專利名稱：利用地衣芽孢桿菌降解羽毛制備菌肽復(fù)合蛋白飼料添加劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬廢棄物資源化利用領(lǐng)域，特別是涉及具有降解羽毛活性的地衣芽孢桿菌菌株及其降解羽毛制備含益生菌蛋白飼料的方法。
背景技術(shù)：
羽毛是鳥類和禽類表皮細(xì)胞角質(zhì)化的衍生物，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%。動(dòng)物的大量消費(fèi)產(chǎn)生許多羽毛廢棄物，傳統(tǒng)處理方法主要為填埋、焚燒，造成了羽毛蛋白資源的浪費(fèi)。羽毛中蛋白主要是角蛋白，因含大量二硫鍵，交聯(lián)成復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的穩(wěn)定性和難溶性，一般方法很難將其水解。目前理論的降解途徑有物理降解法、化學(xué)降解法、酶降解法和微生物降解法。盡管物理、化學(xué)方法研究較早，但存在破壞氨基酸結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物單一以及產(chǎn)物穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。用化學(xué)法酸水解更會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。用酶法處理是今后發(fā)展的方向，但是目前羽毛降解用酶因?yàn)樯a(chǎn)成本過高，尚未工業(yè)化應(yīng)用。利用微生物對(duì)廢棄羽毛進(jìn)行降解，已經(jīng)有很多研究，如李金婷，路福平，李玉，王建玲，高效降解羽毛角蛋白菌株的篩選與鑒定，天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)；又如專利可以降解羽毛的蘇云金芽孢桿菌NJY1，專利編號(hào)200810155958. 2。這些研究均是利用微生物降解羽毛，并研究發(fā)酵工藝，但是上述技術(shù)中所分離到的菌株不是已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的益生菌，沒有工業(yè)化生產(chǎn)并將降解產(chǎn)物和菌株一起用在飼料添加劑中。益生菌被動(dòng)物服用后，可調(diào)整菌群失調(diào)達(dá)到防病的目的，可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌。能產(chǎn)生抗活性物質(zhì)，并具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長繁殖。但目前益生菌的應(yīng)用還沒有涉及對(duì)廢棄羽毛的降解與利用。利用地衣芽孢桿菌降解羽毛，不僅能使羽毛降解為多肽和氨基酸。同時(shí)地衣芽孢桿菌也能以廢棄羽毛作為營養(yǎng)成分得到大量增殖，所得發(fā)酵產(chǎn)物是一種含益生菌蛋白飼料添加劑。一般益生菌生產(chǎn)方法是將發(fā)酵液噴成粉末。本方法同樣是將發(fā)酵液加入淀粉添加劑后噴成粉末，產(chǎn)品中含有高菌體密度的地衣芽孢桿菌芽孢且含有可溶性蛋白寡肽，芽孢桿菌以芽孢形式存在，抗逆性強(qiáng)，保存時(shí)間長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出利用益生菌地衣芽孢桿菌具有降解羽毛活性并能以羽毛為唯一的碳源氮源進(jìn)行生長的特點(diǎn)，提供了一種降解羽毛制備菌肽復(fù)合蛋白飼料的方法。本發(fā)明采用的菌株是Bacillus licheniformis BSK4，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心已經(jīng)有保藏，保藏號(hào)為CCTCCM208251 (由武漢科諾生物科技股份有限公司保藏和生產(chǎn))。該菌株是從市售的益生菌中篩選出來，具有能高效降解羽毛并能以羽毛為唯一的碳源氮源進(jìn)行生長的特點(diǎn)。該菌株在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下可以高效的降解羽毛角蛋白，產(chǎn)生可溶性蛋白并完成自身菌體的快速增長。培養(yǎng)條件粗放，不易染雜菌，能較快的降解羽毛，菌酶均無毒。
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本發(fā)明的工藝步驟為羽毛處理、種子液制備、底物配制、底物發(fā)酵、過濾、噴霧干燥等過程。具體工藝步驟如下
1、收集羽毛，去除雜質(zhì)，浸泡水洗壓干2-3次，并將羽毛風(fēng)干；再將羽毛放入0. 02、. 05%的NaOH水溶液中，煮沸15min ；濾去NaOH溶液，用自來水浸泡水洗壓干2_3次，并將羽毛烘干保存?zhèn)溆茫?br> 2、將茄形瓶中保藏的CCTCCM208251菌種在固體LB平板上劃線，使其活化；從上述LB平板中挑選單菌落接種于12 15瓶250mL錐形瓶中，瓶內(nèi)含IOOmL液體LB培養(yǎng)基，放入搖床，在37°C、220rpm的條件下培養(yǎng)IOh ；分別從各瓶發(fā)酵液中取樣并送鏡檢，選取無污染，生長旺盛的發(fā)酵液作為種子液；
3、按5 10%的比例將上述一級(jí)種子發(fā)酵液接種至40L發(fā)酵罐中，罐內(nèi)含25L液體LB培養(yǎng)基，進(jìn)行二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵7-8h，取樣送鏡檢，將無污染的發(fā)酵液保留在發(fā)酵罐中備用，鏡檢結(jié)果見(圖4)發(fā)酵初期鏡檢結(jié)果；
4、在400L的發(fā)酵罐中配制250L的發(fā)酵底物，并用108_110°C滅菌，發(fā)酵底物成分為(w/v%) 0. 3%硝酸鉀，0. 1%磷酸氫二鉀，0. 06%磷酸二氫鉀，0. 04% (w/v)六水氯化鎂，0.5% NaClJ%羽毛，0. 山梨醇，其余為水；另加(v/v%) 0.5%豆油，0.5%聚醚用于消泡；將上述種子液接種至400L發(fā)酵罐內(nèi)，按5 10 %的接種量接種進(jìn)行分批發(fā)酵，發(fā)酵條件為37°C, pH值自然，罐壓為0.05 Mpa，通入空氣，通氣量與發(fā)酵罐體積比為1:1. 3-1. 5，轉(zhuǎn)速330—380rpm ；
5、在發(fā)酵過程中，每隔0.5h記錄一次數(shù)據(jù)，記錄內(nèi)容為生產(chǎn)時(shí)間，罐溫，罐壓，pH值，泡沫情況，循環(huán)水溫，罐內(nèi)空氣溫度；每隔他取發(fā)酵液50mL于塑料離心管內(nèi)并依次編號(hào)，4°C保存?zhèn)溆?。待發(fā)酵結(jié)束后將所有樣品送檢，觀察發(fā)酵液狀態(tài)(圖5)，檢測(cè)其菌體含量及可溶性蛋白或小肽的含量；
6、發(fā)酵70-120h放罐，放罐指標(biāo)為結(jié)合搖瓶數(shù)據(jù)，沒有明顯的羽毛固形物存在，取樣送檢，將樣品作鏡檢并測(cè)量其稀釋150倍后在600nm波長下的OD值，所接菌種全部形成芽孢，形態(tài)見圖(4)發(fā)酵末期鏡檢結(jié)果；當(dāng)取樣檢測(cè)OD值為0. 20(Γ0. 400時(shí)，發(fā)酵結(jié)束；
7、將上述發(fā)酵液用單層紗網(wǎng)過濾兩次，去除固形物；按10%的比例加入可溶性淀粉，攪拌均勻；用高溫離心式噴霧干燥塔將發(fā)酵液噴成粉末，進(jìn)口溫度為190°C，出口溫度為80 0C ；
8、將粉末收集裝袋，檢驗(yàn)出廠，本產(chǎn)品為菌肽復(fù)合蛋白飼料，含有高菌體密度的以芽孢形式存在的地衣芽孢桿菌且含有可溶性蛋白寡肽。第2步所述的固體LB平板為蛋白胨lg，酵母膏0.5g，NaCl lg，蒸餾水100ml，瓊脂 1. 5g。第2步、第3步所述的液體LB培養(yǎng)基為蛋白胨lg，酵母膏0.5g，NaCl lg，蒸餾水100ml, pH 7· 0。本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。工藝簡(jiǎn)單，利廢環(huán)保，節(jié)約資源，菌肽復(fù)合含量高，符合飼料安全。羽毛降解率可達(dá)80%。本發(fā)明涉及的幾種測(cè)量方法。-UOOmL發(fā)酵液搖瓶發(fā)酵中羽毛降解率測(cè)定方法1、用電子天平稱量濾紙質(zhì)量ml。
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2、將搖瓶培養(yǎng)的羽毛發(fā)酵液稀釋2飛倍，用玻璃棒引流至裝了之前稱量的濾紙的漏斗中。在此過程中不斷往漏斗中加水稀釋，并用玻璃棒攪拌，確保菌體和殘余羽毛能夠完全分離。3、待全部發(fā)酵液過濾完后，將濾紙連同濾渣一同放入60°C烘箱內(nèi)烘干至質(zhì)量不再減少，稱得總質(zhì)量m2。4、培養(yǎng)基中添加羽毛的總含量為m3。羽毛降解率測(cè)定結(jié)果(例如ml=0. 022，m2=l. 62，m3=2)降解率 P= (m2-ml) /m3*100%= (1. 62-0. 022) /2*100%=80%
二、IOOmL發(fā)酵液搖瓶發(fā)酵中地衣芽孢桿菌菌體增長量測(cè)定方法因?yàn)榕囵B(yǎng)基中有羽毛固形物干擾，因此采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌體增長量1、分別取ImL接種后的培養(yǎng)基和發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，編號(hào)A，B。2、各取A，B混合液用無菌水進(jìn)行10倍的梯度稀釋，10倍梯度稀釋至10_5~_7。將每一份樣品取IOOuL涂布兩塊LB平板，將平板放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。3、次日統(tǒng)計(jì)每塊平板的菌體數(shù)，取菌體數(shù)在3(Γ200個(gè)之間的平板為有效樣品，求平均菌體數(shù)。利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌體生長結(jié)果，見圖(2)初始菌體數(shù)4. 7 X 101° 發(fā)酵末菌體數(shù)1. 55 X IO12
三、IOOmL發(fā)酵液搖瓶發(fā)酵中羽毛培養(yǎng)基發(fā)酵液上清可溶性蛋白含量測(cè)定用Bradford法測(cè)量發(fā)酵液上清可溶性蛋白或小肽的含量
1、用蒸餾水配制0. 5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。取發(fā)酵初末兩個(gè)狀態(tài)的發(fā)酵液lmL，離心取上清，編號(hào)a，b。2、在96空板中A行依次分別加入0，1，2，4，8，12，16，20 μ L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用蒸餾水補(bǔ)齊至20uL，在B，C行重復(fù)兩次，共三組。3、在96空板中0行依次分別加入2，4，8，16，2(^1^ a，b樣品，用蒸餾水補(bǔ)齊至
20uL，在E，F(xiàn)行重復(fù)兩次，共三組。4、在上述每個(gè)孔補(bǔ)加200 μ L G250工作液，30 ？ C反應(yīng)2 min。5、將96空板放入酶標(biāo)儀在595nm波長下讀數(shù)。利用A B C三行的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出a，b兩個(gè)樣品的可溶性蛋白及小肽含量，測(cè)定結(jié)果見圖(3)。


圖1為實(shí)施例3發(fā)酵初始結(jié)果對(duì)比。圖2為實(shí)施例4菌體生長變化狀態(tài)。圖3為實(shí)施例4可溶性蛋白變化狀態(tài)。圖4為實(shí)施例2菌體形態(tài)變化。圖5為實(shí)施例5取樣發(fā)酵液形態(tài)顏色變化。具體實(shí)施方法實(shí)施例1 羽毛的前處理
原始的羽毛從菜場(chǎng)采購回來后，首先要將其鋪展開，將鴨皮，內(nèi)臟等雜質(zhì)剔除；之后用
5自來水沖洗浸泡20min，把水壓干，再浸泡lOmin，把水壓干，并將其風(fēng)干；配制0. 02 %的NaOH溶液，加熱至沸騰，將羽毛放入其中(每升該NaOH溶液約可處理200g干羽毛)，15min后將羽毛取出，濾去NaOH溶液擠壓羽毛至沒有溶液滲出，用自來水泡2min，再次擠壓羽毛至沒有溶液滲出。直至羽毛PH為中性。將羽毛放入60°C烘干至質(zhì)量不再增加。實(shí)施例2 種子液的制備
將茄形瓶中保藏的CCTCCM208251菌種在固體LB平板上劃線，使其活化。從上述LB平板中挑選單菌落接種于12瓶250mL錐形瓶中，瓶內(nèi)含IOOmL液體LB培養(yǎng)基，放入搖床，在37°C，220rpm的條件下培養(yǎng)10h。分別從各瓶發(fā)酵液中取樣并送鏡檢，12瓶發(fā)酵液均無污染且生長旺盛。按10 %的比例將上述一級(jí)種子發(fā)酵液接種至40L發(fā)酵罐中，罐內(nèi)含25L液體LB培養(yǎng)基，進(jìn)行二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)。發(fā)酵幾，取樣送鏡檢，鏡檢結(jié)果無污染。將無污染的發(fā)酵液保留在發(fā)酵罐中備用。鏡檢結(jié)果見(圖4)。實(shí)施例3 按發(fā)酵底物體積5%接種IOOmL羽毛發(fā)酵底物的搖瓶發(fā)酵
羽毛生物發(fā)酵降解在250mL的錐形瓶中進(jìn)行，每個(gè)錐形瓶的裝液量為100mL。將地衣芽孢桿菌按5%接種于12rC，30min滅菌的發(fā)酵底物中，發(fā)酵底物成分為(W/V%)0. 3%硝酸鉀，0. 1%磷酸氫二鉀，0. 06%磷酸二氫鉀，0. 04%六水氯化鎂，0. 5% NaCl, 0. 1 %山梨醇，2%羽毛。將其在37°C，200rpm條件下進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每1 對(duì)發(fā)酵液觀察一次，至發(fā)酵液中的羽毛不再減少即可停止發(fā)酵，沉渣中含有大量益生菌地衣芽孢桿菌。取樣送檢其菌體含量，及羽毛降解率。菌體含量變化見圖(2)，羽毛降解率為79%。第一天羽毛狀態(tài)無明顯變化，發(fā)酵液顏色變深，變渾濁，第三天羽毛明顯解體，培養(yǎng)基有不均一狀態(tài)趨向于均一狀態(tài)。第五天固體羽毛數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)基處有少量羽毛桔梗，其它為均一狀態(tài)，培養(yǎng)液明顯變稠，錐形瓶壁上附有地衣芽孢桿菌，發(fā)酵初始和結(jié)束發(fā)酵液狀態(tài)見圖(1)。實(shí)施例4 按發(fā)酵底物體積10%接種IOOmL羽毛發(fā)酵底物的搖瓶發(fā)酵
羽毛生物發(fā)酵降解在250mL的錐形瓶中進(jìn)行，羽毛發(fā)酵底物與實(shí)施例3相同。每個(gè)錐形瓶的裝液量為100mL。以10%的接種量接入實(shí)施例2的種子液，并在37°C，200rpm的條件下進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每1 對(duì)發(fā)酵液觀察一次，至發(fā)酵液中的羽毛不再減少即可停止發(fā)酵。發(fā)酵液沉渣中含有大量益生菌地衣芽孢桿菌。取樣送檢，檢測(cè)其上清液的可溶蛋白質(zhì)或小肽含量及羽毛降解率。上清液可溶蛋白或小肽含量變化見圖(3)，羽毛降解率為82%。第一天羽毛狀態(tài)無明顯變化，發(fā)酵液顏色變深，變渾濁，第二天羽毛明顯解體，培養(yǎng)基有不均一狀態(tài)趨向于均一狀態(tài)。第三天固體羽毛數(shù)量明顯下降培養(yǎng)基處少量羽毛桔梗其它為均一狀態(tài)，培養(yǎng)液明顯變稠，錐形瓶壁上附有地衣芽孢桿菌。實(shí)施例5 按發(fā)酵底物體積10%接種400L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵
羽毛生物發(fā)酵降解在400L發(fā)酵罐中進(jìn)行，裝液量為250L，發(fā)酵底物成分為(w/ν%)0·3%硝酸鉀，0. 1%磷酸氫二鉀，0.06%磷酸二氫鉀，0.04% (w/v)六水氯化鎂，0.5%NaCl，洲羽毛，0. 1 %山梨醇，其余為水，另加(v/v%) 0. 5%豆油、0. 5%聚醚用于消泡，并用108 110°C滅菌。利用罐壓將種子壓入400L發(fā)酵罐內(nèi)，按10%的接種量接種進(jìn)行分批發(fā)酵。發(fā)酵條件為:37°C,pH自然，罐壓為0. 05Mpa，通氣比為1 1. 3 1. 5，轉(zhuǎn)速為350rpm。第一天羽毛已經(jīng)明顯降解，發(fā)酵液均一且呈黑色，發(fā)酵液中有較粗大的羽毛梗碎片。第二天，發(fā)酵液顏色略淡，羽毛殘?jiān)兊梅浅＜?xì)。第三天羽毛殘?jiān)^之第二天變
6少，發(fā)酵液變稠。發(fā)酵液中菌體形態(tài)見圖(4)，發(fā)酵過程發(fā)酵液狀態(tài)見圖(5)，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)檢測(cè)稀釋150倍后的OD值為0.觀1，羽毛降解率為80%。 將發(fā)酵液用單層紗網(wǎng)過濾兩次，濾液中按10%的比例加入可溶性淀粉，攪拌均勻；用高溫離心式噴霧干燥塔將含淀粉的發(fā)酵液噴成粉末。即為本發(fā)明的產(chǎn)品菌肽復(fù)合蛋白飼料，含有高菌體密度的以芽孢形式存在的地衣芽孢桿菌且含有可溶性蛋白寡肽。
權(quán)利要求
1. 一種利用地衣芽孢桿菌降解羽毛制備菌肽復(fù)合蛋白飼料添加劑的方法，其特征在于步驟為⑴、收集羽毛，去除雜質(zhì)，浸泡水洗壓干2-3次，將羽毛風(fēng)干；將上述羽毛放入·0. 02、. 05%的NaOH的水溶液中，煮沸15min ’濾去NaOH溶液，用自來水浸泡水洗壓干2_3次，并將羽毛烘干保存?zhèn)溆茫虎?、將茄形瓶中保藏的CCTCCM208251菌種在固體LB平板上劃線，使其活化；從上述LB平板中挑選單菌落接種于12 15瓶250mL錐形瓶中，瓶內(nèi)含IOOmL液體LB培養(yǎng)基，放入搖床，在37°C、220rpm的條件下培養(yǎng)IOh ；分別從各瓶發(fā)酵液中取樣并送鏡檢，選取無污染，生長旺盛的發(fā)酵液作為種子液；(3)、按5 10%的比例將上述一級(jí)種子發(fā)酵液接種至40L發(fā)酵罐中，罐內(nèi)含25L液體LB培養(yǎng)基，進(jìn)行二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵7-8h，取樣送鏡檢，將無污染的發(fā)酵液保留在發(fā)酵罐中備用；(4)、在400L的發(fā)酵罐中配制250L的發(fā)酵底物，并用108_110°C滅菌，發(fā)酵底物成分為(w/v%) 0. 3%硝酸鉀，0. 1%磷酸氫二鉀，0. 06%磷酸二氫鉀，0. 04% (w/v)六水氯化鎂，·0. 5% NaClJ%羽毛，0. 1%山梨醇，其余為水，另加(v/v%) 0. 5%豆油，0. 5%聚醚用于消泡；將上述種子液接種至400L發(fā)酵罐內(nèi)，按5 10 %的接種量接種，進(jìn)行分批發(fā)酵，發(fā)酵條件為·37°C, pH值自然，罐壓為0.05 Mpa，通入空氣，通氣量與發(fā)酵罐體積比為1:1. 3-1. 5，轉(zhuǎn)速·330—380rpm ；(5)、在發(fā)酵過程中，每隔0.5h記錄一次數(shù)據(jù)，記錄生產(chǎn)時(shí)間，罐溫，罐壓，pH值，泡沫情況，循環(huán)水溫，罐內(nèi)空氣溫度；每隔他取發(fā)酵液50mL于塑料離心管內(nèi)并依次編號(hào)，4°C保存?zhèn)溆?，待發(fā)酵結(jié)束后將所有樣品送檢，檢測(cè)其菌體含量及可溶性蛋白或小肽的含量；05)、發(fā)酵70-120h放罐，放罐指標(biāo)為結(jié)合搖瓶數(shù)據(jù)，沒有明顯的羽毛固形物存在，取樣送檢，將樣品作鏡檢并測(cè)量其稀釋150倍后在600nm波長下的OD值，所接菌種全部形成芽孢，當(dāng)取樣檢測(cè)OD值為0. 20(Γ0. 400時(shí)，發(fā)酵結(jié)束；(7)、將上述發(fā)酵液用單層紗網(wǎng)過濾兩次，去除固形物；按10%的比例加入可溶性淀粉，攪拌均勻；用高溫離心式噴霧干燥塔將發(fā)酵液噴成粉末，進(jìn)口溫度為190°C，出口溫度為·80 0C ；(8)、將粉末收集裝袋，檢驗(yàn)出廠。
全文摘要
本發(fā)明利用益生菌地衣芽孢桿菌CCTCCM208251具有降解羽毛活性并能以羽毛為唯一的碳源氮源進(jìn)行生長的特點(diǎn)，提供了一種降解羽毛制備菌肽復(fù)合蛋白飼料的方法。工藝步驟為羽毛處理、種子液制備、底物配制、底物發(fā)酵、過濾、噴霧干燥等過程。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，利廢環(huán)保，節(jié)約資源，菌肽復(fù)合含量高，符合飼料安全。羽毛降解率可達(dá)80％。本發(fā)明不僅有效的處理了廢料羽毛并且獲得大量的可溶性蛋白小肽和益生菌，所得菌肽復(fù)合蛋白用于飼料添加，有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A23K1/10GK102389022SQ20111023164
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者張桂敏, 龔一軒 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)