專利名稱：狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別是涉及一種狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
狼毒是我國特有的、貴重中藥材之一，含殺蟲、殺菌及抗癌等多種生物活性物質(zhì)。 二職類化合物Prostratin (圖I)最早由Cashmore等人從新西蘭植物稻花一種(Pimelea prostrata)中分離得到。近年來，人們在太平洋島國薩摩亞的Mamala樹Homalanthus nutans中也分離到了該二職類化合物并且發(fā)現(xiàn)Prostratin能夠激活潛伏的HIV病毒,表現(xiàn)出良好的抗HIV的活性，有望開發(fā)成一種新藥，但人們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Mamala樹資源很少，其中的Prostratin的含量很低。我國的學(xué)者發(fā)現(xiàn)狼毒(Euphorbia fischeriana)的根中也含有Prostratin,但其Prostratin的含量也很低。由于狼毒大戟的生長受地理?xiàng)l件的限制， 資源十分有限，導(dǎo)致藥材供不應(yīng)求，不能滿足醫(yī)藥市場的需求。為解決資源緊缺的問題，研究生物技術(shù)培養(yǎng)狼毒的方法成為當(dāng)務(wù)之急。規(guī)?；幱弥参锝M織培養(yǎng)可以解決以上問題， 通過組織培養(yǎng)方法可以獲得有效成分含量高、生產(chǎn)周期短的狼毒組織培養(yǎng)物，從而代替野生或人工土地栽培的狼毒，既可解決占地問題，又可解決狼毒藥材的資源問題，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值、生態(tài)效益和社會效益。
不定根培養(yǎng)是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)胞工程技術(shù)。不定根是一種分化的植物器官，是由植物的愈傷組織誘導(dǎo)而來。和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞相比較，藥用植物的不定根其有效成分含量很穩(wěn)定；和大田人工栽培的植物相比，不僅有效成分含量高而穩(wěn)定，而且不定根培養(yǎng)不受氣候、土地等因素的影響，可以周年大規(guī)模生產(chǎn)，適合于藥用植物尤其是狼毒這種根類藥材的組織培養(yǎng)和規(guī)?；a(chǎn)，以獲得狼毒藥材的替代物或生產(chǎn)其 主要有效成分。
經(jīng)對現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前除戴傳超等人進(jìn)行了藥用植物京大戟(Euphorbia pekinensis)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究外(見戴傳超、余伯陽、薛菲、蔣繼宏，藥用植物大戟懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，29 (2) :57-60)，尚無狼毒 (Euphorbia fischeriana)細(xì)胞、組織培養(yǎng)和生產(chǎn)方法的文獻(xiàn)報(bào)道，也未見有涉及狼毒 (Euphorbia fischeriana)不定根誘導(dǎo)及不定根培養(yǎng)體系建立的文獻(xiàn)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根細(xì)胞工程生產(chǎn)技術(shù)，提供一種狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法。使其來自于自大田栽培狼毒植物的種子的無菌小苗在愈傷組織誘導(dǎo)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，并使狼毒愈傷組織在不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成不定根，形成一種規(guī)模大、周期短、質(zhì)量可控、成本低的不定根生產(chǎn)方法。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括如下具體步驟
(I)狼毒無菌小苗的獲得取野生狼毒植株的種子置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)條件下萌發(fā)成無菌小苗；
(2)狼毒愈傷組織的誘導(dǎo)具體為取步驟(I)獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于含2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-芐氨基腺嘌呤出-BA)三種植物生長調(diào)節(jié)劑和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；
(3)狼毒不定根的誘導(dǎo)取步驟(2)獲得的狼毒愈傷組織置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導(dǎo)形成不定根；
(4)狼毒不定根的培養(yǎng)取步驟(3)獲得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下培養(yǎng)。
步驟⑴中所述的小苗為誘導(dǎo)自野生狼毒植株的種子。
步驟(2)中所述的愈傷組織，是指源于無菌小苗的愈傷組織。
步驟(I)中所述的培養(yǎng)基，是指不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基。
步驟(I)中所述的光照培養(yǎng)條件下，是指于24_26°C、3000勒克斯(Iux)光照強(qiáng)度的條件下誘導(dǎo)25-30天。
步驟(2)中所述的培養(yǎng)基，是指含有0.2-2mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、O.1-lmg/L 萘乙酸(NAA)、0· 02-0. 2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和 2_3ml/L 椰子汁的 MS 固體培養(yǎng)基。
步驟(2)中所述的無菌避光條件下，是指于24_26°C無菌避光條件下誘導(dǎo)25_30天。
步驟(3)中所述的培養(yǎng)基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和l_2ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基。
步驟(3)中所述的無菌避光條件下，是指于24_26°C無菌避光條件下誘導(dǎo)25_30天?！?019]步驟(4)中所述的培養(yǎng)基，是指含有l(wèi)_2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基。
步驟(4)中所述的無菌避光條件下，是指于24_26°C無菌避光條件下誘導(dǎo)25_30天。
本發(fā)明方法簡便、效率高，來源于狼毒無菌小苗愈傷組織不定根的誘導(dǎo)率在 90. 0%以上，狼毒有效物質(zhì)prostratin含量高，建立了完善的不定根培養(yǎng)體系。


圖I為狼毒有效物質(zhì)prostratin的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
圖2為prostratin標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。
圖3為狼毒不定根樣品的高效液相色譜圖。
圖4為狼毒不定根樣品加prostratin標(biāo)準(zhǔn)品后的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :狼毒種子的萌發(fā)
取野生狼毒植株的種子，經(jīng)O. 2% HgCl2消毒12分鐘、用無菌水沖洗3遍后置于不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基上，于26°C、3000勒克司(Iux)光照條件下培養(yǎng)25 天，即可萌發(fā)成小苗。
實(shí)施效果狼毒種子的萌發(fā)率達(dá)5.0%，所萌發(fā)成的無菌小苗具有完整的根、莖、葉，生長正常。
實(shí)施例2 :狼毒愈傷組織的誘導(dǎo)將實(shí)施例I獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于含lmg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2， 4-D)，0. 5mg/L萘乙酸，O. lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)三種植物生長調(diào)節(jié)劑和3ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于24-26°C無菌避光條件下誘導(dǎo)25天，即得到狼毒的愈傷組織。
實(shí)施效果狼毒愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)80. O %。2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)，萘乙酸， 6-芐氨基腺嘌呤這三種植物生長調(diào)節(jié)劑和椰子汁的共同作用促進(jìn)了愈傷組織的形成和生長。
實(shí)施例3 :狼毒不定根的誘導(dǎo)
將實(shí)施例2獲得的狼毒愈傷組織置于含10mg/L吲哚丁酸這種植物生長調(diào)節(jié)劑和 2ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于24-26°C無菌避光條件誘導(dǎo)培養(yǎng)25天，即得到狼毒的不定根。
實(shí)施效果不定根誘導(dǎo)率達(dá)90. 0%，不定根細(xì)、短，并側(cè)向分生出細(xì)、短的不定根， 不定根發(fā)生輕微的愈傷化。
實(shí)施例4 :狼毒不定根固體培養(yǎng)體系的建立
將實(shí)施例3獲得的狼毒不定根從其母體愈傷組織上分離，將分離到的不定根置于含有2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上，于24-26°C無菌避光條件誘導(dǎo)培養(yǎng)25天，即得到大量的狼毒的不定根。
實(shí)施效果建立了不定根的體外固體培養(yǎng)體系，側(cè)向分生出大量細(xì)長的不定根。經(jīng)高效液相色譜儀分析，所得狼毒不定根中有效物質(zhì)prostratin的含量為42. 21 μ g/g干重。
權(quán)利要求
1.一種狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法,其特征在于，包括以下具體步驟(1)狼毒無菌小苗的獲得取狼毒的種子置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)條件下萌發(fā)成無菌小苗；(2)狼毒愈傷組織的誘導(dǎo)具體為取步驟(I)獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于含 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-芐氨基腺嘌呤出-BA)三種植物生長調(diào)節(jié)劑和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；(3)狼毒不定根的誘導(dǎo)取步驟(2)獲得的狼毒愈傷組織置于含吲哚丁酸和椰子汁的 MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導(dǎo)形成不定根；(4)狼毒不定根的培養(yǎng)取步驟(3)獲得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(I)中所述的小苗為誘導(dǎo)自野生狼毒植物的種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(2)中所述的愈傷組織，是指源于狼毒無菌小苗的愈傷組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(I)中所述的培養(yǎng)基，是指不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼 毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(I)中所述的光照培養(yǎng)條件下，是指于24-26°C、3000勒克斯(Iux)光照強(qiáng)度的條件下誘導(dǎo)25-30 天。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(2)中所述的培養(yǎng)基，是指含有O. 2-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0. 1-lmg/L萘乙酸(NAA)、 O. 02-0. 2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和2_3ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(3)中所述的培養(yǎng)基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和l-2ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(4)中所述的培養(yǎng)基，是指含有l(wèi)_2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的狼毒不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，其特征是，步驟(2)、 步驟(3)、步驟(4)中所述的無菌避光條件下，是指于24-26°C無菌避光條件下培養(yǎng)25-30 天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)的方法，屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。包括(1)種子的萌發(fā)狼毒種子經(jīng)HgCl2消毒后置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照下萌發(fā)；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)將步驟(1)獲得的小苗置于含2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-芐氨基腺嘌呤和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；(3)不定根的誘導(dǎo)將步驟(2)獲得的愈傷組織置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導(dǎo)形成不定根；(4)不定根的培養(yǎng)將步驟(3)獲得的不定根置于含有吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明方法簡單、有效物質(zhì)含量高。
文檔編號A01H4/00GK102870672SQ201110193279
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者邱德有, 劉洪偉, 楊艷芳, 張楠 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所