專利名稱：三倍體鐵皮石斛的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三倍體鐵皮石斛的培育方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl)又稱黑節(jié)草，它是一種附生、多年生草本蘭科植物。主要分布在我國云南、貴州、廣西、臺灣等地。年平均氣溫12-18度，相對濕度60-75%，林間透光度60%左右，年降雨量1100-1500mm。生長在常綠闊葉林中，附生于樹干上或石灰?guī)r上。野生鐵皮石斛種子成活率極低，生長緩慢，從種子萌發(fā)到進(jìn)入商品階段需5-7年才能采收，造成其產(chǎn)量很少。近年，由于市埸供不應(yīng)求，人們過度采挖，再加上環(huán)境惡化，鐵皮石斛自然資源已日趨枯竭。鐵皮石斛，加工后俗稱鐵皮楓斗，為傳統(tǒng)名貴中藥材，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、滋陰養(yǎng)胃，清熱生津、潤肺止咳之功效。預(yù)測鐵皮石斛將成為21世紀(jì)高級護(hù)嗓保健飲品。近代藥理藥化研究表明，鐵皮石斛藥物化學(xué)成分主要是多糖類、生物堿和抗腫瘤活性物質(zhì)。多糖含量達(dá)18. 2% -22. 27%，這些多糖類是免疫增強(qiáng)劑，具有增強(qiáng)T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞免疫活性作用。鐵皮石斛含有兩種抗癌菲類化合物，具有對肝癌和艾氏腹水癌細(xì)胞的抑制作用。鐵皮石斛滋陰清熱生津作用主要與-ATP酶活性有關(guān)。國家“十一五”和“十二五”計(jì)劃均提出“種質(zhì)資源的挖掘、保存、創(chuàng)新和新品種的定向培育”的任務(wù)。為貫徹、落實(shí)這項(xiàng)任務(wù)，我們提出應(yīng)用“基因組多倍化與雜交相結(jié)合”的方法，可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的定向培育的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，應(yīng)用“基因組多倍化與雜交相結(jié)合”的方法，培育三倍體鐵皮石斛，可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的定向培育的目的。它是首先將自然界存在的二倍體鐵皮石斛人工誘變成同源四倍體，然后，四倍體鐵皮石斛與二倍體雜交，產(chǎn)生三倍體鐵皮石斛，即4x早Xh $ — 3x,由此可知，三倍體鐵皮石斛是由雜交產(chǎn)生的，具有雜交優(yōu)勢，同時(shí)，三倍體是多倍體亦具有多倍體優(yōu)勢，所以，三倍體具有雜交種和多倍體雙重優(yōu)勢。同時(shí)，形成三倍體后，在“空間上”與其他物種形成了生殖隔離，不能形成后代，沒有后代分離，其雜交第一代是永久雜種(可記為永久F1)，固定了雜種優(yōu)勢。因此，三倍體鐵皮石斛藥材產(chǎn)量和主要藥物成分含量方面具有超強(qiáng)的優(yōu)勢，具有重要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明三倍體鐵皮石斛的培育方法包括以下步驟1)首先從種質(zhì)資源中選出優(yōu)良鐵皮石斛品種；2)對選出的優(yōu)良鐵皮石斛進(jìn)行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛；3)以四倍體鐵皮石斛為母本與二倍體鐵皮石斛為父本進(jìn)行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；4)對三倍體鐵皮石斛種子進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)；5)對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進(jìn)行誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)；
6)三倍體鐵皮石斛成苗分化；7)三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽與按常規(guī)鐵皮石斛進(jìn)行成苗栽培管理。本發(fā)明提供的一種三倍體鐵皮石斛的培育方法包括以下步驟1) 二倍體鐵皮石斛按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，在開花后的5-10天內(nèi)進(jìn)行同株異花授粉，授粉后的鐵皮石斛植株，放在通風(fēng)、半透光條件下，保持30-50%濕度，15-20°C溫度。2)在人工授粉后120-160天，剪下鐵皮石斛蒴果，在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌手術(shù)刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色鐵皮石斛種子接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，60次/分振動或靜止非共生萌發(fā)培養(yǎng)約40-50天，至種子類原球莖(PLBs)發(fā)育成球形。3)進(jìn)行四倍體鐵皮石斛人工誘導(dǎo)，將發(fā)育成球形的種子原球莖(原胚期)轉(zhuǎn)入含有0. 02%秋水仙堿的1/2MS液體培養(yǎng)基中，誘變處理150-180小時(shí)，4)將誘變處理后的鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至鐵皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先進(jìn)行染色體前處理，然后進(jìn)行染色體倍性鑒定，選取染色體數(shù)目2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍體鐵皮石斛；所述的繼續(xù)培養(yǎng)是在光照下，光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000LUX，室溫25°C ；所述的染色倍性體鑒定方法按株編號，取幼苗新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理3-4h，然后放入體積比3 1的甲醇與冰醋酸固定液中，4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫挥每▽毱芳t染色液染色，壓片法制備染色體標(biāo)本；400倍以上顯微鏡觀察染色體數(shù)目，選取染色體數(shù)目為2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍體鐵皮石斛；5)四倍體鐵皮石斛的栽培管理，將加倍成功的鐵皮石斛幼苗進(jìn)行移栽，按常規(guī)的鐵皮石斛進(jìn)行栽培管理，直至開花；6)當(dāng)四倍體鐵皮石斛開花后，以人工誘變的同源四倍體鐵皮石斛為母本，二倍體鐵皮石斛為父本，進(jìn)行有性雜交，所結(jié)的鐵皮石斛種子全部為三倍體鐵皮石斛，即 4χ 早 Χ2χ 古一3χ ；三倍體鐵皮石斛與二倍體鐵皮石斛相比，其主要形態(tài)性狀基本相同，但其莖、葉、 花表現(xiàn)出明顯的增大，藥材產(chǎn)量與石斛多糖含量顯著提高。三倍體具有多倍體和雜交種雙重優(yōu)，其雜交一代是“永久F1”，即永久雜種，固定了雜種優(yōu)勢。7)對三倍體鐵皮斛種子進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)、原球莖誘導(dǎo)、成苗分化、成苗移栽， 按常規(guī)鐵皮石斛進(jìn)行栽培管理。本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛新品種的培育方法，特別是鐵皮石斛三倍體的培育方法，可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的定向培育的目的。通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優(yōu)勢的三倍體，其優(yōu)勢表現(xiàn)出具有巨大性和不可替代性，可以大幅度提高鐵皮石斛藥材產(chǎn)量，同時(shí)，三倍體鐵皮石斛是永久雜種，可以固定雜種優(yōu)勢。三倍體鐵皮石斛具有雜交種和多倍體雙重優(yōu)勢。同時(shí)，形成三倍體后，在“空間上”與其他物種形成了生殖隔離，不能形成后代，沒有后代分離，其雜交第一代是永久雜種(可記為永久F1)， 即固定了雜種優(yōu)勢。因此，三倍體鐵皮石斛藥材產(chǎn)量和主要藥物成分含量方面具有超強(qiáng)的優(yōu)勢，具有重要應(yīng)用價(jià)值。


圖1
圖2
圖3
圖4PLBs0
圖5
圖6
圖7
圖8
二倍體鐵皮石斛親本，染色體數(shù)目為2n = h = 38。 四倍體鐵皮石斛親本，染色體數(shù)目為2n =虹=76。 二倍體與四倍體鐵皮石斛雜交Fl正、反交果實(shí)。
二倍體與四倍體雜交Fl鐵皮石斛種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)，剪頭為放大的萌發(fā)
三倍體鐵皮石斛的成苗分化培養(yǎng)。
三倍體鐵皮石斛瓶苗培養(yǎng)，箭頭為放大的瓶苗。
三倍體鐵皮石斛的倍性鑒定，2η = 3χ = 57。
三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽前煉苗(a)與移栽后苗床培養(yǎng)(b)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明突出的特點(diǎn)和顯著進(jìn)步可從下述實(shí)例中得以體現(xiàn)，但不會對本發(fā)明作任何限制。本發(fā)明三倍體鐵皮石斛的培育方法包括以下步驟1)首先從種質(zhì)資源中選出優(yōu)良二倍體鐵皮石斛品種；2)對選出的優(yōu)良二倍體鐵皮石斛進(jìn)行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛，參照 ZL200710061225. 8誘導(dǎo)四倍體的方法；3)以四倍體鐵皮石斛為母本、二倍體鐵皮石斛為父本進(jìn)行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；4)對三倍體鐵皮石斛種子進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)；5)對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進(jìn)行誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)；6)三倍體鐵皮石斛成苗分化誘導(dǎo)培養(yǎng)；
7)三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽與按常規(guī)鐵皮石斛進(jìn)行成苗栽培管理。具體應(yīng)用實(shí)施例2005年4月從云南省文山引入二倍體鐵皮石斛Qn = 38)，如圖1，于當(dāng)年5月 20日進(jìn)行同株異花人工授粉，授粉后的鐵皮石斛在25°C，50%自然光照條件下，至2005年 11月22日，剪下蒴果，在超凈工作臺內(nèi)，先用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞消毒10 分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向切開，將鐵皮石斛種子接種在1/2MS 液體培養(yǎng)基中，25°C條件下振蕩培養(yǎng)，約30天后，轉(zhuǎn)入含有0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養(yǎng)基中，誘變處理130小時(shí)，后轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上，在光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度 3000LUX，室溫25°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至鐵皮石斛成苗分化。在瓶苗移栽時(shí)，按株分別取新生長的根尖，用壓片法制備染色體標(biāo)本，選取加倍成功的鐵皮石斛幼苗On = 76)，進(jìn)行移栽，按常規(guī)鐵皮石斛的栽培條件進(jìn)行栽培管理。2008年5月30日四倍體鐵皮石斛第一次開花，如圖2。在開花一周以內(nèi)，以原文山二倍體鐵皮石斛為父本，誘變成功的四倍體鐵皮石斛為母本，進(jìn)行人工授粉，至2008年 10月20日將雜交獲得的接近成熟的三倍體鐵皮石斛蒴果(143天)剪下，如圖3，在超凈工作臺內(nèi)，先用75 %酒精消毒1分鐘，再用0. 1 %升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向切開，將鐵皮石斛種子接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，25°C條件下振蕩培養(yǎng)3-4周，轉(zhuǎn)入靜置培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)形成種子原球莖，如圖4 ；然后轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000LUX，室溫25°C條件下進(jìn)行三倍體鐵皮石斛成苗分化培養(yǎng)，如圖5 ；接著繼續(xù)瓶苗培養(yǎng)，如圖6 ；在瓶苗生長至瓶口 1/2-2/3高度、葉片3-4片、新根生長旺盛時(shí)，打開瓶口進(jìn)行煉苗，如圖8a ；移栽前進(jìn)行染色體倍性鑒定，如 圖7，2n = 57為雜交轉(zhuǎn)育成的三倍體鐵皮石斛，可進(jìn)行瓶苗移栽，如圖Sb。
三倍體鐵皮石斛成苗栽培管理與一般二倍體鐵皮石斛栽培管理?xiàng)l件基本一致，成苗移植按常規(guī)的鐵皮石斛栽培管理?xiàng)l件，直至開花和藥材采收。
權(quán)利要求
1.一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，其特征在于包括以下步驟1)首先從種質(zhì)資源中選出優(yōu)良鐵皮石斛品種；2)對選出的優(yōu)良鐵皮石斛進(jìn)行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛；3)以四倍體鐵皮石斛為母本與二倍體鐵皮石斛為父本進(jìn)行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；4)對三倍體鐵皮石斛種子進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)；5)對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進(jìn)行誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)；6)三倍體鐵皮石斛成苗分化；7)三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽與按常規(guī)鐵皮石斛進(jìn)行成苗栽培管理。
2.一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，其特征在于包括以下步驟1)二倍體鐵皮石斛按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，在開花后的5-10天內(nèi)進(jìn)行同株異花授粉，授粉后的鐵皮石斛植株，放在通風(fēng)、半透光條件下，保持30-50%濕度、15-20°C溫度。2)在人工授粉后120-160天，剪下鐵皮石斛蒴果，在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精消毒1 分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌手術(shù)刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色鐵皮石斛種子接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，50-80轉(zhuǎn)/分，振動或靜止非共生萌發(fā)培養(yǎng)約40-50天，至種子類原球莖(PLBs)發(fā)育成球形；3)進(jìn)行四倍體鐵皮石斛人工誘導(dǎo)，將發(fā)育成球形的種子原球莖(原胚期)轉(zhuǎn)入含有 0. 02%秋水仙堿的1/2MS液體培養(yǎng)基中，誘變處理150-180小時(shí)，4)將誘變處理后的鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至鐵皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先進(jìn)行染色體前處理，然后進(jìn)行染色體倍性鑒定，選取染色體數(shù)目2n = 76的幼苗，是加倍成功的同源四倍體鐵皮石斛；5)四倍體鐵皮石斛的栽培管理，將加倍成功的鐵皮石斛幼苗進(jìn)行移栽，按常規(guī)的鐵皮石斛進(jìn)行栽培管理，直至開花；6)當(dāng)四倍體鐵皮石斛開花后，以人工誘變的同源四倍體鐵皮石斛為母本，二倍體鐵皮石斛為父本，進(jìn)行有性雜交，所結(jié)的鐵皮石斛種子全部為三倍體鐵皮石斛，即 4χ 早 Χ2χ 古一3χ ；三倍體鐵皮石斛與二倍體鐵皮石斛相比，其主要形態(tài)性狀基本相同，但其莖、葉、花表現(xiàn)出明顯的增大，藥材產(chǎn)量與石斛多糖含量顯著提高。三倍體具有多倍體和雜交種雙重優(yōu)， 其雜交一代是“永久F1”，即永久雜種，固定了雜種優(yōu)勢。7)對三倍體鐵皮斛種子進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)、原球莖誘導(dǎo)、成苗分化，成苗移栽，按常規(guī)鐵皮石斛進(jìn)行栽培管理。
3.按照權(quán)利要求2所述的培育方法，其特征在于步驟4)所述的繼續(xù)培養(yǎng)是在光照下， 光周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000LUX，室溫25°C。
4.按照權(quán)利要求2所述的培育方法，其特征在于步驟4)所述的染色體倍性鑒定方法 按株編號，取幼苗新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理3-4h，然后放入體積比3 1的甲醇與冰醋酸固定液中，4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標(biāo)本；400倍以上顯微鏡觀察染色體數(shù)目，選取染色體數(shù)目為2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍體鐵皮石斛。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，該方法包括①首先對鐵皮石斛種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛收集，從中選出優(yōu)良鐵皮石斛；②對選出的優(yōu)良鐵皮石斛進(jìn)行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛；③以四倍體鐵皮石斛為母本與二倍體鐵皮石斛為父本進(jìn)行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；④對三倍體鐵皮石斛種子進(jìn)行非共生萌發(fā)培養(yǎng)；⑤對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進(jìn)行誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)；⑥三倍體鐵皮石斛成苗分化；⑦三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽；⑧三倍體鐵皮石斛成苗栽培管理。本發(fā)明通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優(yōu)勢的三倍體，其優(yōu)勢表現(xiàn)出具有巨大性和不可替代性，可以大幅度提高鐵皮石斛藥材產(chǎn)量，同時(shí)，三倍體鐵皮石斛是永久雜種，可以固定雜種優(yōu)勢。
文檔編號A01H4/00GK102257964SQ20111017788
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者李秀蘭, 陳力, 陳瑞陽 申請人:南開大學(xué)