專利名稱：微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因(Ms-Δ6-FAD)及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的基因序列，以及這種基因序列的制備方法和用途，確切講本發(fā)明涉及微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶(MS-A6-FAD)基因及其制備與用途。
背景技術(shù)：
γ-亞麻酸(γ-linolenic acid，GLA)是一種多功能油脂成分。許多研究表明 GLA具有多種重要的生理活性作用，它在機(jī)體的物質(zhì)代謝和生理調(diào)控上發(fā)揮著十分重要的作用降血脂、抗血栓性心腦血管、預(yù)防和治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)人體的免疫功能，GLA還具有抗革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌、抗HIV感染、抗腫瘤、抗多種炎癥、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、 抑制潰瘍和增強(qiáng)胰島素和減肥等方面的作用，參見董杰明等“ Y-亞麻酸的保健作用”《衛(wèi)生研究》2003，32 (3) :299-301。Δ 6-脂肪酸脫氫酶(Δ 6-FAD)基因是介導(dǎo)GLA合成的關(guān)鍵酶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種取自我國(guó)特有物種-微孔草的Δ-6脂肪酸脫氫酶基因，以及這種基因的制備方法及用途，該基因表達(dá)可以使低溫脅迫下的微孔草積累Y-亞麻酸，在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)使其產(chǎn)生了新性狀。微孔草(Microula sikkimensis Hemsl.)系紫草科微孔草屬，為二年生草本植物， 主要分布于陜西西南部、甘肅、青海、四川西部、云南西北部、西藏藏東和南部，參見中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)《中國(guó)植物志》北京科學(xué)出版社，1990151-175。本發(fā)明所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因制備方法是首先提取微孔草的 RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脫氫酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物PI、Ρ2 ；以得到的微孔草cDNA為模板擴(kuò)增得到微孔草△-6脂肪酸脫氫酶基因核心片段核苷酸序列；根據(jù)測(cè)序得到的Ms- Δ 6-FAD基因核心片段序列分別設(shè)計(jì)微孔草△ -6脂肪酸脫氫酶基因特異引物5’端外側(cè)引物P3和巢式引物P4，分別與GeneRacer 試劑盒中自帶的5’P和5’NP配對(duì)，以微孔草cDNA為模板，進(jìn)行5’外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到5’末端核苷酸序列；同樣根據(jù)測(cè)序得到的微孔草△-6脂肪酸脫氫酶基因核心片段序列分別設(shè)計(jì)微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因特異引物3’端外側(cè)引物P5和巢式引物P6，分別與GeneRacer 試劑盒中自帶的3’ P和3’ NP配對(duì)，以微孔草cDNA為模板，進(jìn)行3’外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增，得到3’末端核苷酸序列；根據(jù)已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因5’和3’末端核苷酸序列，設(shè)計(jì)與該基因編碼區(qū)兩端特異的引物P7、P8，擴(kuò)增得到微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)翻譯區(qū)核苷酸序列。在P7、P8引物的5’端分別加入Nco I和Bste II酶切位點(diǎn)序列，便于后期的基因編碼區(qū)與植物表達(dá)載體重組。實(shí)驗(yàn)表明，冷凍脅迫)進(jìn)行的96小時(shí)期間，微孔草葉片中Y-亞麻酸含量明顯上升，低溫可以誘導(dǎo)其積累。構(gòu)建MS-A6-FAD的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染煙草后得到的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生了新性狀野生型煙草葉片和種子中無(wú)Y-亞麻酸，而轉(zhuǎn)基因煙草其含量分別占總脂肪酸的16. 3%和4.8%。據(jù)報(bào)道，不飽和脂肪酸的增加與植物抗生物(病原體、植物病原體互做等)和非生物脅迫(低溫、干旱、鹽、重金屬等)密切相關(guān)，參見Robert G. Upchurch "Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress" Biotechnol Lett (2008) 30 :967_977，因此，微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因有可能在這些過(guò)程中發(fā)揮作用。采用的相關(guān)引物均由大連寶生物合成(寶生物工程有限公司，遼寧省大連市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)東北二街19號(hào)，郵編116600)，序列如下Pl :5，-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3，Ρ2 5，-ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3，Ρ3 :5， -CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3，Ρ4 5' -TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3，5 ’ P 為5 ’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，5， NP 為5， -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，；Ρ5 :5， -TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3，Ρ6 5，-AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3，3 ’ P 為5 ’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，3， NP 為5， -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，Ρ7 :5’ -CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3’Ρ8 :5’ -GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’其中R= A or G ;Y = C or T ;S = C or G。本發(fā)明所涉及的微孔草Δ -6脂肪酸脫氫酶基因(Ms- Δ 6_FAD)的序列為SEQNo 1 或 SEQ No :10ο本發(fā)明所涉及的微孔草Δ -6脂肪酸脫氫酶基因(Ms- Δ 6_FAD)可在油料作物的轉(zhuǎn)基因工作中應(yīng)用，也可在牧草等作物的轉(zhuǎn)基因工作中應(yīng)用，也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的轉(zhuǎn)基因工作中應(yīng)用，可在除植物外的其它生物的轉(zhuǎn)基因工作中應(yīng)用。微孔草富含Y-亞麻酸(表1)，參見高有為，樊鐵“微孔草-一種待開發(fā)的富含 Y-亞麻酸的新油源”?！吨袊?guó)糧油學(xué)報(bào)》1998 13(2) :22-24.表1微孔草和其它植物油的Y -亞麻酸的含量比較
權(quán)利要求
1.微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因，其特征是SEQNo :1。
2.微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因，其特征是SEQNo :10。
3.權(quán)利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因制備方法，其特征是將提取的微孔草RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ -6脂肪酸脫氫酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物Ρ1、Ρ2 ； 以得到的微孔草cDNA為模板擴(kuò)增得到微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因核心片段核苷酸序列；根據(jù)測(cè)序得到的HPT基因核心片段序列分別設(shè)計(jì)微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因特異引物5’端外側(cè)引物Ρ3和巢式引物Ρ4，分別與GeneRacer 試劑盒中自帶的5’ P和5’ NP配對(duì)，以微孔草cDNA為模板，進(jìn)行5’外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到5’末端核苷酸序列；同樣根據(jù)測(cè)序得到的微孔草△-6脂肪酸脫氫酶基因核心片段序列分別設(shè)計(jì)微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因特異引物3’端外側(cè)引物P5和巢式引物P6，分別與GeneRacer 試劑盒中自帶的3’ P和3’ NP配對(duì)，以微孔草cDNA為模板，進(jìn)行3’外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增，得到3’末端核苷酸序列；根據(jù)已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因5’和3’末端核苷酸序列，設(shè)計(jì)與該基因編碼區(qū)兩端特異的引物P7、P8，擴(kuò)增得到微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)翻譯區(qū)核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因制備方法中所用的相關(guān)引物，其特征是上游引物Pl為Pl :5，-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3， 下游引物P2為P2 :5， -ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3， P3 :5’ -CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3’ P4 :5’ -TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3’ 5’ P 為5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’， 5’ NP 為5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ； P5 :5， -TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3， P6 :5’ -AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3， 3’ P 為5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’， 3’ NP 為5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3， P7 5' -CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3‘ P8 :5’ -GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’ 其中R = A+G ；Y = C+T ；S = C+G。
5.權(quán)利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因在油料作物的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因在牧草作物的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2所述的微孔草△-6脂肪酸脫氫酶基因在除權(quán)利要求4或5所述的植物外的植物中的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因在除植物外的其它生物的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶(Ms-Δ6-FAD)基因的序列，以及這種基因序列的制備方法和用途。微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶(Ms-Δ6-FAD)基因的制備是用微孔草基因的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再根據(jù)其它植物的(Ms-Δ6-FAD)基因保守區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)的簡(jiǎn)并引物與巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增得到微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶(Ms-Δ6-FAD)基因的全長(zhǎng)翻譯區(qū)核苷酸序列；本發(fā)明的微孔草Δ-6脂肪酸脫氫酶(Ms-Δ6-FAD)基因在微孔草冷凍脅迫過(guò)程中累積，與其抗凍性相關(guān)；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行的功能驗(yàn)證說(shuō)明該基因表達(dá)可以使煙草葉片和種子中產(chǎn)生γ-亞麻酸。該基因可用應(yīng)用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的轉(zhuǎn)基因工作中。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102424827SQ20111028104
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者傅華, 吳淑娟, 張麗靜 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)