專利名稱：用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液及其制備方法。
背景技術(shù)：
正常情況下，液體凍結(jié)時(shí)會(huì)產(chǎn)生規(guī)則或不規(guī)則的晶體，易造成細(xì)胞膜破裂進(jìn)而對(duì)活細(xì)胞造成直接損傷。因此，為減少凍存過(guò)程中細(xì)胞的損傷，往往需要使用含低溫保護(hù)劑的凍存液。常用的低溫保護(hù)劑有二甲基亞砜(DMS0)、甘油和葡聚糖等，其中以DMSO最為常用。 使用純動(dòng)物血清結(jié)合DMSO是常用的凍存液，但動(dòng)物血清可能含有動(dòng)物性的病原微生物，有可能與凍存的細(xì)胞發(fā)生交叉感染，一旦發(fā)生感染，后續(xù)復(fù)蘇和洗滌很難清除。培養(yǎng)基和羥乙基淀粉溶液也常作為細(xì)胞凍存液的主要成分，用于細(xì)胞凍存。單個(gè)核細(xì)胞(MNC)是由新鮮臍帶血或骨髓經(jīng)過(guò)密度梯度離心后獲得的包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等在內(nèi)的細(xì)胞混合群體，其中含有一些干細(xì)胞和祖細(xì)胞。MNC成分復(fù)雜，各種類型的細(xì)胞在凍存過(guò)程的耐受能力有差異，各種類型的細(xì)胞適用的凍存液往往不同。因此，現(xiàn)有的凍存液用于MNC的凍存效果往往不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液， 可適用于單個(gè)核細(xì)胞中各種類型細(xì)胞的凍存，提高了單個(gè)核細(xì)胞的凍存效果。一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液，包含血漿和二甲基亞砜。本發(fā)明提供的用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液，包含血漿和二甲基亞砜，但不僅限于血漿和二甲基亞砜，也可以包含動(dòng)物血清和培養(yǎng)基等成分。臍帶血血漿中富含各種礦物質(zhì)離子和蛋白因子，提供細(xì)胞代謝所需物質(zhì)并維持細(xì)胞所需的滲透壓，是天然的營(yíng)養(yǎng)體系和緩沖體系。將自體臍帶血血漿用于臍帶血來(lái)源MNC 的凍存，避免了動(dòng)物源病原微生物的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，可使MNC的凍存更加安全有效，便于凍存細(xì)胞后續(xù)的臨床應(yīng)用。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述血漿的體積百分比為909Γ95% ；所述二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。二甲基亞砜(DMSO)是最常用的低溫保護(hù)劑，但DMSO具有較強(qiáng)的毒副作用。因此， 在保證凍存效果的同時(shí)，盡量減少DMSO的使用量，可減少細(xì)胞的損傷，使MNC的凍存更加安全。另一方面，本發(fā)明提供一種制備用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液的方法，包括以下步驟
Α)取新鮮臍帶血于無(wú)菌離心管中，在觀00 rpm離心16 min后，收集上清液，即為血漿； B)將所述血漿和所述二甲基亞砜混合均勻，血漿的體積百分比為909Γ95%，二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是將臍帶血MNC分離中富余的血漿用于MNC 的凍存，實(shí)現(xiàn)了富余血漿的“廢物利用”，不用專門購(gòu)買動(dòng)物血清、培養(yǎng)基等昂貴試劑，節(jié)約了資源和成本；可適用于MNC中各種類型細(xì)胞的凍存，提高了 MNC凍存的細(xì)胞復(fù)蘇活率，凍存效果好；避免了動(dòng)物源病原微生物的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，可使MNC的凍存更加安全有效，便于凍存細(xì)胞后續(xù)的臨床應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例四中造血干細(xì)胞⑶34表達(dá)流式檢測(cè)結(jié)果；圖1-a 凍存前； 圖1-b :DMEM凍存后；圖1-c =HES凍存后；圖l_d 血漿凍存后。圖2為本發(fā)明實(shí)施例五中細(xì)胞集落形態(tài)特征圖；圖1-a:紅細(xì)胞集落，放大倍數(shù)為100倍；圖1-b 爆式紅細(xì)胞集落，放大倍數(shù)為100倍；圖I-C 巨噬細(xì)胞集落，放大倍數(shù)為 100倍；圖Ι-d 粒-巨噬細(xì)胞集落，放大倍數(shù)為100倍；圖Ι-e 混合大集落，放大倍數(shù)為100 倍；圖l_f 粒細(xì)胞集落，放大倍數(shù)為40倍。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例一凍存液的配制。超凈工作臺(tái)中，取新鮮臍帶血于無(wú)菌離心管中，在觀00 rpm離心16 min后，收集上清液，即為血漿。將血漿(Blood plasma)和二甲基亞砜(DMSO)按19:1的體積比混合均勻，得本發(fā)明提供的血漿凍存液。為便于凍存效果的比較，配制現(xiàn)有技術(shù)的DMEM凍存液DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基與DMSO 以19:1的體積比混合均勻；HES凍存液醫(yī)用6%羥乙基淀粉溶液(HES)與DMSO以19:1的體積比混合均勻。本文中，DMEM指的是DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，HES指的是醫(yī)用6%羥乙基淀粉溶液。實(shí)施例二 MNC的凍存。配制如上所述的血漿凍存液、DMEM凍存液和HES凍存液，放4°C冰箱預(yù)冷。收集培養(yǎng)的MNC，在200 g離心10 min后，棄上清液，用生理鹽水懸浮細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)。依據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)情況將細(xì)胞均分成三組，分別命名為血漿凍存組、DMEM凍存組和HES凍存組，在200g離心10 min,棄上清液，加入相應(yīng)的凍存液，輕輕混勻。將混勻后的細(xì)胞分裝入凍存管，做好標(biāo)記，將凍存管置于程序降溫盒中，再移入-80°C冰箱，隔天轉(zhuǎn)入液氮罐中凍存。MNC細(xì)胞經(jīng)過(guò)液氮凍存2天以上，視試驗(yàn)需要即可進(jìn)行復(fù)蘇操作。實(shí)施例三MNC凍存的細(xì)胞復(fù)蘇活率分析。將恒溫水浴箱的溫度調(diào)節(jié)至40°C，分別從液氮罐中取出血漿凍存組、DMEM凍存組和HES凍存組的凍存管，每組取三個(gè)平行樣，立即投入水浴鍋中，快速搖動(dòng)，細(xì)胞凍存液完全融解時(shí)，噴75%乙醇；超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作，酒精燈焰快速灼燒凍存管蓋子，打開各凍存管蓋子，從各凍存管中將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的無(wú)菌離心管中，往無(wú)菌離心管中緩慢加入凍存液5倍體積以上的冷生理鹽水，輕輕混勻，在200g離心10 min,棄上清液，用培養(yǎng)液或者PBS重懸細(xì)胞，輕輕混勻，取樣計(jì)算細(xì)胞凍存前活率。MNC凍存的細(xì)胞復(fù)蘇活率采用臺(tái)盼蘭染色結(jié)合顯微鏡計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析。臺(tái)盼蘭染液與細(xì)胞懸液均勻混合后1 min內(nèi)即在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)四個(gè)中方格，每個(gè)中方格有4(Γ80 個(gè)細(xì)胞為宜，四個(gè)中方格細(xì)胞計(jì)數(shù)總量不少于100。染成藍(lán)色的細(xì)胞計(jì)為死細(xì)胞。細(xì)胞活率的計(jì)算公式為I-Nd (死細(xì)胞數(shù))/Nt (細(xì)胞總數(shù))。 MNC凍存的細(xì)胞復(fù)蘇活率分析結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，血漿凍存組的細(xì)胞復(fù)蘇活率明顯高于DMEM凍存組和HES凍存組，說(shuō)明本發(fā)明提供的凍存液用于凍存MNC， 提高了 MNC凍存的細(xì)胞復(fù)蘇活率。采用SPSS11. 5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料單因素方差分析，*表示血漿凍存組的細(xì)胞復(fù)蘇活率明顯高于DMEM凍存組和HES凍存組 (Ρ<0. 05)。
表1不同凍存液凍存MXC的細(xì)胞復(fù)蘇活率
權(quán)利要求
1.一種用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液，其特征在于包含血漿和二甲基亞砜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液，其特征在于所述血漿的體積百分比為90°/Γ95% ；所述二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液的方法，其特征在于，包括以下步驟Α)取新鮮臍帶血于無(wú)菌離心管中，在2800 rpm離心16 min后，收集上清液，即為血漿； B)將所述血漿和所述二甲基亞砜混合均勻，血漿的體積百分比為909Γ95%，二甲基亞砜的體積百分比為59TlO%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。用于凍存單個(gè)核細(xì)胞的凍存液，包含血漿和二甲基亞砜。本發(fā)明主要應(yīng)用于單個(gè)核細(xì)胞的凍存，具有凍存效果好和節(jié)約成本的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102301992SQ201110185230
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者劉陳雄, 吳莉芳, 姜舒, 李陶, 胡祥 申請(qǐng)人:深圳市北科生物科技有限公司