專利名稱：班克木培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)與快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，具體地，涉及用于班克木的培養(yǎng)基，以及班克木的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
班克木是山龍眼科的灌木或小喬木，主要分布于澳大利亞東南及西南沿海地區(qū)， 適于生長在沙土、沙壤土或者覆沙的沙巖上。它是一種新型木本花卉，其葉、花和球果都是做干花的極好材料。關(guān)于班克木的繁殖方法，目前主要為播種繁殖和扦插繁殖，但受季節(jié)和氣候條件的限制，繁殖系數(shù)很低，在資源有限的條件下不能在生產(chǎn)中大量推廣。而組織培養(yǎng)是快速繁殖優(yōu)良植物品種的一條重要途徑，尤其是繁殖某些稀有植物或有較大經(jīng)濟價值的植物，對于植物種質(zhì)資源的保存，有很大的優(yōu)勢。如果采用組織培養(yǎng)的方法繁殖班克木，由于該植物特殊的生長環(huán)境，對溫度、光照和營養(yǎng)元素的需求均較高，溫度過高或光照強度過低都會導(dǎo)致組織培養(yǎng)苗的生長不良。迄今尚未發(fā)現(xiàn)適用于班克木的培養(yǎng)基，更沒有見到文獻報道運用組織培養(yǎng)方法對班克木進行快速繁殖，尤其是其種苗的繼代，腋芽的誘導(dǎo)和生根。因此需要研究班克木的專用培養(yǎng)基，以及它的組織培養(yǎng)方法，提供一套完整的快速繁殖技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)空白，提供用于班克木的培養(yǎng)基，能夠完成班克木的組織培養(yǎng)，建立一套完整的快速繁殖技術(shù)體系。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所提供一種班克木專用培養(yǎng)基，可用來進行組織培養(yǎng)，它是一種改良WPM培養(yǎng)基，即在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對各大元素進行調(diào)整，具體包含下列元素成分NH4NO3, 200 400mg/L ；Ca (NO3) 24H20, 250 600mg/L ；KCl，400 900mg/L ；CaCl22H20,90 200mg/L ；MgSO4,180 400mg/L。優(yōu)選地，所述改良WPM培養(yǎng)基包含下列元素成分NH4NO3，400mg/L ；Ca (NO3) 24H20, 556mg/L ；KCl，894. 5mg/L ；CaCl22H20,192mg/L ;MgS04，370mg/L。優(yōu)選地，所述改良WPM培養(yǎng)基包含下列元素成分NH4NO3，200mg/L ；Ca (NO3) 24H20, 278mg/L ；KCl，447. 25mg/L ；CaCl22H20,96mg/L ；MgSO4,185mg/L。所述改良WPM培養(yǎng)基具體可用作班克木接種后的繼代培養(yǎng)。本發(fā)明的還提供了一種用于班克木組織培養(yǎng)的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其元素成分包括在所述改良WPM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加生長調(diào)節(jié)劑。其中，所述班克木腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加的生長調(diào)節(jié)劑選自0. 5 1. 5mg/l IBA (乙哚丁酸)、0. 5 1. 5mg/l 6-BA (6-芐基腺嘌呤)、0. 5 1. 5mg/l NAA(萘乙酸)、 0. 05 0. 15mg/l 2，4-D 0，4-二氯苯氧乙酸)和0. 1 0. !3mg/l TDZ (苯基噻二唑基脲) 中的任一種或多種。
本發(fā)明還提供了一種用于班克木組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基，其元素成分包括在所述改良WPM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加生長調(diào)節(jié)劑和活性炭(AC)。其中，所述班克木生根培養(yǎng)基中添加的生長調(diào)節(jié)劑選自0. 5 1. 5mg/l IAA(吲哚-3-乙酸)、0.5 1.5mg/l IBA(乙哚丁酸)、0· 5 1. 5mg/l KT(激動素)和0.5 1. 5mg/l NAA(萘乙酸)中的任一種或多種。本發(fā)明的另一目的是提供了一種班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，包括如下步驟外植體的消毒和無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)和試管苗移栽。在無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段中使用的培養(yǎng)基包括所述改良WPM培養(yǎng)基。其中，班克木組織培養(yǎng)的光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光 2000 2500LUX，光照時間為14h/d。該光照條件和光照時間應(yīng)用于班克木組織培養(yǎng)的每一個培養(yǎng)階段(除外植體的消毒不需要光照之外)。其中，班克木組織培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為20 23°C，該溫度應(yīng)用于所述無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段；試管苗移栽的移栽溫度為18 25°C。溫度過高或過低都不利于試管苗的成活，夏季不宜進行試管苗的移栽。其中，所述外植體的消毒和無菌苗的獲得包括選用種子為外植體，在無菌條件下用75%酒精消毒30s，無菌水沖洗5 6次，再用質(zhì)量比為0. 的升汞溶液消毒4 IOmin (不同種的消毒時間不同)。接種至MS培養(yǎng)基中；1個月后移至所述改良WPM培養(yǎng)基中繼代。其中，所述的腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的具體步驟為在所述改良WPM培養(yǎng)基中繼代1 個月后，取無菌苗莖段在所述班克木腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基或添加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中。之后移至相同培養(yǎng)基(腋芽誘導(dǎo)過程中所用培養(yǎng)基)中增殖，繼代2 3次。其中，添加于MS培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑同班克木腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述生長調(diào)節(jié)劑。其中，所述的生根培養(yǎng)和試管苗移栽的具體步驟為將腋芽轉(zhuǎn)移至所述班克木生根培養(yǎng)基中進行生根。生根30 40天后，煉苗3 4天后，移栽至珍珠巖、草炭基質(zhì)中培養(yǎng)，保持濕度高于80%，每天噴水2 3次。其中，珍珠巖與草炭的體積比為1 1 3 1，優(yōu)選1 1。其中，班克木組織培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)基pH值均為5. 9 6. 0，優(yōu)選5. 95。本發(fā)明提供的班克木培養(yǎng)基，其優(yōu)點在于第一，針對班克木對磷元素極為敏感的特點，所用培養(yǎng)基中不含磷元素，有效提高了種苗質(zhì)量；第二，鈣離子加倍，極大緩解了種苗枯梢現(xiàn)象。用本發(fā)明的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法培養(yǎng)班克木，營養(yǎng)元素、光照和溫度條件都非常適宜，1個月內(nèi)的增殖系數(shù)就能夠達到3以上，2個月的增殖系數(shù)最高更是達到了 6 7 ；生根率最高可以達到87 %以上，最低也超過了 53 %，移栽成活率為100 %，極大地提高了班克木的繁殖系數(shù)，縮短成苗周期，又可降低成本，為今后大面積園林應(yīng)用和工廠化育苗提供了有效的方法；同時，以莖段為材料進行快速繁殖對植株的破壞性不大，而且可以在短時間內(nèi)獲得大量的再生植株；通過誘導(dǎo)腋芽再生的試管苗生長健壯，對后期的生長觀察發(fā)現(xiàn)， 基本能保持班克木的優(yōu)良種性不變，為稀有品種的培育提供了保障。
與傳統(tǒng)的班克木扦插和種子繁殖方法相比，本發(fā)明班克木組織培養(yǎng)和快速繁殖方法的優(yōu)點在于1.極大地提高了班克木的繁殖系數(shù)和生根率(傳統(tǒng)繁殖方法的繁殖系數(shù)小于 1. 0，生根率國際水平為30%左右，國內(nèi)水平為20%左右)，并且繁殖周期縮短，方法快速有效，為科研研究和生產(chǎn)栽培提供了技術(shù)支持。2.通過組織培養(yǎng)與快速繁殖得到的幼苗生長健壯，葉色濃綠，一致性強，成苗容易，適應(yīng)性強，病蟲害少，品質(zhì)優(yōu)質(zhì)，易于管理；3.利用組織培養(yǎng)與快速繁殖方法繁育班克木，不受季節(jié)與氣候的限制，從而縮短了育苗周期，增加了繁育量，為班克木的大面積推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支持。


圖1是培養(yǎng)溫度為20 23°C，班克木在接種種子1個月后長成的無菌苗。圖2是培養(yǎng)溫度為20 23°C，班克木接種莖段2個月后腋芽在繼代培養(yǎng)基中的情況。圖3是培養(yǎng)溫度為20 23°C，班克木在生根培養(yǎng)基中的生根情況。圖4是移栽溫度為18 25°C，班克木再生植株移栽后的生長情況正上方拍攝照片。圖5是移栽溫度為18 25°C，班克木再生植株移栽后的生長情況側(cè)面拍攝照片。圖6是培養(yǎng)溫度為18 20°C以及23 27°C，班克木在接種種子1個月后長成的
無菌苗。圖7是培養(yǎng)溫度為18 20°C以及23 27°C，班克木接種莖段2個月后腋芽在繼代培養(yǎng)基中的情況。圖8是培養(yǎng)溫度為18 20°C以及23 27°C，班克木在生根培養(yǎng)基中的生根情況。圖9是移栽溫度為25 以及18°C以下，班克木再生植株移栽后的生長情況正上方拍攝圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1配制1號改良WPM培養(yǎng)基，所用的大量元素成分包括=NH4NO3,400mg/L ； Ca(NO3)24H20，556mg/L ；KCl, 894. 5mg/L ；CaCl22H20,192mg/L ；MgSO4, 370mg/L。 配制2號改良WPM培養(yǎng)基，所用的大量元素成分包括=NH4NO3, 200mg/L ； Ca(NO3)24H20,278mg/L ；KCl,447. 25mg/L ；CaCl22H20,96mg/L ；MgSO4,185mg/L。光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光2000 2500Lux，光照時間為14h/d。該光照條件和光照時間應(yīng)用于班克木組織培養(yǎng)的每一個培養(yǎng)階段(除外植體的消毒不需要光照之外)。班克木組織培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為20 23°C，該溫度應(yīng)用于下述無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段；試管苗移栽的移栽溫度為18 25°C。溫度和光照對于腋芽的誘導(dǎo)和組織培養(yǎng)苗的生長起到非常關(guān)鍵的作用，溫度過高或光照強度過低都會導(dǎo)致組織培養(yǎng)苗生長不良。組織培養(yǎng)苗在20 23°C條件下生長健壯，真葉較多且葉色濃綠，下胚軸短而粗， 根粗壯，根毛多(如說明書附圖中圖1 圖3所示)。18 20°C以及23 27°C條件下生長狀況不良，不易出真葉且葉色淡綠或發(fā)黃柔弱，下胚軸細而長，根細弱且根毛較少(如說明書附圖中圖6 圖8所示)。移栽苗在18 25°C條件下長勢良好，生長迅速，葉色濃綠，根系健壯(如說明書附圖中圖4、圖5所示)。25 條件下葉片發(fā)黃、干枯直至死亡，18°C以下沒有生長跡象 (如說明書附圖中圖9所示)。下述班克木組織培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)基pH值均為5. 95。取班克木種子為外植體，在無菌條件下先用75%酒精消毒30s，無菌水沖洗5 6 次，再用0. 升汞溶液消毒6 lOmin，無菌水沖洗5 6次，升汞消毒時間梯度6min、 8minU0min ；接種至MS培養(yǎng)基中，每瓶接種1個；1個月后移至2號改良WPM培養(yǎng)基中繼代，每瓶接種3個。統(tǒng)計結(jié)果顯示，升汞溶液消毒時間為IOmin時污染最低，可降至1. 3%， 時間過長會使種子致死，時間過短污染率較高。具體統(tǒng)計數(shù)值請見下表
權(quán)利要求
1.一種改良WPM培養(yǎng)基，包含下列元素成分NH4NO3, 200 400mg/L ； Ca (NO3) 24H20， 250 600mg/L ；KCl，400 900mg/L ；CaCl22H20,90 200mg/L ；MgSO4,180 400mg/L。
2.一種用于班克木組織培養(yǎng)的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其元素成分包括在權(quán)利要求1所述改良WPM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加生長調(diào)節(jié)劑；所述生長調(diào)節(jié)劑選自0.5 1.5mg/l IBA、 0. 5 1. 5mg/l 6-ΒΑ、0· 5 1. 5mg/l ΝΑΑ、0· 05 0. 15mg/l 2，4_D 禾口 0· 1 0. 3mg/l TDZ 中的任一種或多種。
3.一種用于班克木組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基，其元素成分包括在權(quán)利要求1所述改良 WPM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加生長調(diào)節(jié)劑和活性炭；所述生長調(diào)節(jié)劑選自0.5 1.5mg/l IAA、 0. 5 1. 5mg/l ΙΒΑ、0. 5 1. 5mg/l KT 和 0. 5 1. 5mg/l NAA 中的任一種或多種。
4.一種班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，包括如下步驟外植體的消毒和無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)和試管苗移栽；其中無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段所用培養(yǎng)基包括權(quán)利要求1所述的改良WPM培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，在每個步驟中光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光2000 2500Lux，光照時間為 14h/d。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)階段的培養(yǎng)溫度為20 23°C，試管苗移栽的移栽溫度為18 25°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，無菌苗的獲得包含外植體的接種和接種后的繼代培養(yǎng)，接種所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；接種后繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為所述改良WPM培養(yǎng)基；所用每個培養(yǎng)基的pH值均為5. 9 6. 0。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為班克木腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基或添加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為班克木生根培養(yǎng)基；所用每個培養(yǎng)基的PH值均為5. 9 6. 0 ；所述生長調(diào)節(jié)劑為 0. 5 1. 5mg/l ΙΒΑ、0· 5 1. 5mg/l 6_ΒΑ、0· 5 1. 5mg/l ΝΑΑ、0· 05 0. 15mg/l 2， 4-D和0. 1 0. 3mg/l TDZ中的任一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求4 8任一項所述的班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述外植體的消毒包括選用種子為外植體，在無菌條件下用75%酒精消毒30s，無菌水沖洗 5 6次，再用質(zhì)量比為0. 的升汞溶液消毒4 lOmin。
10.根據(jù)權(quán)利要求4 8任一項所述的班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于， 所述移栽是在班克木生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 40天后，煉苗3 4天移栽至珍珠巖、草炭基質(zhì)中培養(yǎng)，移栽溫度為18 25V。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于班克木的培養(yǎng)基，以及班克木的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法。所述班克木專用培養(yǎng)基為改良WPM培養(yǎng)基，包含下列元素成分NH4NO3，200～400mg/L；Ca(NO3)24H2O，250～600mg/L；KCl，400～900mg/L；CaCl22H2O，90～200mg/L；MgSO4，180～400mg/L；所述班克木組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，包括外植體的消毒和無菌苗的獲得，腋芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)和試管苗移栽。本發(fā)明提供的班克木培養(yǎng)基和組織培養(yǎng)方法極大地提高了班克木的繁殖系數(shù)和生根率，建立了一套完整的快速繁殖技術(shù)體系，為班克木的大面積推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支持。
文檔編號A01H4/00GK102283112SQ20111016482
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者孫明, 張啟翔, 潘會堂, 王佳, 程堂仁, 馬琳 申請人:北京林業(yè)大學(xué)