因，核苷酸序列SEQIDNo.1，及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列SEQIDNo.2。該基因含有12個LRR保守結(jié)構(gòu)域，N端和C端各有1個跨膜結(jié)構(gòu)域。GbVdr5基因過量表達株的黃萎病抗病性明顯增強，不僅可以延遲發(fā)病，并且病指也大為降低。在病原菌接種后17，20，23，26天后，對于落葉型黃萎病V991和非落葉型黃萎病Bp2，轉(zhuǎn)基因株系黃萎病抗病性均明顯增強。
文檔編號A01H5/00GK102229938SQ201110163078
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者任永哲, 張保龍, 楊郁文, 王坤波, 陳天子 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院