專利名稱：水稻miR166在提高植物鎘脅迫耐受性中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及功能基因組學領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻miR166在提高植物對鎘脅迫耐受性中的應用。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)污染的加劇以及含重金屬肥料的大量使用，重金屬已經(jīng)成為造成土壤污染的禍首之一。我國重金屬引起的土壤污染形勢已相當嚴峻。2006年我國受鎘、砷、鉻、鉛等重金屬污染的耕地近3億畝，約占耕地總面積的1/5 ；我國每年因重金屬污染糧食達1200 萬噸，造成直接經(jīng)濟損失超過200億元。其中，鎘(Cadmium，Cd)作為污染最嚴重的重金屬之一，污染面積和程度呈上升趨勢，不僅影響土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，而且能抑制作物的生長發(fā)育，降低產(chǎn)量和品質(zhì)，并通過食物鏈進入人體，引發(fā)各種疾病，最終危害人體健康。水稻是世界上最重要的農(nóng)作物，全球一半以上的人口以稻米為主食，我國是世界上第一種稻大國， 目前我國稻米中重金屬超標現(xiàn)象已引起了國家各部委的高度重視。因此，探明水稻對重金屬的耐受機理，提出避免水稻重金屬傷害的有效措施和提高重金屬抗性以及降低稻米中重金屬的累積，將對保障農(nóng)產(chǎn)品安全、生態(tài)安全和人民健康，促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。植物在長期的進化過程中產(chǎn)生了對重金屬的多種抗性。不同的植物種類或同種植物不同的基因型對于重金屬脅迫的抗性反應機制是不完全相同的，也是十分復雜。近年來從生理生化與分子水平上開展了大量的基礎(chǔ)研究工作，研究表明有機酸、氨基酸、含氮化合物，植物螯合肽(Wiytochelatin，PC)和金屬硫蛋白在植物對重金屬的解毒作用中發(fā)揮了重要作用。一些與植物重金屬耐性相關(guān)的基因也得到了鑒定與功能的描述，這些抗逆基因基本為直接參與代謝與生理變化的效應基因，它們通過控制代謝小分子或蛋白的表達參與抗逆過程。目前一些研究功能基因組學的新方法和實驗技術(shù)體系如cDNA微陣列、基因芯片、基因表達系統(tǒng)分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、基因高支除(gene knockout)和RNAi分析均能有效分析大量基因的表達和功能模式，并在重金屬相關(guān)功能基因資源發(fā)掘上取得了一定進展。植物參與環(huán)境脅迫響應還有另一類重要的功能基因即調(diào)節(jié)基因，它們通過調(diào)控其下游許多逆境誘導基因的表達而間接影響代謝與生理過程，但這一類重金屬耐性的調(diào)節(jié)基因研究報道甚少，重金屬相關(guān)功能基因資源發(fā)掘尚待開展。微RNA (microRNA,或miRNA)就是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的小分子RNA。 miRNA廣泛存在于植物基因組中的、長度約為22個核苷酸的、內(nèi)源非編碼小分子RNA，它自從被發(fā)現(xiàn)以來就成為生命科學領(lǐng)域的研究熱點。miRNA作為新型的調(diào)控基因表達的小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平上通過介導靶mRNA分子的切割或翻譯抑制來調(diào)節(jié)植物基因的表達，從而調(diào)控植物器官的形態(tài)建成、生長發(fā)育、激素分泌與信號轉(zhuǎn)導以及植物對外界環(huán)境脅迫因素的應答等過程。隨著內(nèi)源小RNA的發(fā)現(xiàn)及其功能研究，利用小RNA技術(shù)改良植物對生物與非生物脅迫的耐性成為了一個重要的技術(shù)手段。miRNA對重金屬耐性的功能研究，并通過小RNA的遺傳操作改良禾本科作物的抗逆性，將為解決作物對重金屬耐性問題提供新思路，并具有重要的應用前景。目前，國內(nèi)外還沒有利用基因工程手段將參與重金屬應答的 miRNA導入水稻、玉米、草莓、煙草等作物獲得重金屬耐受作物株系，但通過小分子RNA的遺傳操作改良作物的抗逆性的前景很光明。近年來的研究表明，miRNA在植物重金屬脅迫響應過程中扮演著重要角色。楊志敏等發(fā)現(xiàn)在甘藍型油菜和蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表達可受重金屬鎘的誘導與調(diào)節(jié)(Xie， F. L. , Huang, S. Q. , Guo, K. , Xiang, A. L. , Zhu, Y. Y. , Nie, L. , Yang, Ζ. Μ. Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus. FEBS Lett, 2007,581 :1464-1474 ；Zhao,S. Z.，Si，Q. H.，Zhi，M. Y. Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula. Biochem. Biophys. Res. Commun，2008，374 =538-542.)。他們還構(gòu)建鎘脅迫下水稻幼苗的small RNA文庫，克隆了 19個新的miRNA，并發(fā)現(xiàn)其中多數(shù)miRNA在鎘脅迫下表達發(fā)生變化，如miR604在鎘處理下表達下調(diào)，其靶基因脂轉(zhuǎn)移蛋白表達上升。而且脂轉(zhuǎn)移蛋白參與植物多種抗逆性反應并介導植物激素信號轉(zhuǎn)導等過程(Huang, S. Q.，Peng, J.，Qiu, C. X.，Yang, Ζ. Μ. Heavy metal-regulated new microRNAs from rice. J. Inorg. Biochem, 2009,103 :282e287.)。朱健康等在2006年研究發(fā)現(xiàn)miR398在擬南芥抵抗強光、重金屬Cu、Fe等氧化脅迫中發(fā)揮作用在氧化脅迫條件下，miR398的表達量被誘導降低，miR398調(diào)控的Cu/Si超氧化物歧化酶(CSDs)mRNA的表達量升高，Cu/Si超氧化物歧化酶可快速地將超氧化物轉(zhuǎn)變成過氧化物和分子氧，組成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防線，導致擬南芥對重金屬脅迫的耐受性也大大增力口(Sunkar, R. , Kapoor, A. , Zhu, J. K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell,2006,18 2051-2065.)。miR166是一種廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中的miRNA。在植物眾多miRNA中，研究表明miR166通過調(diào)節(jié)其靶基因同源異型域一亮氨酸拉鏈蛋白 (homeodomain-leucine zipper protein, HD-Zip)，從而調(diào)控擬南芥和水稻的葉、花、根的生長發(fā)育，并且在植物對逆境脅迫的響應過程中發(fā)揮著重要作用。過量表達miR166會造成擬南芥植株生長受抑，花器官簇生，頂端分生組織發(fā)育異常等表型。蒺藜苜蓿中過量表達 miR166會造成植株根瘤和側(cè)根數(shù)目減少，維管系統(tǒng)發(fā)育異常。受干旱誘導表達的miR166通過影響根的數(shù)量和維管組織，從而來調(diào)節(jié)植物的抗干旱能力。在缺水脅迫下蒺藜苜蓿根中 miR166表達上調(diào)，且野生型蒺藜苜蓿在缺水脅迫下的表型與過表達miR166的轉(zhuǎn)基因的植株表型相似。干旱脅迫下野生二粒小麥和大麥根中的miR166均表達下調(diào)，可能存在其他的未鑒定的靶基因。鹽脅迫下玉米的miR166表達下調(diào)。水稻miR166還與冷脅迫和赤霉素處理有關(guān)。以上研究結(jié)果表明，miR166不僅可以調(diào)節(jié)葉、花、根的發(fā)育，并且在植物應答多種環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻miR166在提高植物鎘脅迫耐受性中的應用。一種水稻miR166在提高植物鎘脅迫耐受性中的應用，所述水稻miR166的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
優(yōu)選的，所述植物為水稻。具體方法為將包含所述水稻miR166的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選培養(yǎng)，獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系。由于miR166本身序列很短，只有20幾個bp，而前體序列相對較長，連接到載體上， 有利于轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，優(yōu)選的，所述前體基因的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明通過將水稻miR166轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代種子播種在含鎘培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)該miRNA可以提高植物對鎘脅迫的耐受性，緩解鎘對它的毒害。


圖1為7天齡水稻幼苗60uM Cd脅迫Mi根的miRNA芯片圖譜，(Cy3對照；Cy5處理樣品)；圖2為7天齡水稻幼苗60uM Cd處理3，6，12，24h后，miR166m及其靶基因HD-Zip 的表達分析；圖3為miR166m過表達載體構(gòu)建的過程凝膠圖譜。a. miR166m前體PCR擴增凝膠圖譜；b. pMD19-T-miR166m質(zhì)粒酶切鑒定圖；c. pl301-miR166m重組質(zhì)粒菌液PCR擴增凝膠圖譜；d. pl301-miR166m重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖4為miR166m過表達水稻種子在60uM Cd處理下萌發(fā)7d后表型，(WT對照；35S MIR166m轉(zhuǎn)基因水稻)；圖5為生長五周的miR166m過表達水稻經(jīng)200uM Cd處理14d的表型，(WT對照； 35S :MIR166m轉(zhuǎn)基因水稻)。
具體實施例方式實施例1基因的獲得以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理Mi和對照組 (未處理)的根0. lg，用液氮研磨并加入Iml TrizoKInvitrogen生產(chǎn))繼續(xù)研磨至勻漿， 轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，12000 Xg離心lOmin，收集上清至新離心管中。室溫放置5min，加入 0. 2ml氯仿用力震蕩15s，使溶液充分混勻。室溫放置5min，12000Xg離心15min，收集上清。加兩倍上清體積的異丙醇，_20°C過夜沉淀。12000 Xg離心lOmin，去上清，加ImL預冷的75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗沉淀。12000 Xg離心lOmin，倒盡液體，室溫干燥5min，沉淀重溶于50 μ L DEPC (焦碳酸二乙酯)水。取2 μ g Total RNA進行電泳檢測，并稀釋樣品測 OD 260/280, OD 260/230 及濃度。利用 2-5 μ g 總 RNA 樣品，通過 YM-100 (Millipore)微離心過濾柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分離到的小RNA 3'端加上 poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接，(ligation)用于后續(xù)的熒光標記。用兩個不同的標記物Cy3和Cy5來標記處理組和對照組的兩個RNA樣品。利用 Versionll. OmicroRNA 數(shù)據(jù) 庫，(http://microrna.sanger.ac.uk/ sequences/)制作μ Paraf Ιο 微流體芯片探針。雜交反應通過利用μ Paraf Ιο 微流體芯片，檢測在60uM CdCl2脅迫下水稻根中miRNA的表達差異，如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR166m 在Cd處理他后表達量比對照(未處理)下降2倍以上。根據(jù)Sanger microRNA數(shù)據(jù)庫(miRBase)和TIGR數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)miR166m是水稻
5miR166家族成員之一，位于8號染色體，來源于基因間區(qū)域。成熟序列如SEQ ID NO. 1所示，前體序列如SEQ ID NO. 2所示。根據(jù)miRU靶基因預測軟件發(fā)現(xiàn)，miR166m的靶基因是同源異型域一亮氨酸拉鏈蛋白(homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip)。根據(jù) NCBI 和 TIGR 數(shù)據(jù)庫查詢， HD-Zip基因號為0s03g43930，mRNA長度為3081bp，CSD為2589bp，基因編碼產(chǎn)物大小166
個氨基酸。以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，用60uM CdCl2處理0，3，6，12， Mh，用Trizol法分別提取RNA，并用DNase I消化以去除DNA污染。采用I^rimeScriptTM RT reagent kit (Takara，Japan)合成cDNA。miR166m利用具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物進行反轉(zhuǎn)錄(RT 引物序列5’ -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGGGA A3-，) ；HD-Zip利用 oligo-d(T)進行反轉(zhuǎn)錄，采用 SYBR Premix Ex TaqTM(Takara，Japan)， 在 LightCycler480(Roche，Shanghai, China)熒光定量 PCR 儀上擴增 miR166m 和 HD_Zip， PCR反應條件為95°C lmin，變性95°C 10s，退火58°C 15s，延伸72°C 15s，45個循環(huán)。PCR引物如下miR166m-F, 5 ’ -GTCGGACCAGGCTTCA-3 ’miR166m-R, 5 ’ -TGCGTGTCGTGGAGTC-3 ‘HD-Zip-F, 5，-ATGTCAAGAACCTCCCCAG-3，HD-Zip-R, 5，-CACACGCAAAAATCACTCA—3，如圖2所示，實時定量PCR實驗結(jié)果驗證了 miR166m對HD-Zip的負調(diào)控。實施例2基因克隆與轉(zhuǎn)化以野生型水稻中花11七天苗齡幼苗DNA為模板，利用PCR方法擴增到miR166m前體基因的序列。具體操作如下首先，提取野生型水稻中花11七天齡幼苗DNA。取約0.2g 水稻葉片用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移粉末到加有500 μ 1提取液(IOOmM Tris-HCl, ρΗ 8. 0 ； 20mM EDTA ；500mM NaCl)的離心管中，輕輕混勻。向管中加入100μ1 10% SDS溶液，混勻，65°C保溫20min。然后加氯仿/異戊醇/乙醇QO 1 4)混合液600 μ 1，室溫靜止 IOmin0 4°C，12000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中。加入Iml預冷的無水乙醇充分混勻，-20°C沉淀DNA 20min。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，加70%乙醇500 μ 1進行洗滌。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清。輕微離心，用移液器將殘留液體吸干。吹干DNA 沉淀后，溶于100μ 1含RNase酶(10yg/ml)TE中，37°C水浴30min，_20°C保存。根據(jù)已知的 miR166m 前體序列(http://www. mirbase. org/cgi_bin/get_seq. pi),在 database 中查閱其所在基因組位點的兩端的序列，分別在前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩端約50bp處設(shè)計引物，所設(shè)引物如下 miR166m-F, 5 ’ -CGGGGTACCCTTTCTCTGCTTTGGTGGTT-3 ’miR166m-R,5' -AACTGCAGTTCCGATGGATTTCCTGGAC-3‘接著以DNA為摸板，利用所設(shè)引物擴增miR166m前體基因。PCR反應體系為 20μ 1，依次加入 DNA 模板 1μ 1U0XPCR buffer 2 μ 1、IOmMdNTPs 2口1、10口] 正向引物 (miR166m-F) 0. 5 μ 1、10 μ M 反向引物(miR166m_R) 0. 5 μ 1、TaKaRa Taq (5U/ μ 1)聚合酶 0. 2μ 1，最后加ddH20補至20μ 1。PCR反應條件預變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸72°C 30s，30個循環(huán)，最后延伸72°C 10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物凝膠圖譜如圖3. a所不。擴增后將miR166m前體基因DNA產(chǎn)物，利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，操作如下將DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入1. 5ml 的Eppendorf管中，稱取重量。加入6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置30min。將溶膠液加入吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。加入600 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。12000rpm離心2min，室溫放置數(shù)分鐘徹底晾干。將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，加入40 μ 1洗脫緩沖液EB，12000rpm離心 2min收集DNA溶液。將回收的miR166m前體基因DNA與pMD19-T載體(TakaRa)進行連接反應，連接體系 ομ 1，分別加入0. 5μ 1 PMD19-T載體、4. 5μ 1純化的miR166m前體的DNA、5 μ 1 Solution I。16°C下連接池后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。通過 Amp篩選，挑取陽性克隆，經(jīng)PCR反應驗證及測序鑒定正確后，選取正確的菌液提取質(zhì)粒 pMD19-miR166m。利用天根公司生產(chǎn)的普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒操作如下取3ml菌液加入離心管中，12000rpm離心lmin，盡量吸出上清液。向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ 1的溶液Pl (含RNaseA)，徹底懸浮細菌沉淀。加入250 μ 1溶液 Ρ2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)使菌體充分裂解。加入350μ 1溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)充分混勻， 12000rpm離心lOmin。收集上清液，轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12000rpm離心60s，倒掉廢液。加入600 μ 1已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉廢液并漂洗兩次。將吸附柱CP3放入收集管，12000rpm離心2min，置于室溫徹底晾干。加入55 μ 1洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。將提取的質(zhì)粒pMD19-miR166m和DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA1301同時都用iTakafci 公司生產(chǎn)的KpnI和I3StI進行雙酶切。酶切體系50μ 1，包括5μ 1 IOXM buffer, 30 μ 1 pMD19-miR166m 質(zhì)粒(或 pCAMBIA1301 質(zhì)粒)、1 μ 1 KpnIU μ 1 PstI 禾口 13μ 1 ddH20，37°C 水浴過夜。pMD19-miR166m質(zhì)粒酶切結(jié)果如圖3. b所示。將DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA1301 和克隆質(zhì)粒pMD19-miR166m酶切后，割膠回收DNA片段。接著用T4連接酶連接，連接體系 10口1,包括1“1 pCAMBIA1301 載體、7· 5μ 1 miR166m DNAU μ 1 10XΤ4 連接酶 buffer 和 0.5μ1 Τ4連接酶，16°C連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中， 進行菌液PCR，并提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果如圖3. c和圖3. d所示。將正確的植物表達載體pl301-miR166m導入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105，操作如下取200 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，加入1μ gpl301-miR166m質(zhì)粒，混勻，冰浴5min，液氮中速凍5min，37°C水浴5min，然后加入Iml YM培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)4h。IOOOOg離心30s，棄上清，吸200 μ 1菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40 μ g/1利福平的YM平板，培養(yǎng)，約4 后長出農(nóng)桿菌單菌落。 搖菌，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA重新轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，再提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性質(zhì)粒pl301_miR166m，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化到水稻愈傷。操作如下首先活化農(nóng)桿菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培養(yǎng)基上劃線，28°C 暗培養(yǎng)。收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于含有200 μ M己酰丁香酮(As)的AAM液體懸浮培養(yǎng)基中。調(diào)整菌體濃度至0D600為0. 8 1. 0，倒入含繼代培養(yǎng)1周的水稻愈傷組織的無菌三角瓶，侵染lOmin，并不時晃動。然后將愈傷組織置于無菌的濾紙上浙干30min后，置于鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無菌水清洗5-6次，再用含500mg/L頭孢拉定的無菌水清洗1 2遍，置于無菌濾紙上浙干 lh。將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進行第一輪選擇J8°C，暗培養(yǎng)14天。然后將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到新的含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上進行第二輪選擇J8°C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上，于25°C，12h光照/1 黑暗條件下培養(yǎng)。待再生小苗長成約Icm高時，將其移到生根培養(yǎng)基上壯苗，25°C， 12h光照/1 黑暗條件下培養(yǎng)。最后將轉(zhuǎn)基因苗挑出，加入適量蒸餾水煉苗3天至一周左右，洗去瓊脂，培養(yǎng)箱水培1周，移栽到溫室的土缽中生長。挑選生長正常的植株，進行潮霉素PCR篩選和⑶S染色，獲得陽性TO代植株，共16個株系。收獲Tl代種子繁種并鑒定至 T2代，獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系。實施例3 miRNA鎘耐性功能鑒定取T2代轉(zhuǎn)基因株系種子和中花11野生型的種子，稀HNO3破休眠處理16h。倒去稀HNO3,10% NaClO(有效氯約1 1. 2% )消毒20min后用蒸餾水沖洗。將種子浸泡在水中，37°C暗處催芽約兩天，再在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一天至露白。挑選生長一致的露白的轉(zhuǎn)基因株系和野生型的種子，同時轉(zhuǎn)移入0uM、60uM CdCl2W瓊脂培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中(白天/黑夜26°C/22°C，i;3h/llh)。培養(yǎng)7天后，觀察轉(zhuǎn)基因株系與野生型幼苗在鎘脅迫下的表型。如圖4所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60uMCdCl2處理下，miR166m過表達的轉(zhuǎn)基因幼苗相比野生型幼苗，根數(shù)目、種子根長度和冠根長度都顯著增加，說明miR166m超量表達可以緩解鎘對水稻的毒害。取T2代轉(zhuǎn)基因株系種子和中花11野生型的種子，稀HNO3破休眠處理16h。倒去稀HNO3,10% NaClO(有效氯約1 1. 2% )消毒20min后用蒸餾水沖洗。將種子浸泡在水中，37°C暗處催芽約兩天，再在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一天至露白。挑選生長一致的露白的轉(zhuǎn)基因株系和野生型的種子播于網(wǎng)格上，放入盛有水稻營養(yǎng)液(按國際水稻所標準營養(yǎng)液配方進行配制)的桶中，置于水稻培養(yǎng)箱中(白天/黑夜^TC/22°C，i;3h/llh; Rh 80%)培養(yǎng)，營養(yǎng)液每5天換一次。將轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻在正常的營養(yǎng)液中培養(yǎng)五周后，挑選生長一致的水稻植株用200uMCdCl2處理，觀察轉(zhuǎn)基因株系與野生型大苗在鎘脅迫下的表型。如圖5所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200uM CdCl2處理14d后，miR166m過表達的轉(zhuǎn)基因幼苗相比野生型幼苗，苗更加健壯，葉片仍保持綠色，說明miR166m超量表達株系對鎘毒害具有一定的耐受作用。
權(quán)利要求
1.一種水稻miR166在提高植物鎘脅迫耐受性中的應用，所述水稻miR166的堿基序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述植物為水稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，包括將包含所述水稻miR166的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選，培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因株系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述前體基因的堿基序列如SEQID NO. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻miR166在提高植物鎘脅迫耐受性中的應用，所述水稻miR166的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明通過將水稻miR166轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代種子播種在含鎘培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)該miRNA可以提高對鎘脅迫的耐受性，緩解鎘對它的毒害。
文檔編號A01H5/00GK102250949SQ20111019394
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者丁艷菲, 劉海麗, 朱誠, 江瓊, 潘家榮, 王飛娟 申請人:中國計量學院