專(zhuān)利名稱(chēng)：一種建立康地6號(hào)油葵再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)，本發(fā)明具體涉及一種建立油葵再生體系的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
向日葵(Helianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一，也是我國(guó)北方地區(qū)的主要油料作物，其作為油料或蛋白質(zhì)資源日益受到人們的重視。組織培養(yǎng)不僅可生產(chǎn)大量的優(yōu)良無(wú)性系，也可打破種屬間的界限，克服遠(yuǎn)緣雜交及不親和性障礙在向日葵新品種的培育和種性的改良中和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用中有著巨大的潛力。盡管向日葵植株再生方法已經(jīng)得到長(zhǎng)足發(fā)展，各種技術(shù)也已有報(bào)道，由于向日葵屬于難培養(yǎng)植物，有許多因素制約著向日葵的植株再生。幼胚培養(yǎng)技術(shù)在向日葵獲得成功的報(bào)道越來(lái)越多。李映紅等(李映紅、郭仲琛、 王伏雄· Immature embryo culture of sunflower [J]. Acta Botanica Yunnanica (云南植物石if 究)，1998，10 (1) :79-86)、Finer (Finer J J. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of hybrid sunflower(Helianthus annuus L.) on a high sucrose containing medium[J]. Plant Cell Rep.，1987，6 372-374)、Freyssin 等(Freyssinet M，F(xiàn)reyssinet G. Fertile plant regeneration from sunflower(Helianthus annuus L) immature embryos[J]. Plant Sci.，1988，56 177-181)、宋英凱等(宋英凱，張?zhí)煨?，崔?guó)惠，等.向日葵未成熟胚培養(yǎng)中不定芽的發(fā)生〔J).華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1993,8( :112-115.〕劉海學(xué)(劉海學(xué)，季靜，王萍，等.向日葵未成熟胚組織培養(yǎng)及再生芽的研究(J).內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，18 (5) 411-414.)都報(bào)道了在向日葵幼胚培養(yǎng)中體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，從未成熟的合子中誘導(dǎo)出愈傷組織再由愈傷組織發(fā)生體細(xì)胞胚胎的間接途徑，但再生器官的發(fā)生率不是很高，一般在 2 · 5% _12%，而且形成的芽不易生長(zhǎng)成植株，并且幼胚的獲得還限制與生長(zhǎng)季節(jié)，如在冬季使用溫室將增加很多管理和種植成本。并且直到現(xiàn)在利用幼胚向日葵植株體細(xì)胞胚胎的再生仍然很困難，即使能再生重復(fù)前人試驗(yàn)也特別難。在向日葵器官培養(yǎng)方面，Baker利用子葉(Baker M C, Munoa-Fernandez N, Carter C D. Improved shoot development and rooting from mature cotyledons of sunflower [J], Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1999,58 :39-49.)建立向日葵再生體系，包括無(wú)菌苗種到1/2MS培養(yǎng)基附加15g/L蔗糖+6g/L瓊脂。取無(wú)菌苗切取子葉節(jié)接到MS培養(yǎng)基附加0. 5mg/L NAA+lmg/L6BA誘導(dǎo)愈傷4周，芽誘導(dǎo)利用MS培養(yǎng)基附加0. 5mg/L NAA+lmg/L6 BA，然后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上分化，MS培養(yǎng)基附加0. 5mg/L BA+0. 01mg/L NAA0 最高能產(chǎn)生平均87%不定芽分化，每個(gè)子葉節(jié)最高產(chǎn)生5. 4個(gè)芽。生根培養(yǎng)基利用1/2MS 并附加少量的NAA和炭粉。Puniam等利用MS培養(yǎng)基附加0. 5mg/L BA+0. 05mg/LNAA組合誘導(dǎo)出向日葵子葉節(jié)，葉片，莖尖，下胚軸等不同外置體愈傷，繼而在MS培養(yǎng)基附加0. 5mg/L BA+0. lmg/L GA3+500mg/L CA分化培養(yǎng)基上得到分化不定芽，分化頻率不同品種在5-80%不等，最后通過(guò)無(wú)激素MS培養(yǎng)基生根得到全苗。上述國(guó)外報(bào)道都利用不同的材料和激素配比，所得的結(jié)果也不盡相同，我們也利用過(guò)自己材料及其上述報(bào)道培養(yǎng)基無(wú)法得到相似的結(jié)果。而且有些向日葵品種生根非常困難。因此國(guó)外的向日葵再生體系由于所用材料不同很難加以有效利用。在向日葵器官培養(yǎng)方面，國(guó)內(nèi)最早衛(wèi)志明報(bào)道利用MS培養(yǎng)基附加2，4_D 0. 5mg/L 和6BA0. 5mg/L進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，愈傷組織轉(zhuǎn)入分化時(shí)，每升附加0. 2mg/L的NAA和lmg/L的 6BA;誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為不加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基，得到最高60%的分化率(衛(wèi)志明，許智宏.向日葵組織培養(yǎng)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊，1983 :42-45.)。馬雪霞等利用6芐基腺嘌呤(6BA)和IAA之比為5 1時(shí)，誘導(dǎo)出最大芽率在為62. 5% (馬雪霞，藍(lán)海燕，宋榮，等.向日葵的組織培養(yǎng)及芽分化的研究〔J).新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，39(1) 23-24.)。劉海學(xué)等(劉海學(xué)，季靜，王萍，等.向日葵未成熟胚組織培養(yǎng)及再生芽的研究 (J).內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，18 (5) :411-414)利用向日葵未成熟胚進(jìn)行誘導(dǎo)，在MS+0. 03mg/L的IAA+1. 2mg/L的6-BA的培養(yǎng)基上最高誘導(dǎo)出芽為73%?？傮w上誘導(dǎo)出芽的頻率與特定基因型有關(guān)，而且受各種因素影響芽不易長(zhǎng)成植株，如早熟、早開(kāi)花、玻璃化現(xiàn)象和褐化現(xiàn)象嚴(yán)重、生根率低等，這些都影響其培養(yǎng)效果。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)在向日葵的組織培養(yǎng)方面做了大量的工作，但還存在一些問(wèn)題，到目前為止建立一個(gè)成熟的再生體系，仍是向日葵組培工作的一個(gè)研究重點(diǎn)。因此在今后的研究中，應(yīng)繼續(xù)探索建立高效的再生體系，縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高再生頻率，以利于向日葵的育種及利用基因工程進(jìn)行向日葵的品種改良。

發(fā)明內(nèi)容
盡管向日葵植株再生方法已經(jīng)得到長(zhǎng)足發(fā)展，但是由于向日葵屬于難培養(yǎng)植物， 有許多因素制約著向日葵的植株再生。本發(fā)明目的在于建立一種康地6號(hào)油葵再生體系的方法，該發(fā)明對(duì)向日葵康地6號(hào)自交系具有高頻再生率，獲得的再生植株時(shí)間較短且再生植株成活率較高等特性。本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)將向日葵康地6號(hào)自交系接種到附加不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，將誘導(dǎo)的向日葵不定芽轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上高頻分化再生苗，再將再生苗轉(zhuǎn)入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上中進(jìn)一步生長(zhǎng)，得到再生植株，對(duì)再生植株嫁接優(yōu)化，再生植株成活率
尚ο具體的，本發(fā)明提供了一種建立康地6號(hào)油葵再生體系的方法，具體步驟如下(1)無(wú)菌油葵幼苗獲得取康地6號(hào)油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡lOmin，用 10%的過(guò)氧化氫溶液消毒30min，再無(wú)菌水沖洗2遍，最后接種于無(wú)激素的1/2MS培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)室溫度為48°C，光照時(shí)間16h，光強(qiáng)2000LX，生長(zhǎng)3天。(2)油葵愈傷組織的誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗于靠近生長(zhǎng)點(diǎn)l-2mm處切取子葉，將子葉切口處插入培養(yǎng)基中5mm深度，誘導(dǎo)2-3周，誘導(dǎo)出的大量的愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS 培養(yǎng)基 +IAA1. 2mg/L+6-BA 4. 5mg/L ；(3)不定芽分化進(jìn)程將外植體愈傷，其3_4mm厚，顏色為淡黃色，連同子葉和愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化，愈傷面接觸培養(yǎng)基；2-3周內(nèi)在接觸培養(yǎng)基的愈傷表面，會(huì)分化出許多小的不定芽；當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)到Icm時(shí)，及時(shí)從愈傷塊上切下來(lái)，轉(zhuǎn)至葡萄糖減半的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；分化培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基、IAA 0. 01mg/L、6-BA 0. 04mg/L ；(4)不定芽生長(zhǎng)當(dāng)不定芽進(jìn)一步伸長(zhǎng)到3cm時(shí)，再轉(zhuǎn)至無(wú)激素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再生苗可很快生長(zhǎng)成苗；生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為2/5MS培養(yǎng)基；(5)再生植株的嫁接選用生長(zhǎng)發(fā)育良好的具有1片真葉的實(shí)生苗做砧木，4片真葉的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韌性良好的塑料帶綁縛結(jié)合部位；嫁接后，用塑料薄膜罩好保濕，放于通風(fēng)并有散射光的地方，七天后揭罩通風(fēng)解除綁繩進(jìn)行常規(guī)管理。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下技術(shù)效果1.本發(fā)明中取康地6號(hào)油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡，再用10%的過(guò)氧化氫溶液消毒30min，獲得無(wú)菌苗基本無(wú)污染，生活力強(qiáng)。2.建立康地1號(hào)油葵再生體系的方法，不定芽誘導(dǎo)率在90-98%之間，每個(gè)子葉誘導(dǎo)不定芽個(gè)數(shù)5-10個(gè)不等。并且三個(gè)多月內(nèi)就能得到長(zhǎng)勢(shì)較好的再生苗，操作簡(jiǎn)便快捷。3.本發(fā)明中省去生根步驟，獲得再生苗直接嫁接成活，其成活率極高，節(jié)約時(shí)間， 并且可以收獲到后代種子，嫁接苗成活率可達(dá)90%，長(zhǎng)勢(shì)良好。


圖1所示為康地6號(hào)油葵3-4日齡無(wú)菌苗幼胚接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基圖。圖2所示為向日葵子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周多的愈傷圖。圖3所示為誘導(dǎo)的向日葵愈傷接到分化培養(yǎng)基上分化1周多時(shí)間的不定芽圖。圖4所示為向日葵不定芽進(jìn)一步伸長(zhǎng)到3cm時(shí)生長(zhǎng)圖。圖5所示為向日葵再生苗嫁接圖。
具體實(shí)施例方式下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有主要原輔材料康地6號(hào)油葵種子是由新疆康地種業(yè)公司提供。主要試劑70%的酒精(分析純)，10%的過(guò)氧化氫，MS培養(yǎng)基、IAA、6_BA ；NAA ；滅菌水主要儀器SW-CJ = 18V型醫(yī)用超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備安裝公司；AEL-200電子天平，日本SHIMADZU公司；LRH-150-G型光照培養(yǎng)箱，上海儀器廠(chǎng)；醫(yī)用高壓蒸汽滅菌鍋， 上海醫(yī)用核子儀器廠(chǎng)。實(shí)施例一(1)無(wú)菌油葵幼苗獲得取康地6號(hào)油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡lOmin，無(wú)菌水沖洗2遍，用10%的過(guò)氧化氫溶液消毒30min，再無(wú)菌水沖洗2遍，胚端朝上接種于無(wú)激素的V2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為48°C，光照時(shí)間16h，光強(qiáng)2000LX，生長(zhǎng)3天。 參見(jiàn)附圖1(2)油葵愈傷組織的誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗于靠近生長(zhǎng)點(diǎn)l_2mm處切取子葉，將子葉切口處插入培養(yǎng)基中大約5mm深度，誘導(dǎo)2-3周，誘導(dǎo)出的大量的愈傷組織，90% 外置體可以獲得愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+IAA1. 2mg/L+6-BA 4. 5mg/L ；參見(jiàn)附圖2(3)不定芽分化進(jìn)程將外植體愈傷，其大小約3_4mm厚，顏色為淡黃色，連同子葉和愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化，愈傷面接觸培養(yǎng)基。2-3周內(nèi)在接觸培養(yǎng)基的愈傷表面，會(huì)分化出許多小的不定芽(5-10個(gè))。當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)到Icm時(shí)，及時(shí)從愈傷塊上切下來(lái)， 轉(zhuǎn)至葡萄糖減半的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；高達(dá)90%愈傷可以分化不定芽。分化培養(yǎng)基配方為 MS 培養(yǎng)基、IAA 0. 01mg/L、6-BA0. 04mg/L ；參見(jiàn)附圖 3(4)不定芽生長(zhǎng)當(dāng)不定芽進(jìn)一步伸長(zhǎng)到3cm時(shí)，參見(jiàn)附圖5，再轉(zhuǎn)至無(wú)激素的 2/5MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再生苗可很快生長(zhǎng)成苗；生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為2/5MS培養(yǎng)基；參見(jiàn)附圖4(5)再生植株的嫁接選用生長(zhǎng)發(fā)育良好的具有1片真葉的實(shí)生苗做砧木，4片真葉的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韌性良好的塑料帶綁縛結(jié)合部位；嫁接后，用塑料薄膜罩好保濕，放于通風(fēng)并有散射光的地方，七天后揭罩通風(fēng)解除綁繩進(jìn)行常規(guī)管理，80%以上嫁接苗可以成活。參見(jiàn)附圖5實(shí)施例二 詳細(xì)的再生體系建立過(guò)程如下無(wú)菌油葵幼苗獲得取康地6號(hào)油葵種子，用70% 的酒精溶液浸泡lOmin，無(wú)菌水沖洗2遍，用0. 1 %的升汞溶液消毒5min，最后用無(wú)菌水沖洗 2遍，胚端朝上接種于無(wú)激素的V2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為48°C，光照時(shí)間16h， 光強(qiáng)2000LX，生長(zhǎng)3天左右，長(zhǎng)出的無(wú)菌苗比較弱小，部分種子不能萌發(fā)。油葵愈傷組織的誘導(dǎo)選取萌發(fā)的無(wú)菌苗于靠近生長(zhǎng)點(diǎn)l_2mm處切取子葉，將子葉切口處插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中大約5mm深度，誘導(dǎo)2-3周，誘導(dǎo)出愈傷組織；可能由于升汞對(duì)材料的殺傷，愈傷組織量較少，誘導(dǎo)率大約為45%。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+IAA1. 2mg/L+6-BA 4. 5mg/L。不定芽分化進(jìn)程將外植體愈傷，其大小約3-4mm厚，顏色為淡黃色，連同子葉和愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化，愈傷面接觸培養(yǎng)基。2-3周內(nèi)在接觸培養(yǎng)基的愈傷表面，會(huì)分化出許多小的不定芽。當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)到Icm時(shí)，及時(shí)從愈傷塊上切下來(lái)，轉(zhuǎn)至葡萄糖減半的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；分化苗較弱，分化率大約為72%。分化培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基、IAA 0. Olmg/L、 6-BA 0. 04mg/Lo分化苗生長(zhǎng)當(dāng)不定芽進(jìn)一步伸長(zhǎng)到大約3cm時(shí)，再轉(zhuǎn)至無(wú)激素的2/5MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可很快生長(zhǎng)成苗。再生植株的嫁接選用生長(zhǎng)發(fā)育良好的具有1片真葉的實(shí)生苗做砧木，4片真葉的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韌性良好的塑料帶綁縛結(jié)合部位。嫁接后，用塑料薄膜罩好保濕，放于通風(fēng)并有散射光的地方。一星期后揭罩通風(fēng)解除綁繩進(jìn)行常規(guī)管理。通過(guò)這種方式的嫁接苗成活率大約73%，長(zhǎng)勢(shì)一般。實(shí)施例三本發(fā)明包括無(wú)菌油葵幼苗獲得，油葵愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化和分化苗生根以及嫁接成活。詳細(xì)的再生體系建立過(guò)程如下無(wú)菌油葵幼苗獲得取康地6號(hào)油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡lOmin，無(wú)菌水沖洗2遍，再用10 %的過(guò)氧化氫溶液消毒 30min,最后用無(wú)菌水沖洗2遍，胚端朝上接種于無(wú)激素的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為 260C 48°C，光照時(shí)間16h，光強(qiáng)2000LX，生長(zhǎng)3天左右，無(wú)菌苗長(zhǎng)勢(shì)較健壯。油葵愈傷組織的誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗于靠近生長(zhǎng)點(diǎn)l_2mm處切取子葉，將子葉切口處插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中大約5mm深度，誘導(dǎo)2-3周，誘導(dǎo)出的大量的愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基+不同激素濃度的MS培養(yǎng)基中(見(jiàn)下表)，觀(guān)察不同激素濃度配比下外植體的愈傷發(fā)生情況。
權(quán)利要求
1. 一種建立康地6號(hào)油葵再生體系的方法，其特征在于，所述的具體方法步驟如下(1)無(wú)菌油葵幼苗獲得取康地6號(hào)油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡lOmin，再用 10%的過(guò)氧化氫溶液消毒30min，最后接種于無(wú)激素的1/2MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為 260C 48°C，光照時(shí)間16h，光強(qiáng)2000LX，生長(zhǎng)3天；(2)油葵愈傷組織的誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗于靠近生長(zhǎng)點(diǎn)處切取子葉插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)；誘導(dǎo)2-3周，導(dǎo)出大量的愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方采用MS培養(yǎng)基、IAA1. 2mg/L 和 6-BA 4. 5mg/L ；(3)不定芽分化進(jìn)程將外植體愈傷，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化，2-3周在接觸培養(yǎng)基的愈傷表面，會(huì)分化出許多小的不定芽；分化培養(yǎng)基配方采用MS培養(yǎng)基+IAA 0.01mg/L 和6-BA 0. 04mg/L ；當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)到Icm時(shí)，及時(shí)從愈傷塊上切下來(lái)，轉(zhuǎn)至葡萄糖減半的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(4)不定芽生長(zhǎng)當(dāng)不定芽進(jìn)一步伸長(zhǎng)到3cm時(shí)，再轉(zhuǎn)至無(wú)激素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 再生苗可很快生長(zhǎng)成苗；生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方采用2/5MS培養(yǎng)基；(5)再生植株的嫁接選用生長(zhǎng)發(fā)育良好的具有1片真葉的實(shí)生苗做砧木，4-6片真葉的再生苗基部削尖作接穗，采用劈接法把接穗插入砧木，用韌性良好的塑料帶綁縛結(jié)合部位；嫁接后，用塑料薄膜罩好保濕，放于通風(fēng)并有散射光的地方，一星期后揭罩通風(fēng)解除綁繩進(jìn)行常規(guī)管理。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種向日葵康地6號(hào)再生體系方法。通過(guò)將康地6號(hào)自交系子葉接種到附加不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷，將誘導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上高頻分化不定芽，待不定芽生長(zhǎng)到一定程度再將其轉(zhuǎn)入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上中進(jìn)一步生長(zhǎng)，最后再生植株進(jìn)行嫁接移植；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方采用MS培養(yǎng)基、IAA1.2mg/L和6-BA 4.5mg/L；分化培養(yǎng)基配方采用MS培養(yǎng)基+IAA 0.01mg/L和6-BA 0.04mg/L；生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方采用2/5MS培養(yǎng)基。該發(fā)明對(duì)向日葵康地6號(hào)自交系具有再生頻率極高、操作簡(jiǎn)單、周期較短等特性，具有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102301960SQ20111023688
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者夏春蘭, 李新鵬, 林霞, 王志安, 王沛政 申請(qǐng)人:新疆康地種業(yè)科技股份有限公司