專利名稱：以嫩莖為外植體的滇楊組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
滇楊iPopulus yunnanensis)是楊柳科楊屬青楊派樹(shù)種，尚有的少量滇楊原始野生植株僅存于部分海拔較高的山區(qū)，現(xiàn)存滇楊林分主要以人工林為主，且基本由雄株組成， 雌株極為少見(jiàn)。滇楊作為林木遺傳育種中的模式植物，其組織培養(yǎng)包括基本培養(yǎng)基及外源激素選擇，外植體選擇、消毒、分化、增殖與生根培養(yǎng)及煉苗移栽等步驟。楊樹(shù)外植體的選擇上，與莖尖分生組織接連的腋芽、葉片、莖尖具有較強(qiáng)的形態(tài)發(fā)生能力，通常從優(yōu)樹(shù)上選取相應(yīng)組織部分復(fù)幼后再取外植體。金順玉等在“黑林1號(hào)楊(小黑楊X波蘭15A)的組織培養(yǎng)與植株再生”(植物生理學(xué)通訊[J]，2003, 39(6) :639)中，利用葉片作為外植體，用75% 乙醇消毒Imin附加Naao消毒^iin獲得了無(wú)菌苗。“3個(gè)楊樹(shù)品種葉片再生體系的建立” (沈周高，等.[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22 (11):90-92.)，對(duì)3種黑楊雜種葉片不同時(shí)長(zhǎng)的消毒處理結(jié)果中，0. l%HgCl2溶液消毒^iin處理，葉片污染率為20%，出愈率為76%。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，外植體重新開(kāi)始細(xì)胞分裂與器官分化，形成完整植株。不同楊樹(shù)的生長(zhǎng)環(huán)境與生物學(xué)習(xí)性不同，導(dǎo)致適合其誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基不同。例如，京2楊生長(zhǎng)需要較高的營(yíng)養(yǎng)，MS培養(yǎng)基更適于腋芽的啟動(dòng)和生長(zhǎng)。(張蕾， 蘇曉華等.京2楊組培條件的優(yōu)化及再生體系建立[J].林業(yè)科學(xué)研究，2007，20 (6) 787-793)。歐美楊“山地一號(hào)”叢生芽的增殖以MH為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.3-0. 8mg/L濃度 6-BA與0. 05mg/L濃度的NAA混配(楊傳平等，“歐美楊‘山地1號(hào)’組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立”[J].分子植物育種，2006，4 ): 579-582.)。楊樹(shù)的生根培養(yǎng)大都采用1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加一定量的NAA、IAA、IBA。史紹林等誘導(dǎo)新西伯利亞銀白楊的根，采用1/2MS+0. 1 mg/LNAA +0.02 mg/LIBA作為根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，生根率達(dá)90%，根數(shù)多，生長(zhǎng)健壯。(“新西伯利亞銀白楊組織培養(yǎng)基配方的篩選與應(yīng)用” [J].防護(hù)林科技，2008，(6):25-26.)在楊樹(shù)組培苗煉苗移栽過(guò)程中，韓玉琴等在“山新楊微繁工廠化配套生產(chǎn)技術(shù)”中選擇黑土和草炭土附加少量草木灰、細(xì)沙、馬糞為移栽基質(zhì)(黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2005，(2) :59-60.)?？当仍跉W美速生楊煉苗移栽中，選用干凈河沙為基質(zhì)，保持溫度^°C，相對(duì)濕度為85%，30d 后成活率達(dá)到90%以上(“速生歐美黑楊愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生” [J].植物生理學(xué)通訊， 2004，40(5): 582·)。
此外，光照作為楊樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中重要的影響因子，不同強(qiáng)度和波長(zhǎng)的光照將直接影響再生體系的建立。與滇楊組織培養(yǎng)相關(guān)的文獻(xiàn)中，有張春霞等以初春時(shí)采摘二年生滇楊枝條在室溫下水培長(zhǎng)出新葉，取水培新葉的葉柄消毒得到的無(wú)菌材料作為外植體，利用1/2MS 基本培養(yǎng)基附加苯基噻二唑基脲(TDZ)、NAA等組成的三種培養(yǎng)基對(duì)葉柄誘導(dǎo)分化、增殖以及生根等進(jìn)行離體再生的研究(“滇楊的組織培養(yǎng)和植株再生”，植物生理學(xué)通訊 [J]，2006，42(6) 1131)。但該方法作為實(shí)驗(yàn)室研究，而在工業(yè)化條件下葉柄取材量大，基礎(chǔ)
3培養(yǎng)基和外源激素要求較高，尤其是對(duì)葉柄進(jìn)行的離體組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)較為單一，未對(duì)不同生長(zhǎng)因子或激素的可能組合的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是用滇楊離體嫩莖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，建立以嫩莖為外植體的滇楊組織培養(yǎng)方法，為滇楊離體的工廠化快速繁殖和育苗、以及滇楊生理遺傳性質(zhì)研究提供方法。本發(fā)明目的通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)
以嫩莖為外植體的滇楊組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟
(1)取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的3年生滇楊枝條，摘除枝條上葉片，置于室溫下水培一個(gè)月，待其長(zhǎng)出嫩莖后剪下作為外植體；
(2)將步驟(1)嫩莖置入燒杯中，加入m次氯酸鈉，振蕩6min，無(wú)菌水沖洗3遍，再加 70%酒精消毒40s，之后加0. l%HgCl2消毒7 min，最后用無(wú)菌水沖洗5遍；
(3)用MS+6BA0.5mg/L+NAA0. 05mg/L作為滇楊嫩莖不定芽誘導(dǎo)的分化培養(yǎng)基，將步驟 (2)消毒后的無(wú)菌嫩莖平放入該培養(yǎng)基，20 25天生長(zhǎng)出愈傷組織，約30天在愈傷上長(zhǎng)出叢生不定芽；
(4)用MS+6BA0.lmg/L+NAAO. 02mg/L作為滇楊增殖培養(yǎng)基，將步驟(3)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的不定芽接入該培養(yǎng)基，25天左右培養(yǎng)一代；
(5)用lAMS+NAAO.02mg/L作為滇楊生根培養(yǎng)基，將步驟(4)增殖培養(yǎng)后的壯苗插入該培養(yǎng)基，培養(yǎng)生根苗，15天左右生根；
(6)將步驟(5)的生根瓶苗在組織培養(yǎng)室培養(yǎng)25天，轉(zhuǎn)到普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)閉瓶培養(yǎng)3天、 開(kāi)瓶培養(yǎng)2天進(jìn)行煉苗前預(yù)處理，然后移栽到基質(zhì)中煉苗；
以上步驟(2) (5)消毒接種工作均在超凈工作臺(tái)中操作，試管苗的培養(yǎng)均在組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，其培養(yǎng)條件為溫度25士2°C、光照1500-2000LX、光照時(shí)間12h/d、濕度70% 80%。所述方法的步驟(6)移栽煉苗基質(zhì)的配方為河沙腐質(zhì)土 珍珠巖=1:1:1。所述方法的步驟(6)煉苗基質(zhì)以0. 3 %的高錳酸鉀溶液淋溶消毒，蓋上小棚膜，7 天后移栽煉苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的突出的進(jìn)步和積極效果是
1、本發(fā)明采集滇楊3年生枝條摘除老葉，水培復(fù)幼，取材方便快捷，且不受季節(jié)的限
制；
2、以滇楊新生嫩莖為外植體，通過(guò)12種不同細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比的增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，生成愈傷組織后在愈傷上分化出叢生芽，篩選出嫩莖芽分化率較高的6BA和NAA 培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)發(fā)芽率高，更適合滇楊離體快繁及獲取同一規(guī)格的組培苗；
3、本發(fā)明選用4種不同激素配比的生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)主根和須均多且健壯的生根組培苗，獲得了適合滇楊離體快繁生根的培養(yǎng)基，為后期移栽煉苗的高成活率提供保障；
并且，6-BA及NAA試劑均較為廉價(jià)；
4、本發(fā)明選用7種不同基質(zhì)配比的移栽煉苗基質(zhì)進(jìn)行生根組培苗移栽煉苗，并進(jìn)行死亡率、30天成活率、苗高及苗的地徑生長(zhǎng)情況分析，篩選出適合滇楊生根組培苗移栽煉苗的培養(yǎng)基質(zhì)配方，首次篩選了滇楊組培苗的煉苗基質(zhì)。因此，本發(fā)明建立的滇楊離體培養(yǎng)再生體系，對(duì)滇楊離體快速繁殖和遺傳改良有重要的意義。


圖1是不同煉苗預(yù)處理對(duì)組培苗成活率的影響圖。圖2是不同基質(zhì)中移栽死亡情況隨時(shí)間的變化3是不同基質(zhì)對(duì)組培苗高生長(zhǎng)的影響圖。圖4是不同基質(zhì)對(duì)組培苗地徑的影響圖。
具體實(shí)施例方式(一)外植體的消毒
取西南林業(yè)大學(xué)校園生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的三年生滇楊枝條，將枝條上的葉片全部摘除后，置于室溫下水培一個(gè)月，待其長(zhǎng)出嫩莖后剪下作為外植體材料。將嫩莖在燒杯中用自來(lái)水沖洗池后，放入三角瓶中，加入洲的次氯酸鈉，振蕩Smin后，取出嫩莖材料，用無(wú)菌水沖洗葉柄3遍；再用70%乙醇消毒嫩莖40sec，之后分別放入4個(gè)無(wú)菌瓶中，I :+ 的次氯酸鈉 IOmin ； II :+10%H202IOmin ；III :+0. l%HgCl27min ；IV :+0. l%HgCl27min+2% 的次氯酸鈉 8min。用無(wú)菌水沖洗葉柄6遍。選用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基接種。MS配方如表1
表1 MS培養(yǎng)基成分配方表
成分蔽里(mg/t )成分?jǐn)?shù)簠(mg/L)ι t n —- ^fc 大里兀索微素HHJMQI1650MnSOi ■ 4Hs022. 3勵(lì)1900ZnSOi ■ mo8.6IHaPQi17。腳，6.2HgSO, ■ TByD370KI0.83CaCli ■ 2HD440Na ■ IoO, ■ 2tW0. 25有機(jī)物CuSOa ■ SHsO0.025肌握100CoCia ■ eao0.025煙酸0. B維生素B10.1甘觀2.0FeSOi ■ THsO37. 3維生素&0.1Ia ■ EDTA ■ 2ftO27.8
十五天后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。設(shè)計(jì)和效果見(jiàn)表2
表2不同消毒劑對(duì)滇楊嫩莖的消毒效果
權(quán)利要求
1.以嫩莖為外植體的滇楊組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的3年生滇楊枝條，摘除枝條上葉片，置于室溫下水培一個(gè)月，待其長(zhǎng)出嫩莖后剪下作為外植體；(2)將步驟(1)嫩莖置入燒杯中，加入m次氯酸鈉，振蕩6min，無(wú)菌水沖洗3遍，再加 70%酒精消毒40s，之后加0. l%HgCl2消毒7 min，最后用無(wú)菌水沖洗5遍；(3)用MS+6BA0.5mg/L+NAA0. 05mg/L作為滇楊嫩莖不定芽誘導(dǎo)的分化培養(yǎng)基，將步驟 (2)消毒后的無(wú)菌嫩莖平放入該培養(yǎng)基，20 25天生長(zhǎng)出愈傷組織，約30天在愈傷上長(zhǎng)出叢生不定芽；(4)用MS+6BA0.lmg/L+NAAO. 02mg/L作為滇楊增殖培養(yǎng)基，將步驟(3)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的不定芽接入該培養(yǎng)基，25天左右培養(yǎng)一代；(5)用lAMS+NAAO.02mg/L作為滇楊生根培養(yǎng)基，將步驟(4)增殖培養(yǎng)后的壯苗插入該培養(yǎng)基，培養(yǎng)生根苗，15天左右生根；(6)將步驟(5)的生根瓶苗在組織培養(yǎng)室培養(yǎng)25天，轉(zhuǎn)到普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)閉瓶培養(yǎng)3天、 開(kāi)瓶培養(yǎng)2天進(jìn)行煉苗前預(yù)處理，然后移栽到基質(zhì)中煉苗；以上步驟(2) (5)消毒接種工作均在超凈工作臺(tái)中操作，試管苗的培養(yǎng)均在組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，其培養(yǎng)條件為溫度25士2°C、光照1500-2000LX、光照時(shí)間12h/d、濕度70% 80%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(6)用于煉苗的基質(zhì)的配方為河沙腐質(zhì)土 珍珠巖=1:1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是步驟(6)用于煉苗的基質(zhì)以0.3%的高錳酸鉀溶液淋溶消毒，蓋上小棚膜，7天后移栽煉苗。
全文摘要
以嫩莖為外植體的滇楊組織培養(yǎng)方法，屬于植物組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明采集滇楊3年生枝條水培后以嫩莖為外植體，無(wú)菌嫩莖平放入分化培養(yǎng)基，在愈傷上長(zhǎng)出叢生不定芽，再分別接入增殖、生根培養(yǎng)基，移栽煉苗基質(zhì)等。本發(fā)明取材方便快捷，各階段的培養(yǎng)基和煉苗基質(zhì)都分別進(jìn)行篩選比較，為滇楊工廠化快速繁殖、育苗以及滇楊生理遺傳性質(zhì)研究提供了方法。
文檔編號(hào)A01G31/00GK102246700SQ20111023683
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者何承忠, 劉巖, 周軍, 李根前, 段安安, 胥輝, 辛培堯 申請(qǐng)人:西南林業(yè)大學(xué)