專利名稱：一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
煙草(Nicotiana tabacum 1^.),屬爺科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana) —年生草本植物。煙草是植物轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良受體和細(xì)胞遺傳學(xué)的模式植物，常被用來開展外源基因的表達(dá)和功能驗(yàn)證，同時(shí)，在生物工程領(lǐng)域被用來作為一種植物生物反應(yīng)器有效表達(dá)一些有實(shí)用價(jià)值的蛋白如人血清蛋白、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、疫苗、抗體、工業(yè)酶、生物多聚物等， 另外，利用煙草尼古丁的神經(jīng)毒性可用來制造殺蟲劑，還可以從煙草中提取蘋果酸、檸檬酸等物質(zhì)。煙草組織培養(yǎng)工作開展較早，主要包括花粉培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)和外植體愈傷誘導(dǎo)等， 目前，花藥培養(yǎng)成為了煙草組織培養(yǎng)的主要手段，但花藥培養(yǎng)存在花藥萌發(fā)時(shí)間偏長(zhǎng)、加倍效率較低、后期工作量大、花藥壁體細(xì)胞愈傷組織的干擾、后代群體遺傳同源性稍低及難以獲得大量有突破性的育種材料等缺點(diǎn)，且對(duì)于花粉較少的植物難以獲得大量目標(biāo)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有煙草組織培養(yǎng)的不足，提供一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，從花藥中快速大量釋放并獲取花粉，在花粉處于液體培養(yǎng)的游離狀態(tài)下用秋水仙素對(duì)其實(shí)施加倍處理，花藥萌發(fā)時(shí)間短、加倍效率高，較好的解決花藥培養(yǎng)過程中存在的諸多問題，為煙草作為植物生物反應(yīng)器的規(guī)?；a(chǎn)提供大量正常普通栽培種材料載體，同時(shí)為煙草分子生物學(xué)研究尤其是數(shù)量性狀的遺傳機(jī)理剖析提供大批高質(zhì)量的雙單倍體株系作為基礎(chǔ)試驗(yàn)材料。所述一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于依次按以下操作步驟進(jìn)行(1)、花蕾采取保存于晴天在煙草植株主花序或側(cè)花序上采取無病蟲、生長(zhǎng)良好的處于單核靠邊期的適齡花蕾一株或多株，將取好的花蕾迅速用冰盒保存；O)、花藥消毒將步驟1中保存在冰盒內(nèi)的花蕾在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)』ɡ僦械幕ㄋ帲缓髮內(nèi)〉幕ㄋ幱脽o菌紗布或無菌市售絲襪包裹浸入70-75%濃度的酒精中消毒 10-1 ，快速取出立即浸入飽和Ca(a0)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒過程中輕輕晃動(dòng)燒杯使其消毒充分，最后用無菌水沖洗多次；(3)、花粉獲取取出經(jīng)步驟2消毒好的花藥放入圓底試管中，加入l_3ml的B5-13 液體培養(yǎng)，再加入l_2ml用于軟化花藥壁的酶液，輕輕碾成勻漿，倒入裝有300-400目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，并用離心管收集濾液，向裝有濾液的離心管中加入B5-13液體培養(yǎng)至設(shè)定刻度，離心處理后去上清液，再加入B5-13液體培養(yǎng)重新懸浮，二次離心后再去上清液；
0)、花粉加倍與培養(yǎng)向步驟3中兩次離心后得到的花粉中加入含有濃度為 50-70mg/L秋水仙素的NLN-16液體培養(yǎng)基，使其重新懸浮后分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中，密封好后靜置于溫度為30-33°C的避光環(huán)境下培養(yǎng)48-7池，對(duì)花粉進(jìn)行加倍處理；然后將加倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到離心管，離心處理后去上清液，加入NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝入培養(yǎng)皿中，再次靜置于低溫環(huán)境下暗培養(yǎng)14-21d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中裝入加倍花粉的培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見胚時(shí)，便將其置于23-26°C恒溫?fù)u床上，振蕩暗培養(yǎng)7-10d，并對(duì)其進(jìn)行定時(shí)觀察，將達(dá)到子葉期的胚轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其溫度為25-27°C，每日光照8-lOh ； (6)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗2_3d，然后將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，便移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中。所述方法還包括染色體倍性的檢測(cè)步驟，其具體操作如下從步驟5中獲得的煙株上采取小面積的無菌苗葉片放置在無菌試驗(yàn)臺(tái)或是玻璃器皿中，向葉片滴加細(xì)胞裂解液，之后，立即將其切碎，然后將切碎的葉片置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)染色體倍性；或者從步驟5中獲得六片真葉以上的煙株上上采取葉片，取葉片的下表皮并置于載玻片上，滴入一滴碘-碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的顯微鏡下觀察其染色體倍性。步驟1中所述的適齡花蕾為花粉發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期、花萼與花冠等長(zhǎng)的花蕾，其蕾長(zhǎng)范圍在2. 0-2. 3cm之間。步驟2中飽和Ca(Cno)2溶液濃度為10%，其消毒時(shí)間為8-lOmin ；無菌水沖洗2_3 次，每次為3-5min。步驟3中所述酶液為纖維素酶、果膠酶、蝸牛酶和水的混合液，酶液中纖維素酶、 果膠酶和蝸牛酶的質(zhì)量濃度分別為0. 6%,0. 2%和0.5%。步驟3中第一次離心和步驟4中的離心時(shí)間為5-6min，轉(zhuǎn)速為1000-1100r/min， 步驟3中第二次離心時(shí)間為5-6min，轉(zhuǎn)速500_600r/min。步驟4選用直徑為7. 5cm的培養(yǎng)皿或IOOml的玻璃三角瓶，分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中的花粉混合液其密度為3蕾/ml-4蕾/ml，每皿2ml或每瓶10ml。步驟4中的第一次避光培養(yǎng)的溫度為32°C，第二次避光培養(yǎng)的溫度為25°C。步驟5中恒溫?fù)u床的振蕩轉(zhuǎn)速為55-65r/min。本發(fā)明對(duì)不同煙草類型均適用，尤其適用于普通煙草類型中的烤煙、白肋煙等。 用本發(fā)明的方法對(duì)烤煙和白肋煙的離體花粉進(jìn)行液體培養(yǎng)，具有花粉萌發(fā)成胚時(shí)間短、加倍效率高、產(chǎn)量大及較容易獲得優(yōu)良變異育種中間材料等優(yōu)點(diǎn)，在DH群體構(gòu)建、育種材料提純復(fù)壯、種質(zhì)資源創(chuàng)新、多倍體育種及花粉發(fā)育進(jìn)程研究等方面內(nèi)容，具有較大的實(shí)用價(jià)值。可為煙草作為植物生物反應(yīng)器的規(guī)?；a(chǎn)提供大量正常普通栽培種材料載體， 同時(shí)為煙草分子生物學(xué)研究尤其是數(shù)量性狀的遺傳機(jī)理剖析提供大批高質(zhì)量的雙單倍體 (doubled haploid,DH)株系作為基礎(chǔ)試驗(yàn)材料，也可以為煙草細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、突變體研究以及生理學(xué)等生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究提供良好的研究對(duì)象。


圖1為已知普通栽培種烤煙流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)圖；圖2為單倍體流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)圖；圖3為雙單倍體流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)圖；圖4為單倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測(cè)示意圖；圖5為雙單倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測(cè)示意圖；圖6為多倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測(cè)示意圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、烤煙花粉的離體液體培養(yǎng)，具體步驟依次如下(1)、花蕾采取于晴天取典型煙草植株主花序上無病蟲、生長(zhǎng)良好的、處于單核靠邊期的花蕾，其外觀表現(xiàn)為花萼與花冠大致等長(zhǎng)，蕾長(zhǎng)在2. 1-2. 21cm之間，取好的花蕾迅速用冰盒4-7°C保存；O)、花藥消毒在超凈工作臺(tái)內(nèi)用鑷子小心將步驟1中花蕾的花藥剝?nèi)〕?，然后用無菌市售絲襪包裹花藥浸入濃度為70%的酒精中消毒15s，快速取出立即浸入濃度為 10%的飽和次氯酸鈣(Ca(ClO)2)溶液中消毒8min，不時(shí)輕輕晃動(dòng)燒杯以使其消毒充分，最后用無菌水沖洗2次，每次5min ；(3)、花粉獲取取步驟2中消毒好的花藥放入圓底大試管中，加入aiil的B5-13液體培養(yǎng)(B5基本培養(yǎng)基中蔗糖濃度為13% )，再加入纖維素酶的質(zhì)量濃度為0. 6%、果膠酶的質(zhì)量濃度為0. 2%和蝸牛酶的質(zhì)量濃度為0. 5%的混合酶液用于軟化花藥壁，之后用玻璃棒輕輕碾成勻漿，倒入裝有300目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，用IOml的離心管收集濾液， 加B5-13液體培養(yǎng)至所需刻度，離心6min，轉(zhuǎn)速lOOOr/min，棄上清液，加B5-13液體培養(yǎng)重新懸浮，離心6min，轉(zhuǎn)速500r/min ；(4)、花粉加倍與培養(yǎng)將步驟3中離心后的上清液去掉，加入含有濃度為55mg/L 秋水仙素的NLN-16液體培養(yǎng)基重新懸浮后，分裝到直徑為7. 5cm的培養(yǎng)皿中，密度約為3 蕾/ml-4蕾/ml，每皿^il，32°C靜置避光培養(yǎng)56h，然后將加倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到IOml離心管，離心6min，轉(zhuǎn)速lOOOr/min，去上清液，加入NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝入直徑為7. 5cm 培養(yǎng)皿，每皿約anl，25°C靜置暗培養(yǎng)18d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見胚時(shí)，置于25°C恒溫?fù)u床上，振蕩暗培養(yǎng)8d，轉(zhuǎn)速為65r/min，達(dá)到子葉期的胚可轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行電腦自動(dòng)控制的繼代培養(yǎng)，溫度為25°C，每日光照他。(6)、染色體倍性檢測(cè)可以取出步驟e中獲得的煙株上的上層葉片，葉片面積大小為2cmX2cm左右，放入細(xì)胞裂解液后，立即用鋒利的刀片切碎，然后將該混合液置于流式細(xì)胞儀(PARTEC，德國(guó))中檢測(cè)染色體倍性，上樣后流式細(xì)胞儀自動(dòng)生成代表該樣品染色體倍性的DNA含量分布圖(如圖2、3)。以已知普通栽培種烤煙(圖1)作為對(duì)照來調(diào)整流式細(xì)胞儀，使代表對(duì)照樣品DNA含量的波峰位于100道附近。然后測(cè)定待測(cè)樣本的波峰，出現(xiàn)在50道和100道附近的峰值分別代表單倍體合單雙倍體，從而確定各再生植株的染色體倍性。(7)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗2-3d，可移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中，移栽前務(wù)必徹底清洗煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基，然后待開花可套袋結(jié)實(shí)。由步驟(6)檢測(cè)出來試驗(yàn)結(jié)果表明，在隨機(jī)檢測(cè)的57個(gè)樣品中，有44個(gè)為雙單倍體，占77. 2%，因此，用本發(fā)明方法對(duì)烤煙花粉進(jìn)行離體液體培養(yǎng)加倍效率可達(dá)75%以上。實(shí)施例2、白肋煙花粉的離體液體培養(yǎng)(1)、花蕾采取于晴天取典型煙草植株側(cè)花序上無病蟲、生長(zhǎng)良好的、處于單核靠邊期花蕾，其外觀表現(xiàn)為花萼與花冠大致等長(zhǎng)，蕾長(zhǎng)在2. 0-2. ^cm之間，取好的花蕾迅速用冰盒4_7°C保存；O)、花藥消毒在超凈工作臺(tái)內(nèi)用鑷子小心剝?nèi)〔襟E1中花蕾的花藥，然后用無菌紗布包裹花藥浸入濃度為75%的酒精中消毒10s，快速取出立即浸入濃度為10%的飽和次氯酸鈣(Ca(ClO)2)溶液中消毒lOmin，不時(shí)輕輕晃動(dòng)燒杯以使其消毒充分，最后用無菌水沖洗3次，每次5min ；(3)、花粉獲取取步驟2中消毒好的花藥放入圓底大試管中，加入3ml的B5-13液體培養(yǎng)(B5基本培養(yǎng)基中蔗糖濃度為13% )，再加入纖維素酶的質(zhì)量濃度為0. 6%、果膠酶的質(zhì)量濃度為0. 2%和蝸牛酶的質(zhì)量濃度為0. 5%的混合酶液用于軟化花藥壁，之后用玻璃棒輕輕碾成勻漿，倒入裝有400目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，用IOml的離心管收集濾液， 加B5-13液體培養(yǎng)至所需刻度，離心5min，轉(zhuǎn)速1100r/min,棄上清液，加B5-13液體培養(yǎng)重新懸浮，離心5min，轉(zhuǎn)速600r/min ；(4)、花粉加倍與培養(yǎng)將步驟3中離心后的去上清液，加入含有濃度為65mg/L秋水仙素的NLN-16液體培養(yǎng)基重新懸浮后，分裝到IOOml的玻璃三角瓶中，密度約為3蕾/ ml-4蕾/ml，每瓶10ml，32°C靜置避光培養(yǎng)69h，然后將加倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到IOml離心管，離心5min，轉(zhuǎn)速llOOr/min，去掉上清液，加入NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝入直徑為7. 5cm 培養(yǎng)皿，每皿約anl，25°C靜置避光培養(yǎng)20d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見胚時(shí)，置于25°C恒溫?fù)u床上，振蕩暗培養(yǎng)10d，轉(zhuǎn)速為55r/min，達(dá)到子葉期的胚可轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，溫度為 25°C，每日光照10h，電腦自動(dòng)控制。(6)、染色體倍性檢測(cè)取步驟e中六片真葉以上的煙株葉片，用手小心地撕下葉片的下表皮并置于載玻片上，滴一滴1 %碘-碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的顯微鏡下，每切片隨機(jī)選取5個(gè)氣孔觀察計(jì)數(shù)(如圖4、5、6)，以每個(gè)氣孔葉綠體平均個(gè)數(shù)在14個(gè)以下的為單倍體(如圖4)，14-24個(gè)的為雙單倍體(如圖5)， M個(gè)以上的為多倍體(如圖6)。(7)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗2-3d，可移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中，移栽前務(wù)必徹底清洗煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基。由步驟6檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果表明，在隨機(jī)檢測(cè)的89個(gè)樣品中，有67個(gè)雙單倍體，占 75.3%，因此，用本發(fā)明方法對(duì)白肋煙花粉進(jìn)行離體液體培養(yǎng)加倍效率可達(dá)70%以上。NLN四個(gè)母液配方如下1.大量元素(20倍)，單位g/L
權(quán)利要求
1.一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于依次按以下操作步驟進(jìn)行(1)、花蕾采取保存于晴天在煙草植株主花序或側(cè)花序上采取無病蟲、生長(zhǎng)良好的適齡花蕾一株或多株，將取好的花蕾迅速用冰盒保存；(2)、花藥消毒將步驟1中保存在冰盒內(nèi)的花蕾在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)』ɡ僦械幕ㄋ帲缓髮內(nèi)〉幕ㄋ幱脽o菌紗布或無菌市售絲襪包裹浸入70-75%濃度的酒精中消毒 10-1 ，快速取出立即浸入飽和Ca(a0)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒過程中輕輕晃動(dòng)燒杯使其消毒充分，最后用無菌水沖洗多次；(3)、花粉獲取取出經(jīng)步驟2消毒好的花藥放入圓底試管中，加入l-3ml的B5-13液體培養(yǎng)，再加入l_2ml用于軟化花藥壁的酶液，輕輕碾成勻漿，倒入裝有300-400目雙層尼龍膜的漏斗中過濾，并用離心管收集濾液，向裝有濾液的離心管中加入B5-13液體培養(yǎng)至設(shè)定刻度，離心處理后去上清液，再加入B5-13液體培養(yǎng)重新懸浮，二次離心后再去上清液；(4)、花粉加倍與培養(yǎng)向步驟3中兩次離心后得到的花粉中加入含有濃度為50-70mg/ L秋水仙素的NLN-16液體培養(yǎng)基，使其重新懸浮后分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中，密封好后靜置于溫度為30-33°C的避光環(huán)境下培養(yǎng)48-7池，對(duì)花粉進(jìn)行加倍處理；然后將加倍處理后的花粉轉(zhuǎn)移到離心管，離心處理后去上清液，加入NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝入培養(yǎng)皿中，再次靜置于低溫環(huán)境下暗培養(yǎng)14-21d ；(5)、幼胚培養(yǎng)待步驟4中裝入加倍花粉的培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見胚時(shí)，便將其置于 23-26°C恒溫?fù)u床上，振蕩暗培養(yǎng)7-10d，并對(duì)其進(jìn)行定時(shí)觀察，將達(dá)到子葉期的胚轉(zhuǎn)入MS 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其溫度為25-27°C，每日光照8-lOh ；(6)、煙苗移栽待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗2_3d，然后將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，便移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直接栽種于大田中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法方法，其特征在于 所述方法還包括染色體倍性的檢測(cè)步驟，其具體操作如下從步驟5中獲得的煙株上采取小面積的無菌苗葉片放置在無菌試驗(yàn)臺(tái)或是玻璃器皿中，向葉片滴加細(xì)胞裂解液，之后，立即將其切碎，然后將切碎的葉片置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)染色體倍性；或者從步驟5中獲得六片真葉以上的煙株上上采取葉片，取葉片的下表皮并置于載玻片上，滴入一滴碘-碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的顯微鏡下觀察其染色體倍性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法方法，其特征在于 步驟1中所述的適齡花蕾為花粉發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期、花萼與花冠等長(zhǎng)的花蕾，其蕾長(zhǎng)范圍在2. 0-2. 3cm之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟 2中飽和Ca(Cno)2溶液濃度為10%，其消毒時(shí)間為8-lOmin ；無菌水沖洗2_3次，每次為 3-5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于煙草花粉的高效誘變方法，其特征在于步驟3中所述酶液為纖維素酶、果膠酶、蝸牛酶和水的混合液，酶液中纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶的質(zhì)量濃度分別為0. 6%、0. 2%和0. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟3中第一次離心和步驟4中的離心時(shí)間為5-6min，轉(zhuǎn)速為lOOO-llOOr/min，步驟3中第二次離心時(shí)間為5-6min，轉(zhuǎn)速500_600r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟4選用直徑為7. 5cm的培養(yǎng)皿或IOOml的玻璃三角瓶，分裝到培養(yǎng)皿或玻璃三角瓶中的花粉混合液其密度為3蕾/ml-4蕾/ml，每皿2ml或每瓶10ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟4中的第一次避光培養(yǎng)的溫度為32°C，第二次避光培養(yǎng)的溫度為25°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法，其特征在于步驟5中恒溫?fù)u床的振蕩轉(zhuǎn)速為55-65r/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效的煙草花粉離體液體培養(yǎng)的方法。該方法的操作步驟主要是在無菌條件下對(duì)經(jīng)過消毒處理后的花藥在B5-13液體培養(yǎng)的作用下通過碾壓快速釋放大量花粉，低速離心收集花粉，先在含有50-70mg/L濃度的秋水仙素的NLN-16液體培養(yǎng)基中32℃靜置避光進(jìn)行加倍處理，再在NLN-13液體培養(yǎng)基中25℃進(jìn)行靜置誘胚避光培養(yǎng)，待肉眼可見胚后置于25℃恒溫?fù)u床上振蕩暗培養(yǎng)7-10d，達(dá)到子葉期的胚即可轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，移栽季節(jié)幼苗經(jīng)煉苗后即可移栽入大田開花套袋結(jié)實(shí)。該方法具有構(gòu)思新穎、設(shè)計(jì)巧妙，科學(xué)實(shí)用、高效穩(wěn)定、產(chǎn)量大、能大大縮短煙草育種周期等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102283125SQ20111020035
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者張俊杰, 曹景林, 林國(guó)平, 王毅, 祖秉橋, 蔡長(zhǎng)春 申請(qǐng)人:湖北省煙草科研所