專利名稱：七帶石斑魚精子冷凍保存和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類低溫生物學(xué)及種質(zhì)超低溫冷凍保存技術(shù)領(lǐng)域，是一種在超低溫狀態(tài)(_196°C )下大量冷凍保存魚類精子并在生產(chǎn)中應(yīng)用的技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
七帶石斑魚(EpiMphelus septemfasciatus)是分布在我國黃海和東海海域一種名貴魚類，近年隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提高，被人工馴化為海水工廠化養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。由于具有“冷水石斑”之稱，是北方養(yǎng)殖石斑魚的首選品種。七帶石斑魚和大部分石斑魚一樣都屬于雌雄同體，雌性先熟魚類。七帶石斑魚體重大于6kg時(shí)，才開始性轉(zhuǎn)化為雄魚，親本群體中雌性數(shù)量多而雄性相當(dāng)少，極大的限制了七帶石斑魚的人工繁殖、苗種大量培育和大規(guī)模養(yǎng)殖推廣。近年來有人利用飼喂甲基睪酮或埋植甲基睪酮緩釋膠囊的方式，促使雌性盡早發(fā)生性轉(zhuǎn)化(日本三重縣水產(chǎn)研究所，水産增殖，土橋靖史等，200 ，但是通過人工促使轉(zhuǎn)化的雄魚產(chǎn)精量也相當(dāng)少，每尾魚一次能產(chǎn)0. 5-lml精液，對(duì)于大量成熟的卵子也難于滿足受精的要求。魚類精子冷凍保存技術(shù)作為長期保存魚類種質(zhì)的一種方法，在防止魚類品種滅絕、魚類自然種群的恢復(fù)，具有地理和時(shí)間隔離的魚類種群之間的雜交育種，基于家系建立的選擇育種，雌核發(fā)育誘導(dǎo)及人工繁殖育苗等方面都具有重要的應(yīng)用潛力。在鱸形目魚類精子冷凍保存方面，陳松林等對(duì)花鱸精子進(jìn)行了冷凍保存研究(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，Aquaculture，Chen et al，2004)。區(qū)又君等(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，中國南方漁業(yè)學(xué)術(shù)論壇第二十六次水產(chǎn)學(xué)術(shù)交流論文集，2010)也進(jìn)行了七帶石斑魚精子冷凍保存實(shí)驗(yàn)，但精子冷凍存活率僅為10%以上，都難于達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用水平。蒙子寧等利用Hank’ s溶液做為稀釋液，進(jìn)行了斜帶石斑魚、鞍帶石斑魚、褐點(diǎn)石斑魚精子冷凍保存(中山大學(xué)，蒙子寧等，中華人民共和國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局，CN 101874483 A)，但該技術(shù)方法不包括對(duì)七帶石斑魚精子冷凍保存的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種七帶石斑魚精子大量冷凍保存和應(yīng)用的方法，以解決七帶石斑魚人工繁殖群體中雄性數(shù)量少和產(chǎn)精量少、人工繁殖和苗種培育受到極大限制的問題。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)的一種七帶石斑魚精子冷凍保存方法，包括精子采集和檢測、精子稀釋液配制、冷凍保存液配制、精子與冷凍保存液混合、平衡和冷凍保存；所述的精子采集和檢測，優(yōu)選的七帶石斑魚精子活力在70-80%以上的精液用于冷凍保存；所述的精子稀釋液配制在每升蒸餾水中加入葡萄糖60g、NaCl 10g、NaHCO3 0. 5g，配制而成；所述的冷凍保存液配制，優(yōu)選的在精子稀釋液中加入10%的二甲基亞砜(DMSO)或10%的1，2-丙二醇，配制而成；所述的精子與冷凍保存液混合，優(yōu)選的冷凍保存液與七帶石斑魚精液以1 1的比例混合，將混合精液Iml注入2ml冷凍管中；所述的平衡和冷凍保存，優(yōu)選的在室溫下平衡5min，然后在-60--80°C的液氮蒸氣中平衡lOmin，之后直接將盛放冷凍管的小布袋投入液氮中冷凍保存。一種七帶石斑魚精子冷凍保存方法的應(yīng)用，包括1)解凍和精子活力檢測、冷凍精子在37°C水浴中解凍，鏡檢冷凍精子活力；幻受精冷凍精子受精比例為Iml冷凍精子 200ml未受精卵。本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果1、實(shí)現(xiàn)了七帶石魚精子大量冷凍保存和應(yīng)用，利用該方法可以在繁殖前期或后期將成熟精子冷凍保存起來備用，或者從國內(nèi)其它地方冷凍保存七帶石斑魚的精子，運(yùn)輸?shù)接鐖?。解決了七帶石斑魚人工繁殖中精液量不足的問題。2、精子稀釋液成分簡單，冷凍保存成本低，稀釋液僅有3種成份葡萄糖60g/L、 NaCl 10g/L、NaHC03 0.5g/L。3、冷凍保存量大、精子活力高，冷凍量從現(xiàn)有技術(shù)中的0. 25ml麥管增加到2. Oml 凍存管，冷凍精子平均活力從10%提高到72. 92%。適合于建立精子冷凍庫，在漁業(yè)生產(chǎn)、 遺傳育種和種質(zhì)保存中推廣應(yīng)用。4、冷凍保存方法簡單，易于推廣，可以在現(xiàn)場直接進(jìn)行冷凍保存操作，達(dá)到了實(shí)用化水平，冷凍精子的受精率和孵化率分別達(dá)到68. 08%,76. 83%，而新鮮精子的受精率和孵化率分別為69. 87士6. 05%,64. 33士4. 04%，冷凍精子與鮮精無顯著性差異(P > 0. 05)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明技術(shù)方案所依據(jù)的科學(xué)原理本發(fā)明的科學(xué)依據(jù)是低溫生物學(xué)原理。魚類精子細(xì)胞在篩選出的適宜冷凍保存稀釋液中，在冷凍保存液的作用下，使細(xì)胞中部分水分脫出，細(xì)胞溶質(zhì)濃度提高，使溶質(zhì)冰點(diǎn)降低。同時(shí)利用快速冷凍方法，使精子細(xì)胞越過冰晶形成期，直接進(jìn)入超低溫(_196°C)環(huán)境，促使細(xì)胞代謝停止，從而達(dá)到長期保存的目的。七帶石斑魚精子冷凍保存和應(yīng)用的方法，精子冷凍保存方法包括精子采集和檢測、精子稀釋液配制、冷凍保存液配制、精子與冷凍保存液混合、平衡和冷凍保存。實(shí)施例1 精子冷凍稀釋液配方的篩選1、精子采集和檢測利用萊州明波水產(chǎn)有限公司培育的七帶石斑魚，2011年5月達(dá)到性成熟，雄性魚8 尾，體重34kg。利用60mg/L的MS222(烷基磺酸鹽同位氨基苯甲酸乙酯)麻醉，用紙巾擦干成熟雄魚腹部和生殖孔區(qū)域，輕壓腹部，用吸管收集擠出的精液，注入干燥的冷凍管中， 同時(shí)注意在吸取精液時(shí)不要吸入排出的尿液。利用顯微鏡檢測精子活力，成活率在70-80 % 以上的精液用于冷凍保存。2、精子稀釋液配方的篩選首先利用葡萄糖、NaCl, KCl、NaHCO3溶解在蒸餾水中，配制7種精子冷凍稀釋液， 配方如表 1。分別在ES2、ES2-l、ES2-2、ES2-3、ES2-4、ES2-5、ES2-6 中加入體積比 20%二
4甲基亞砜(DMSO)配制成7種精子冷凍保存液。將采集的七帶石斑魚精子加入7個(gè)冷凍管， 每管0. 5ml，再加入以上冷凍保存液0. 5ml，以1 1比例混合精液，在室溫下平衡5min后， 將精子冷凍管盛入小布袋中，放入液氮罐，在液氮蒸氣中(-60--80°C )平衡lOmin，然后投入液氮(_196°C )，冷凍4-5h。表1精子稀釋液配方
權(quán)利要求
1.一種七帶石斑魚精子冷凍保存方法，包括七帶石斑魚精子采集和檢測、精子稀釋液配制、冷凍保存液配制、精子與冷凍保存液混合、平衡和冷凍保存，其特征在于所述的七帶石斑魚精子采集和檢測精子活力在70-80% ；所述的精子稀釋液配制在每升蒸餾水中加入葡萄糖60g、NaCl 10g、NaHCO3 0. 5g ；所述的冷凍保存液配制在精子稀釋液中加入體積比為10%的二甲基亞砜或10%的 1，2_丙二醇；所述的精子與冷凍保存液混合冷凍保存液與七帶石斑魚精液以1 1的比例稀釋，將稀釋精液Iml注入2ml冷凍管中；所述的平衡和冷凍保存在室溫下平衡5min，然后在-60--80°C的液氮蒸氣中平衡 lOmin，之后直接將盛放冷凍管的小布袋，投入液氮中冷凍保存。
2.—種權(quán)利要求1所述方法冷凍保存的七帶石斑魚精子的應(yīng)用，其特征在于它包括 1)解凍和精子活力檢測冷凍精子在37°C水浴中解凍，鏡檢冷凍精子活力；幻受精冷凍精子受精比例為Iml冷凍精子200ml未受精卵。
全文摘要
一種七帶石魚精子冷凍保存和應(yīng)用方法，包括七帶石斑魚精子采集和檢測、精子稀釋液配制、冷凍保存液配制、精子與冷凍保存液混合、平衡和冷凍保存、解凍和精子活力檢測、受精。本發(fā)明技術(shù)方法冷凍精子活力平均達(dá)72.92％，冷凍精子的受精率和孵化率分別為68.08％、76.83％，與新鮮精子無顯著差異。本發(fā)明利用的稀釋液，配方簡單、成本低，可大量冷凍保存七帶石斑魚精液，從而解決了七帶石斑魚人工繁殖中精液量不足的問題，提高了七帶石斑魚苗種培育效率。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102273439SQ20111026186
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者汪娣, 田永勝, 翟介明, 陳松林, 齊文山 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所