專利名稱：荻的組織培養(yǎng)基及組培方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以荻種子為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及組培方法。
背景技術(shù)：
荻(Miscanthus saccharif lorus (Maxim.) Benth)是禾本科芒屬草本水陸兩生植物。在自然環(huán)境下，荻具粗壯被鱗片的根莖，稈直立，無毛，具多節(jié)，節(jié)上具須毛，高100 400cm。分布全國各地，多生長于山谷、山坡及灘地上。荻喜光、耐寒、耐澇，抗逆性強(qiáng)，地上部分的生物量大。在環(huán)境保護(hù)、景觀營造、生物質(zhì)能源、制漿造紙、防沙固提中有巨大的潛力， 還可代替木材和塑料作制造人造板的原料等。因此，荻是開發(fā)價值很高的重要能源植物和材料植物。芒屬植物的組織培養(yǎng)從二十世紀(jì)90年代開始陸續(xù)有報道，但多集中在芒和五節(jié)芒愈傷組織及植株再生等方面的研究。經(jīng)檢索，至今未發(fā)現(xiàn)通過荻組織培養(yǎng)，建立不定芽快繁體系，并繁殖生根，培育成完整植株的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
組培快繁技術(shù)已在很多植物上作為經(jīng)濟(jì)、高效的繁殖方法應(yīng)用，周期短、繁殖系數(shù)高、成本低，并不受時間和空間的制約?，F(xiàn)有繁殖技術(shù)中，荻作為商業(yè)項目開發(fā)時人工繁育的成本高，而且其有效種子量少，難以大面積人工種植。為滿足荻人工快速繁育、大面積豐產(chǎn)栽培的需要，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是以荻的種子為外植體，建立一種荻的不定芽誘導(dǎo)、增殖和誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基及組培快繁方法。本發(fā)明的技術(shù)問題通過如下技術(shù)方案解決荻的組織培養(yǎng)基，包括不同誘導(dǎo)時期的四種培養(yǎng)基，各種培養(yǎng)基的原料及其附加量分別是(1)初代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L， 培養(yǎng)基的PH值為5.7;(2)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA0. 5 2. Omg/L、NAA 0. 05 0. lmg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；(3)不定芽增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA0. 3 1. 5mg/L、NAA 0. 1 0. 2mg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；(4)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20 30g/L，瓊脂6. 5 8. Og/L、NAA 0. 2 1. Omg/L,培養(yǎng)基的 pH 值為 5. 7 ；用上述培養(yǎng)基進(jìn)行荻的組織培養(yǎng)方法，按如下步驟進(jìn)行(1)外植體采集與消毒選取健壯的荻種子，依次進(jìn)行洗滌劑清洗Imin、自來水沖洗2h、超凈工作臺上用75%乙醇滅菌30s、無菌水沖洗3 4次、濃度為0. 525%的NaClO 真空滅菌20min、無菌水沖洗5 6次后和用滅菌濾紙吸干種子表面水分；(2)初代培養(yǎng)將經(jīng)步驟(1)無菌條件下獲得的種子接入初代培養(yǎng)基中，其中前7天置于暗柜中培養(yǎng)，后7天置于光暗周期為光16h/暗他的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 士 2°C，獲得幼苗；(3)不定芽誘導(dǎo)將初代培養(yǎng)后發(fā)育健壯的幼苗切去胚根根，接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過15d誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得不定芽，每日光暗周期為光16h/暗他，光照強(qiáng)度為40 50 μ mo 1 πι 培養(yǎng)溫度為 25士2°C ；(4)不定芽增殖培養(yǎng)將獲得的不定芽接入不定芽增殖培養(yǎng)基中，經(jīng)過28天增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為10 20，觀天繼代1次，共繼代3次；光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗 8h，光照強(qiáng)度為40 50μπιΟ1 HT2s-1,培養(yǎng)溫度為25士2°C，培養(yǎng)出不定芽；(5)生根誘導(dǎo)選取健壯不定芽接入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)21天，生根率達(dá)99% ；光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度為40 50 μ mol πΓ、—1，培養(yǎng)溫度為25 士 1 °C，培養(yǎng)出幼苗，組培的全過程結(jié)束。本發(fā)明的有益效果是應(yīng)用荻種子為外植體，用萌發(fā)后的幼苗進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)并進(jìn)行生根培養(yǎng)，有效地提高荻的繁殖系數(shù)，為荻商業(yè)化生產(chǎn)提供充足的種苗源。與播種繁殖相比，組織培養(yǎng)法能有效利用種子，提高萌發(fā)率，縮短育苗周期，無菌條件下種子只需2周即可萌發(fā)，在一個為期6 個月的生長周期內(nèi)組織培養(yǎng)法的繁殖系數(shù)為播種繁殖的100 150倍。
具體實施例方式本發(fā)明下面結(jié)合實施例作進(jìn)一步詳述本荻不定芽誘導(dǎo)和不定芽增殖的培養(yǎng)基中，選用MS作基本培養(yǎng)基，這是經(jīng)過用MS、1/2MS、B5、N6四種基本培養(yǎng)基各自均附加蔗糖 20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L、6_BA即6-氨基腺嘌呤0 2. Omg/L, KT即激動素0 2. Omg/L、NAA即α -萘乙酸0 0. lmg/L, pH值5. 7，進(jìn)行試驗，每組重復(fù)3次，每種基本培養(yǎng)基有20個外植體的對比試驗得出的。因用MS作基本培養(yǎng)基中處理28天后，不定芽發(fā)育最好，誘導(dǎo)的不定芽數(shù)最多，質(zhì)量最好，決定選用MS作基本培養(yǎng)基?？傊景l(fā)明所公開的培養(yǎng)基其配比值、溫度、凝固劑等也可用諸如白砂糖、水晶洋菜等替代，培養(yǎng)基各原料的配比值也可分別采用本發(fā)明最佳方案定值的接近值取代。下面給出的是本發(fā)明的實施例。荻的組織培養(yǎng)基，包括不同誘導(dǎo)時期的四種培養(yǎng)基?，F(xiàn)將四種培養(yǎng)基的原料及其附加量分別按七項實施例列于表1-4 初代培養(yǎng)基(表1):
基本培養(yǎng)基附加原料 (g/L)實施 例1234567MS蔗糖20-3020253020302525瓊脂 6.5-8.56.57.58.57.57.56.58.5不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表2)基本培養(yǎng)基附加原料 (g/L 或 mg/L)實施 例1234567MS6-BA0.5-20.51.220.51.21.22NAA0.05-0.10.050.070.10.070.10.050.07瓊脂 6.5-8.56.57.58.56.57.57.58.5蔗糖20-3020253025302025不定芽增殖培養(yǎng)基(表3)
基本培附加原料實施例養(yǎng)基(g/L 或 mg/L)12345676-BA 0.3-1.50.30.91.50.30.90.91.5MSNAA 0.1-0.20.10.150.20.150.20.10.15蔗糖20-3020253020202530瓊脂 6.5-8.56.57.58.57.57.56.57.5誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基(表4)
基本培養(yǎng)基附加原料 (g/L 或 mg/L)實施 例1234S67蔗糖20-3020253020252530瓊脂6.5-86.57.287.286.57.2NAA0.2-10.20.610.20.60.61實施例1 (對照表1-4中相應(yīng)實施例的原料及附加量)(1)初代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20g/L、瓊脂6. 5g/L，培養(yǎng)基的pH 值為5. 7 ；(2)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基附加6-BAO. 5mg/L、NAA 0. 05mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂6. 5g/L，培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；(3)不定芽增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基附加6-BA 0. 3mg/L, NAA 0. lmg/L、蔗糖 20g/L、瓊脂6. 5g/L，培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；(4)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20g/L，瓊脂6. 5g/L、NAA 0. 2mg/L,培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；用上述的培養(yǎng)基進(jìn)行荻的組織培養(yǎng)方法按如下步驟進(jìn)行(1)外植體采集與消毒選取健壯的荻種子，依次進(jìn)行洗滌劑清洗Imin、自來水沖洗2h、超凈工作臺上用75%乙醇滅菌30s、無菌水沖洗3 4次、濃度為0. 525%的NaClO 真空滅菌20min、無菌水沖洗5 6次后和用滅菌濾紙吸干種子表面水分；(2)初代培養(yǎng)將經(jīng)步驟(1)無菌條件下獲得的荻種子接入初代培養(yǎng)基中，其中前7天置于暗柜中培養(yǎng)，后7天置于光暗周期為光16h/暗他的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25士2°C，獲得幼苗；(3)不定芽誘導(dǎo)將初代培養(yǎng)后發(fā)育健壯的幼苗切去胚根根，接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過15d誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得不定芽，每日光暗周期為光16h/暗他，光照強(qiáng)度為40 50 μ mo 1 πι 培養(yǎng)溫度為 25士2°C ；(4)不定芽增殖培養(yǎng)將獲得的不定芽接入不定芽增殖培養(yǎng)基中，經(jīng)過28天增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為10 20，28天繼代1次，共繼代3次，光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗 8h，光照強(qiáng)度為40 50μπιΟ1 HT2s-1,培養(yǎng)溫度為25士2°C，培養(yǎng)出不定芽；(5)生根誘導(dǎo)選取健壯不定芽接入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)21天，生根率達(dá)99%，光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度為40 50 μ mol πΓ、—1，培養(yǎng)溫度為25士 1°C，培養(yǎng)出幼苗，組培的全部過程結(jié)束。上述培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)基及其它相關(guān)化學(xué)品可市售獲得，按商品說明書配用， 為同行所公知。其余實施2-7，均對照表1-4中對應(yīng)實施例原料及附加量，與實施例1相同方法獲得組織培養(yǎng)基和組培幼苗。七項實施例中，以實施例1-3優(yōu)選。
權(quán)利要求
1.一種荻的組織培養(yǎng)基，其特征是包括不同誘導(dǎo)時期的四種培養(yǎng)基，各種培養(yǎng)基的原料及其附加量分別是(1)初代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20 30g/L、瓊脂6.5 8. 5g/L，培養(yǎng)基的PH值為5.7 ；(2)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA0.5 2. Omg/L、NAA 0. 05 0. lmg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；(3)不定芽增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA0.3 1. 5mg/L、NAA 0. 1 0. 2mg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；(4)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20 30g/L，瓊脂6.5 8. Og/L、 NAA 0. 2 1. Omg/L,培養(yǎng)基的pH值為5. 7 ；
2.一種用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基進(jìn)行荻的組織培養(yǎng)方法，其特征是經(jīng)過以下步驟(1)外植體采集與消毒選取健壯的荻種子，依次進(jìn)行洗滌劑清洗Imin、自來水沖洗池、超凈工作臺上用75%乙醇滅菌30s、無菌水沖洗3 4次、濃度為0. 525%的NaClO真空滅菌20min，無菌水沖洗5 6次后和用滅菌濾紙吸干種子表面水分；(2)初代培養(yǎng)將經(jīng)步驟(1)無菌條件下獲得的荻種子接入初代培養(yǎng)基中，其中前7天置于暗柜中培養(yǎng)，后7天置于光暗周期為光16h/暗他的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25士2°C， 獲得幼苗；(3)不定芽誘導(dǎo)將初代培養(yǎng)后發(fā)育健壯的幼苗切去胚根根，接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過15d誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得不定芽，每日光暗周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度為40 50 μ mo 1 m、—1，培養(yǎng)溫度為 25士2°C ；(4)不定芽增殖培養(yǎng)將獲得的不定芽接入不定芽增殖培養(yǎng)基中，經(jīng)過觀天增殖培養(yǎng)， 增殖系數(shù)為10 20，28天繼代1次，共繼代3次；光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度為40 50μπιΟ1 HT2s-1,培養(yǎng)溫度為25士2°C，培養(yǎng)出不定芽；(5)生根誘導(dǎo)選取健壯不定芽接入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)21天，生根率達(dá)99%;光照培養(yǎng)，光暗周期為光16h/暗他，光照強(qiáng)度為40 50 μ mol πΓ、—1，培養(yǎng)溫度為 25士 1°C，培養(yǎng)出幼苗，組培的全過程結(jié)束。
全文摘要
一種荻的不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基，包括不同培養(yǎng)時期的四種培養(yǎng)基(1)初代培養(yǎng)基，(2)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，(3)不定芽增殖培養(yǎng)基，(4)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，這四種培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖、瓊脂等物質(zhì)，pH5.7。用上述四種培養(yǎng)基進(jìn)行荻不定芽誘導(dǎo)、增殖及生根的組培方法經(jīng)過如下五個步驟一是外植體的采集與消毒，二是初代培養(yǎng)，三是不定芽誘導(dǎo)，四是不定芽增殖培養(yǎng)，五是生根誘導(dǎo)。經(jīng)過上述五步驟的培育為快速而優(yōu)質(zhì)地培養(yǎng)出荻幼苗打好堅實的基礎(chǔ)。應(yīng)用本培養(yǎng)基組培，再生植株能保持母本優(yōu)良性狀，提高幼苗繁殖速度，擴(kuò)大繁殖數(shù)量，并能有效利用種子、縮短育苗周期，滿足社會需求。
文檔編號A01H4/00GK102239808SQ20111020738
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者張啟香, 洪春桃, 胡恒康, 鄭炳松, 郭海鵬 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)