專利名稱：一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生的方法。
背景技術(shù)：
小麥組織培養(yǎng)為小麥無性系變異、胚挽救、外源基因的轉(zhuǎn)化等工作提供了必要的基礎(chǔ)，而高頻再生則是小麥組織培養(yǎng)的關(guān)鍵。目前小麥組織培養(yǎng)獲得成功的外植體有根、幼穗、幼胚、花藥、成熟胚等。在這之中，幼胚培養(yǎng)的再生效率最高，而成熟胚培養(yǎng)再生最為困難。然而，幼胚的取材受季節(jié)、時間以及單株之間不同生理狀態(tài)的限制極大，在自然條件下無法全年持續(xù)供應(yīng)，利用溫室栽培技術(shù)進行整年持續(xù)種植則對條件要求嚴(yán)格且耗資巨大。成熟胚作為外植體源具有易儲藏、 取材方便、一次收獲可大量持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)等特點，且具有成本低、個體間生理狀態(tài)一致、方便實用等諸多優(yōu)點，因此成為目前研究者進行突破的熱點。小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的體系主要受基因型限制極大，不同的體系對不同的基因型培養(yǎng)效果差異較大。植物愈傷組織的分化是依賴于細(xì)胞分裂素和生長素的比值，該比值高則利于芽的分化，該比值低則利于根的分化。通常小麥成熟胚愈傷組織分化率的平均水
23%0zgenM，Turet Μ, Altinok S et al. Efficient callus induction and plant regeneration from mature embryo culture of winter wheat (Triticum aestivum L.) genotypes. Plant Cell R印，1998，18 (3 4) :P. 331 335，如何提高小麥成熟胚愈傷組織分化效率一直是人們關(guān)注的焦點。小麥成熟胚培養(yǎng)及再生離不開誘導(dǎo)培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基。小麥成熟胚愈傷組織分化率取決于再生培養(yǎng)基，而再生培養(yǎng)基一般是以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加適量的激素， 所述的激素一般包括細(xì)胞分裂素(如ZT，KT等)和生長素(如2，4-D，IAA, NAA等)，據(jù)報道，現(xiàn)有的再生培養(yǎng)基中，細(xì)胞分裂素的添加量一般為0. 1 ang/L，生長素的添加量一般為0. 1 lmg/L。例如激素濃度配比中采用ZT比IAA為2. 0mg/L比0. 5mg/L陳俊男， 高潤紅，鄧志英，田紀(jì)春.小麥成熟胚組織培養(yǎng)體系優(yōu)化及優(yōu)良轉(zhuǎn)化受體基因型的篩選.山東農(nóng)業(yè)科學(xué).2010，11 :P. 1-5、或采用KT比2，4-D為0. lmg/L比0. 5mg/L畢瑞明，王洪剛.小麥成熟胚的組織培養(yǎng).中國農(nóng)學(xué)通報.2007，23卷，2期P. 53-57或采用1. 0 1. 5mg/L比0. 2 0. 5mg/L劉香利，劉縉，郭藹光，趙惠賢.小麥不同外植體離體培養(yǎng)與再生研究.麥類作物學(xué)報.2008, ) :P. 568-572;劉芳、周翠紅、李麗雅，侯文卓，王強，郭藹光，劉香利.不同遺傳背景小麥成熟胚再生體系的初步研究.麥類作物學(xué)報.2010，30(1) P. 39-42、或采用KT比NAA為0. 6mg/L比0. 4mg/L曹新有，李春蓮，余玲，任慧莉，陳耀鋒.小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究.西北植物學(xué)報.2006，沈(11) :P. 2276-2觀0 ；李根英，黃承彥，隋新霞，何中虎，孫其信，夏先春.小麥不同外植體的組織培養(yǎng)效果研究.麥類作物學(xué)報.2006，洸(1) :P. 21-25，也有人提出單獨使用ΚΤ0. 5 2. 0mg/L貴夢園，魏琦超，何男男，歐行奇，趙俊杰，張勝利，周巖.不同基因型小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與分化.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué).2009 (9)，48 (9) :P. 2049-2051 等。
在本領(lǐng)域，有人認(rèn)為再生培養(yǎng)基中如果KT濃度過高易導(dǎo)致愈傷組織褐化死亡曹新有，李春蓮，余玲，任慧莉，陳耀鋒.小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究.西北植物學(xué)報.2006，沈(11) :P. 2276-2280，因此較少有人在分化過程中使用超常規(guī)高濃度KT唐宗祥，張懷瓊，張懷渝，晏本菊，任正隆.2，4-D、KT對小麥成熟胚愈傷組織形成、分化的影響.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2004，22卷，3期P. 203-205。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對目前小麥成熟胚愈傷組織分化率的平均水平較低的實際問題，提供一種新的小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其特征在于，再生培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加麥芽糖，MES, KT, NAA，再生培養(yǎng)基中麥芽糖的濃度為 40g/L, MES 濃度為 1. 95g/L，KT 為 5mg/L, NAA 為 0. lmg/L, pH = 5. 8 ；小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的具體方法為a)挑選成熟飽滿的小麥種子，用70%酒精浸泡5min，0. 1% HgCl2滅菌20min，至少用無菌水沖洗4次后，再用無菌水中浸泡19 Mh，獲得種子的成熟胚；b)將種子的成熟胚去掉胚芽胚根后縱切，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23 25°C暗培養(yǎng)， 10 14天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)20 觀天，獲得小麥成熟胚愈傷組織；c)將小麥成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)入上述配制好的再生培養(yǎng)基中，23 25°C光照培養(yǎng)， 25 30天，誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織分化，形成再生植株苗。在本發(fā)明中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和鐵鹽，與B5基本培養(yǎng)基的維生素成分進行復(fù)合，再添加麥芽糖，MgCl2,水解酪蛋白，谷氨酰胺， MES，其中，麥芽糖的濃度為40g/L，MgCl2的濃度為0. 75g/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L， 谷氨酰胺濃度為300mg/L，所述培養(yǎng)基中MES濃度為1. 95g/L，pH = 5. 8。在本發(fā)明中，所述的23 25°C光照培養(yǎng)是指在培育期期內(nèi)，以環(huán)境溫度23 25°C，光照和黑暗每1 相間交替，光照強度20001UX。在本發(fā)明中，小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率至少為98%，小麥成熟胚愈傷組織分化率為23 50%。在本發(fā)明中，將分化出的再生植株苗接入1/2MS培養(yǎng)基中，按照傳統(tǒng)方法進行壯
苗培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點在于，由于再生培養(yǎng)基中采用細(xì)胞分裂素KT和生長素NAA并克服傳統(tǒng)觀念，提高了細(xì)胞分裂素KT的濃度，以及細(xì)胞分裂素KT與生長素NAA的比值，較大幅度的提高了小麥成熟胚愈傷組織分化率；同時KT價格較低，與ZT相比，可以降低培養(yǎng)基的成本；由于誘導(dǎo)培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基中的碳源均為麥芽糖，與砂糖或蔗糖相比，可以始終保持較高的滲透壓，提高小麥成熟胚愈傷組織的分化率。
具體實施例方式實施例11)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、鐵鹽，以及B5基本培養(yǎng)基的維生素，添加麥芽糖40g/L、氯化鎂0. 75g/L、水解酪蛋白500mg/L、谷氨酰胺300mg/L、 MES 1. 95g/L的固體培養(yǎng)基，pH = 5. 8。配制后用121°C高壓濕熱滅菌20min。2)再生培養(yǎng)基(簡稱KT 5. ONAA 0. 1再生培養(yǎng)基)再生培養(yǎng)基為含有MS基本培養(yǎng)基、麥芽糖40g/L、MES 1. 95g/L、KT 5mg/L、NAA 0. lmg/L的固體培養(yǎng)基，pH = 5. 8。配制后用121°C高壓濕熱滅菌20min。3)對照用再生培養(yǎng)基(簡稱KT 5. 0再生培養(yǎng)基)對照用再生培養(yǎng)基為含有MS基本培養(yǎng)基、麥芽糖40g/L、MES 1. 95g/L、KT5mg/L, pH = 5. 8。配制后用121°C高壓濕熱滅菌20min。實施例2小麥品種“花培1號”。挑選成熟飽滿的“花培1號”小麥種子，用70%酒精浸泡5min，0. 1 % HgCl2滅菌 20min，無菌水沖洗4次后，無菌水中浸泡19h，獲得種子的成熟胚。將小麥種子成熟胚去掉胚芽胚根后縱切接入上述配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(實施例1 提供，下同)中，23°C暗培養(yǎng)，10天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)20天，獲得小麥愈傷組織。將小麥愈傷組織分別轉(zhuǎn)入KT 5. 0 NAA 0. 1再生培養(yǎng)基和KT 5. 0再生培養(yǎng)基(均由實施例1提供，下同)，誘導(dǎo)再生苗的分化。培養(yǎng)期為30天，在培養(yǎng)期內(nèi)，以環(huán)境溫度23 25°C，光照和黑暗每1 相間交替，光照強度20001UX，小麥成熟胚愈傷組織分化為再生植株苗?；ㄅ?號的愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，采用KT 5. 0 NAA 0. 1再生培養(yǎng)基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為47. 8士 1. 6% ；采用KT 5. 0再生培養(yǎng)基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為15士3. 5%，前者是后者的3倍。經(jīng)過方差分析，每個品種在兩種不同激素配比的培養(yǎng)基上的分化率在P = 0. 05水平上差異顯著。實施例3小麥品種“寧麥13”挑選成熟飽滿的“寧麥13”小麥種子，用70%酒精浸泡5min,0. 1% HgCl2滅菌 20min，無菌水沖洗5次后，無菌水中浸泡Mh，獲得種子的成熟胚。將小麥種子成熟胚去掉胚芽胚根后縱切接入上述配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)，14天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)觀天，獲得小麥愈傷組織。將小麥愈傷組織分別轉(zhuǎn)入KT 5. 0 NAA 0. 1再生培養(yǎng)基和KT 5. 0再生培養(yǎng)基，誘導(dǎo)再生苗的分化。培養(yǎng)期為洲天，在培養(yǎng)期內(nèi)，以環(huán)境溫度23 25°C，光照和黑暗每1 相間交替誘導(dǎo)，光照強度20001UX，小麥成熟胚愈傷組織分化為再生植株苗。寧麥13的愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，采用KT 5. 0 NAA 0. 1再生培養(yǎng)基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為23. 3士3. 8% ；采用KT 5. 0再生培養(yǎng)基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為7. 5士 1. 6%，前者是后者的3倍。經(jīng)過方差分析，每個品種在兩種不同激素配比的培養(yǎng)基上的分化率在P = 0. 05水平上差異顯著。實施例4小麥品種“揚麥158”挑選成熟飽滿的“揚麥158”小麥種子，用70%酒精浸泡5min，0. 1% HgCl2滅菌 20min，無菌水沖洗5次后，無菌水中浸泡22h，獲得種子的成熟胚。將小麥種子成熟胚去掉胚芽胚根后縱切接入上述配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)，12天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)M天，獲得小麥愈傷組織。將小麥愈傷組織分別轉(zhuǎn)入KT 5. 0 NAA 0. 1再生培養(yǎng)基和KT 5. 0再生培養(yǎng)基，誘導(dǎo)再生苗的分化。培養(yǎng)期為洲天，在培養(yǎng)期內(nèi)，以環(huán)境溫度23 25°C，光照和黑暗每1 相間交替，光照強度20001UX，小麥成熟胚愈傷組織分化為再生植株苗。揚麥158的愈傷組織誘導(dǎo)率平均為100%，采用KT 5. 0 NAA 0. 1再生培養(yǎng)基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為25. 0士2. 9% ；采用KT 5. 0再生培養(yǎng)基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為8. 3士2. 9%，前者是后者的3倍。經(jīng)過方差分析，每個品種在兩種不同激素配比的培養(yǎng)基上的分化率在P = 0. 05水
平上差異顯著。以上各實施例不是對本發(fā)明的限制，具體實施時，對小麥成熟胚進行誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)時，可以采用傳統(tǒng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對各實施例中獲得的再生植株苗還應(yīng)該接入1/2MS 培養(yǎng)基中，按照傳統(tǒng)方法進行壯苗培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其特征在于，再生培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加麥芽糖，MES, KT, NAA，再生培養(yǎng)基中麥芽糖的濃度為40g/L，MES濃度為1. 95g/L， KT為5mg/L，NAA為0. lmg/L, pH = 5. 8 ；小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的具體方法為a)挑選成熟飽滿的小麥種子，用70%酒精浸泡5min，0.1 % HgCl2滅菌20min，至少用無菌水沖洗4次后，再用無菌水浸泡19 Mh，剝?nèi)》N子的成熟胚；b)將浸泡后種子的成熟胚去掉胚芽胚根后縱切，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23 25°C暗培養(yǎng)，10 14天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)20 觀天，獲得小麥成熟胚愈傷組織；c)將小麥成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)入上述配制好的再生培養(yǎng)基中，23 25°C光照培養(yǎng)，25 30天，誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織分化，形成再生植株苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和鐵鹽，與B5基本培養(yǎng)基的維生素成分進行復(fù)合，再添加麥芽糖，MgCl2,水解酪蛋白，谷氨酰胺，MES，其中，麥芽糖的濃度為40g/L， MgCl2的濃度為0. 75g/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，谷氨酰胺濃度為300mg/L，所述培養(yǎng)基中MES濃度為1. 95g/L, pH = 5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其特征在于，所述的 23 25°C光照培養(yǎng)是指在培育期期內(nèi)，以環(huán)境溫度23 25°C，光照和黑暗每1 相間交替，光照強度20001UX。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其特征在于，小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率至少為98%，小麥成熟胚愈傷組織分化率為23 50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其特征在于，將分化出的再生植株苗接入1/2MS培養(yǎng)基中，按照傳統(tǒng)方法進行壯苗培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥成熟胚培養(yǎng)及再生的方法，其再生培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再生培養(yǎng)基中麥芽糖為40g/L，MES為1.95g/L，KT為5mg/L，NAA為0.1mg/L，pH＝5.8；具體方法為挑選成熟飽滿的小麥種子，用70％酒精浸泡5min，0.1％HgCl2滅菌20min，至少用無菌水沖洗4次，再用無菌水中浸泡19～24h；再將種子的成熟胚去掉胚芽胚根后縱切，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23～25℃暗培養(yǎng)，10～14天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)20～28天，獲得小麥成熟胚愈傷組織；然后轉(zhuǎn)入上述配制好的再生培養(yǎng)基中，23～25℃光照培養(yǎng)，25～30天，誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織分化，形成再生植株苗。
文檔編號A01H4/00GK102283123SQ20111019669
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者余桂紅, 孫曉波, 張旭, 蔣蘇, 馬鴻翔, 魏芳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院