專利名稱：玉米ZmRop1蛋白的新用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域中玉米ZmRopl蛋白的新用途。
背景技術(shù)：
玉米矮花葉病(maize dwarf mosaic disease，MDMD)可由一至多種病毒系統(tǒng)性侵染引起，在全世界范圍內(nèi)造成嚴重的經(jīng)濟損失。國際上已報道的可引起玉米矮花葉病的病毒有6種，它們均屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，它們分別是甘蔗花葉病毒(Sugar cane mosaic virus，SCMV)、玉米矮花葉病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、高粱花葉病毒 (Sorghum mosaic virus, SrMV)、約翰遜草花葉病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) > 玉米屬花葉病毒(Zea mosaic virus,ZeMV)禾口白草花葉病毒(Pennisetum mosaic virus, PenMV)。甘蔗花葉病毒北京分離物(SCMV-BJ)是引起我國北方玉米產(chǎn)區(qū)玉米矮花葉病的優(yōu)勢株系(Fan ZF, Chen HY, Liang ΧΜ, Li HF, 2003. Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China.Archives of Virology 148,773-82)。作為一種細胞內(nèi)專性寄生物的植物病毒，在侵染過程中，其生活史的完成必須依賴寄主因子參與病毒脫殼、基因組復制、病毒顆粒組裝和病毒運動過程。而這種依賴性就需要寄主因子在病毒侵染時改變原有的正常的功能和狀態(tài)。這些復雜的改變一方面體現(xiàn)在植物發(fā)生了一系列生理和組織上的變化，從分子、化學和物理水平上來抵抗病毒的侵染，另一方面表現(xiàn)在病毒通過多種策略適應或改變寄主細胞從而增強侵染復制復合體的形成、抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默，促進細胞間的移動、干擾植物細胞周期等，同時導致寄主植物形成各種癥狀，包括花葉、褪色、矮化、發(fā)育缺陷或死亡等(Whitham SA,Yang C Goodin匪2006. Global impact :elucidating plant responses to viral infection. Molecular Plant-Microbe Interactions 19,1207-15)。在抗性寄主中，病毒的侵染會激發(fā)抗性寄主的免疫反應，病毒的無毒基因 (Avrgene)和寄主的抗病基因(R gene)相互識別可激發(fā)寄主的一些抗病防衛(wèi)反應。在感病寄主中，植物基因表達的變化可能是由兩種原因造成一是病毒侵染過程要求的寄主因子參與；二是由于寄主本身的抗病反應或由于病毒侵染干擾了植物miRNA的功能，進而引起植物典型的表型變化即癥狀的產(chǎn)生(Yang Ζ, Fu Y, 2007. R0P/RAC GIPasesignaling. Current Opinion in Plant Biology 10,490-4)。鑒定SCMV侵染后玉米中差異表達的基因，有助于探索防治玉米矮花葉病的新途徑。近年來，科學家已經(jīng)做了大量工作來鑒定SCMV侵染后玉米中差異表達的基因(Uzarowska A, Dionisio G, Sarholz, B et al. ,2009. Validation of candidate genesputatively associated with resistance to SCMV and MDMV in maize(Zea mays Dbyexpression profiling. BMC Plant Biology 9，15doi :10. 1186/1471-2229-9—15)， 然而，SCMV和玉米之間的分子互作機理尚不清晰。Rop作為植物重要的調(diào)控因子，參與調(diào)控植物多種信號途徑，如調(diào)控花粉管的生長、調(diào)控肌動蛋白細胞骨架和細胞極性生長(Yang Ζ, 2002. Small GTPase versatile signaling switches in plants. Plant Cell Supplement 14，S375—88)、參與植物非生物脅迫(Nibau C, Wu H, Cheung A, 2006. RAC/ROP GTPase 'hubs' for signal integration and diversification in plants. Trends in Plant Science 11 (6),1360-85), Rops 33S 參與一些植物激素如脫落酸(Zheng ZL, Nafisi Μ, Tam A, Li H. et al. ,2002. Plasma membrane-associated ROP IOsmall GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis. Plant Cell 14,2787-97)禾口生長素信號途徑，Rops也參與泛素/26S蛋白體介導的蛋白水解(Tao L, Cheung AY, Nibau C Wu HM, 2005. RAC GTPases in tobacco and Arabidopsis mediate Auxin-induced formation of proteolytically active nuclear protein bodies that containAUX/IAAproteins. Plant Cell 17，2369_83)。在玉米中，共有 9 個 Rop 成員，ZmRopl 9 ;ZmRopl (ZmRacA)， ZmRop2 (ZmRacB), ZmRop3 (ZmRacC)和ZmRop4 (ZmRacD)在哺乳動物細胞中表達能夠誘導過 fHL的/^t (Hassanain HH, Sharma YK, Moldovan L et al. ,2000. Plant Rac proteins induce superoxide production in mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research. Communications 272 :783-8)；而ZmRop2在玉米雄性配子體(花粉粒)中發(fā)揮重要功能(Agrawal GK, Iwahashi H, Rakwal R, 2003. Small GTPase iRop' :molecular switch for plant defense responses. FEBSLetters 546，173-80)，然而在大多數(shù)情況下，ZmRop 成員的參與調(diào)控玉米正常生長發(fā)育和玉米對生物、非生物逆境脅迫響應知之甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供序列表中序列1所示的蛋白在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明提供了序列表中序列1所示的蛋白在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明的另一個目的是提供序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明提供了序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用；所述蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體為在pGFP載體的多克隆位點插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。所述抑制植物病毒復制為抑制植物病毒在植物體或植物組織或植物細胞中的復制；所述植物細胞為植物細胞中的原生質(zhì)體；所述植物病毒為引起玉米矮花葉病的植物病毒；
所述引起玉米矮花葉病的植物病毒為甘蔗花葉病毒。序列表中序列1所示的蛋白在防治植物病毒病害中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在防治植物病毒病害中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在防治植物病毒病害中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體為在pGFP載體的多克隆位點插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。所述植物病毒病害為玉米矮花葉?。凰鲇衩装ㄈ~病是由甘蔗花葉病毒引起的；所述植物為玉米。本發(fā)明通過⑴在玉米原生質(zhì)體中共轉(zhuǎn)化能表達ZmRopl的質(zhì)粒與SCMV RNA,發(fā)現(xiàn)過量表達ZmRop 1，SCMV病毒復制水平降低約392. 6%,即過量表達ZmRopl可有效抑制SCMV 的復制；⑵在玉米葉片中瞬時沉默ZmRopl后接種SCMV，ZmRopl瞬時沉默的植株上，SCMV 建立系統(tǒng)侵染的時間縮短(提前3d)，病毒累積增加(表現(xiàn)在SCMV mRNA水平增加約274 395% )，產(chǎn)生的系統(tǒng)花葉癥狀更為嚴重，瞬時沉默ZmRopl促進了 SCMV在玉米上的系統(tǒng)侵染。這些將在防治玉米病毒病害中發(fā)揮重要作用，同時為玉米的分子育種打下良好的基礎。


圖1為在玉米原生質(zhì)體中過量表達ZmRopl對SCMV復制的影響。圖2為瞬時沉默ZmRopl的玉米植株表型及其ZmRopl的mRNA水平。圖3為瞬時沉默ZmRopl對SCMV系統(tǒng)侵染玉米植株的影響。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、過量表達ZmRopl抑制甘蔗花葉病毒(SCMV)的復制一、構(gòu)建ZmRopl瞬時表達載體按照分子克隆常規(guī)方法，構(gòu)建ZmRopl瞬時表達載體pGFP-Ropl。具體方法如下 從美國自交系cv. Va35(購自中國農(nóng)業(yè)大學國家玉米改良中心)葉片中提取總RNA為模板， 用上下游引物RoplF和RoplR，RoplF 5' -GTCGACATGGCGTCCAGCGCCTCTCGGTTCAT-3‘，(下劃線部分為 Sal I 酶切位點)，RoplR 5' -GAGCTCTCAGGACTTGAAGCATAGCATTTTTCTTCCACCG-3‘，(下劃線部分為Sac I酶切位點)，反轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到ZmRopl蛋白的編碼基因序列，該編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，該序列所編碼的ZmRopl蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。然后利用Ml I和Mc I限制性內(nèi)切酶酶切該編碼基因序列，回收酶切后的基因片段；同時， 用Ml I和Mc I酶切載體pGFP(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得，記載過該載體的非專利文獻是Shi Y, Qin YiCao Y. et al. , 2011. Influence of an m-type thioredoxin in maize on potyviral infection. European Journal of Plant Pathology 131，317—26)，回收載體大片段，將回收的載體大片段與回收的基因片段連接后，獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進行測序驗證，測序結(jié)果表明在PGFP載體的Ml I和Mc I酶切位點間插入了序列表中序列2 所示的ZmRopl基因片段，證明重組載體構(gòu)建正確，將該重組載體命名為pGFP-Ropl。二、甘蔗花葉病毒(SCMV) RNA提取1、SCMV病毒粗提純收集感染SCMV且系統(tǒng)花葉癥狀明顯的玉米葉片200g，剪成小段，在液氮中快速研磨成粉狀。在研磨后的粉狀物中加入400ml提取緩沖液1(0. 5M磷酸鉀緩沖液，使用前加入0. OlM的二乙基二硫代氨鉀酸鈉和β -巰基乙醇，WV, ρΗ7. 2)，攪拌均勻。用雙層尼龍網(wǎng)(孔徑38 μ m)過濾，濾液加20% (WV) CCl4,充分攪拌20 30min。8，500rpm離心 25min。往上清液中加入0. 25M的NaCl (終濃度)，攪拌至完全溶解后，再緩慢加入6% (g/ ml)PEG-6000(Fluka,日本)，冰浴中攪拌至PEG-6000完全溶解，于4°C靜置2h。8，500rpm離心30min，沉淀用含Tween-20 (Roche，Germany)的提取緩沖液II (0. 05M磷酸鉀緩沖液， PH7. 2)于4°C懸浮過夜。7，OOOrpm離心15min，將上清液置于20%的蔗糖墊上(上清液與蔗糖墊的體積比為1 2)，38，000印111離心901^11。每管沉淀用1. Oml提取緩沖液III (0. 005M 磷酸鉀緩沖液，PH7.2)充分懸浮，4°C冰箱中過夜。7，OOOrpm離心IOmin去沉淀，上清液即為粗提純的SCMV，然后以100 μ 1為單位分裝，于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆?。收集感染SCMV且系統(tǒng)花葉癥狀明顯的玉米葉片的方法為將SCMV侵染的玉米汁液通過機械摩擦方式接種到三葉期玉米的第三片葉上，接種后將玉米植株放在人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為23°C光照1 和21°C黑暗他。接種30天后收集系統(tǒng)花葉癥狀明顯的玉米葉片。SCMV侵染的玉米汁液的制備方法如下從北京郊區(qū)顯矮花葉癥狀的玉米葉片經(jīng)鑒定為SCMV侵染后，通過機械摩擦方式接種到玉米(綜31)植株上，保存在防蟲溫室中。接種的玉米植株發(fā)病后采上部花葉癥狀明顯的幼嫩葉片，稱取0. Ig該幼嫩葉片，加入Iml接種緩沖液，充分研磨后轉(zhuǎn)移到Eppendorf 管中，4°C，5000g離心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。2、從粗提純病毒中提取SCMV RNA在100 μ 1 粗提純 SCMV 中加入 160 μ 1 RNAse-free 的 ddH20，再加入 200 μ 1 RNA 抽提緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0 ；200mM NaCl ；5mM EDTA)，然后加入 40 μ 1 10% SDSjg 勻，室溫保持5min。加入2倍體積(800 μ 1)的PCI (苯酚氯仿異戊醇=25 24 1), 混勻，12，OOOXg離心5min。吸取上層水相，加入2倍體積的PCI，混勻，12，OOOXg離心 5min，再重復抽提一次。吸取上層水相，確定其體積后，加入1/10(V/V)3M的NaAC(pH 5. 2)，混勻；加入2. 2倍體積的無水乙醇，混勻，-80°C沉淀Ih或-20°C沉淀過夜。12，OOOXg離心20min，用Iml 70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥；所得RNA溶于30 μ 1 RNAse-free的ddH20 中，-80°C保存?zhèn)溆?。三、玉米原生質(zhì)體的制備、轉(zhuǎn)化及觀察(1)玉米原生質(zhì)體的分離選取籽粒飽滿、大小均一的玉米自交系綜31 (購自中國農(nóng)業(yè)大學國家玉米改良中心)種子，用氯氣消毒并在超凈工作臺吹凈氯氣后置于25°C的培養(yǎng)箱中發(fā)芽、暗培養(yǎng)。當玉米黃化苗長到第2片葉高于第一片10 15cm時，剪下第2片葉子中間的6 8cm的部分， 輕輕將20片剪下的葉片疊在一起，用新開封的刀片切成約0. 5mm的細絲，在蒸餾燒瓶中按照Ig葉片加入5ml酶溶液(1 1. 5%纖維素酶RlO (Yakult Honsha,日本)、0· 2 0. 4% 離析酶R10(Yakult Honsha)、0. 6M甘露醇、20mM KCl、20mM MES，pH5. 7)的比例加入酶溶液， 然后消化、避光，抽真空30min (真空度0. 05MPa)，使酶溶液充分滲透到葉片中。然后在搖床 (40rpm)上繼續(xù)避光消化池。將上述經(jīng)酶溶液消化的葉片濾過尼龍網(wǎng)(孔徑38 μ m)，轉(zhuǎn)移到圓底離心管中，置于冰上，獲得分離的玉米原生質(zhì)體。(2)玉米原生質(zhì)體的活力測定用尖端剪去的吸頭取出500 μ 1分離的原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入等體積的0. 02%熒光素乙酰乙酸鹽(FDA)溶液(0. Iml FDA母液Qmg FDA溶于Iml丙酮) 溶于 IOml CPW 洗液中(27. 2mg/L KH2PO4,101mg/L KNO3,1480mg/L CaCl2 · 2H20，246mg/L MgSO4 · 7Η20，0· 16mg/L ΚΙ,Ο. 025mg/L CuSO4 · SH20,10% mannitol, pH5. 7)，靜置 5min。取適量樣品置于載玻片上，用鑷子輕輕蓋上蓋片，注意不要使其蓋片滑動。在熒光顯微鏡下， 五點取樣，每個視野的原生質(zhì)體總數(shù)不少于50個，觀察記錄原生質(zhì)體總數(shù)和發(fā)黃綠熒光的原生質(zhì)體總數(shù)，發(fā)黃綠熒光原生質(zhì)體為有活力的原生質(zhì)體(圖1中A，玉米原生質(zhì)體活力檢測；分離出的玉米原生質(zhì)體經(jīng)FDA染色后在顯微鏡下觀察黃綠色熒光，物鏡倍數(shù)20X)。(3)玉米原始質(zhì)體的轉(zhuǎn)化及觀察將玉米原生質(zhì)體用電擊緩沖液(0.6M mannitol,4mM MES, pH5. 7,20mM KCl)洗2 次。150 X g離心2min，小心吸去上清液，用電擊緩沖液重懸原生質(zhì)體，用血球計數(shù)板計數(shù)使重懸后的原生質(zhì)體濃度達到2X106/ml，將原生質(zhì)體置冰上備用。在2ml圓底離心管中加入50 μ g重組質(zhì)粒pGFP-Ropl和300 μ 1原生質(zhì)體，充分混勻，再加入10 μ g SCMVRNA,用移液器吸吐混勻，電擊2次(5msec，200 μ F，400V)，冰上放置lOmin。150g離心anin，吸去上清液，用Iml孵育緩沖液(1000ml中包括30g蔗糖，4. 3gMurashige-Skoog[MS]鹽，2mg甘氨酸，Img維生素Bi，IOOmg肌醇，0. 5mg 1-萘乙酸，0. 5mg 6-BA,0. 2mg 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 55M甘露醇，pH 5. 7)重懸原生質(zhì)體，25°C黑暗孵育過夜。同時，以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGFP和SCMV RNA的原生質(zhì)體作為對照。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GFP綠色熒光來檢測ZmRopl 的表達，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PGFP的對照原生質(zhì)體，綠色熒光分布于整個原生質(zhì)體細胞，而轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGFP-Ropl的原生質(zhì)體，綠色熒光分布于原生質(zhì)體細胞質(zhì)膜(圖1中B，轉(zhuǎn)化后的玉米原生質(zhì)體GFP綠色熒光觀察；激光掃描共聚焦顯微鏡激發(fā)光波長488nm，40X油鏡，標尺 10 μ m)。四、轉(zhuǎn)化后玉米原生質(zhì)體的總RNA提取和Real-time RT-PCR檢測SCMV的累積
將Iml的TRIzol anvitogen，美國)加入到轉(zhuǎn)化后孵育Mh的原生質(zhì)體中(每 Iml TRIzol裂解10個電擊反應的原生質(zhì)體)，劇烈振蕩^iin ；冰上放置5min。原生質(zhì)體裂解物于4°C、12，000Xg離心IOmin以除去不溶的成分，將上清轉(zhuǎn)入一新的1. 5ml離心管中。 在室溫下靜置5min，加0. 2ml氯仿，劇烈震蕩15s，然后在室溫下靜置2 5min，再于4°C、 12，000 Xg的條件下離心15min。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中，加0. 5ml異丙醇， 混合(上下顛倒)，使樣品在室溫下靜置15min，4°C、12，000 X g離心lOmin，則RNA會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀。棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉淀，于4°C、7，500X g離心5min (如 RNA沉淀懸浮起來，則用12，000 X g)，棄乙醇。RNA在室溫下干燥IOmin或在冷凍離心干燥機上濃縮5min，加入30 μ 1 RNAase-Free的ddH20溶解沉淀，_70°C保存?zhèn)溆谩?
將總RNA用DNase I消解后，檢測其純度和濃度。然后用試劑盒Takaka SYBRpremix Ex TaqTm 進行 Real-time RT-PCR 分析超量表達 ZmRopl 對 SCMV 復制的影響。以500ng總RNA作為模板，以試劑盒自帶01 igo_d (T)和Random 6mers作為反向引物，進行反轉(zhuǎn)錄反應。每個反應管依次加入4. 0μ 1 5XReaction BufferU. 0μ 1 dNTPs (IOmM) >0. 5μ 1 RNase inhibitor^. 5 μ 1 01 igo-d (T) Primer (50 μ Μ) >0. 5 μ 1 Random 6mers (100 μ Μ)、500ng 總 RNA、0. 5 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase,最后用 RNAse-free的ddH20補充至20 μ 1。反應液在42°C水浴反應lh。獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用試劑盒自帶的稀釋緩沖液(EASY Dilution)稀釋10倍。每個PCR反應管中加入2. 0μ 1稀釋10倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、12. 5μ 1 2XSYBR Premix ExTaqUOmM dNTPs, 1. 0μ 1 SCMV 特異性引物(20 μ Μ)引物序列為SCMVqF 5' -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3‘，SCMVqR 5' -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3 ‘，最后用 dd H2O 補充至 25 μ 1。玉米泛素基因(登錄號似9159)作為內(nèi)參，內(nèi)參引物為UbiF 5' -GGAAAAACCATAACCCTGGA-3‘，UbiR 5 ‘ -ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3 ‘。 在 DNAEngine Opticon 2system(Bio-Rad)上進行反應。反應條件是50°C，2min ；94°C, IOmin ；94°C，15sec，58°C， 15sec ;72°C，15sec ;80· 5°C，lsec，讀板，40 個循環(huán)。Real time PCR 結(jié)束以后，根據(jù)擴增儀自帶的軟件Opticon Monitor 3對數(shù)據(jù)進行分析。2_ΔΔετ法的步驟如下首先，對所有的測試樣本(test)和校準樣本(calibrator)，用參照基因(ref)的 Ct值歸一目標基因(target)的Ct值Δ CT(test) = CT(targetj test)-CT(refj test)A Cll(Calibrator) 。T (target，calibrator)。T (ref, calibrator)其次，用校準樣本的Δ Ct值歸一測試樣本的Δ Ct值
Δ Δ Ct = Δ Ct (test) - Δ Ct(calibrator)最后，計算表達水平比率f=表達量的比值得到的結(jié)果是通過參照基因表達水平校準的實驗樣本中目標基因相對于校準樣本的增加或減少的倍數(shù)，用參照基因校準目標基因表達的目的是為了彌補樣本組織量的差
巳結(jié)果表明，過表達ZmRopl的玉米原生質(zhì)體(即轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pGFP-Ropl的玉米原生質(zhì)體)中SCMV mRNA的相對表達量為747%，而轉(zhuǎn)入空載體pGFP-II的玉米原生質(zhì)體中 SCMV mRNA的相對表達量為1139. 6%，相對于轉(zhuǎn)入空載體pGFP-II的玉米原生質(zhì)體，過表達ZmRopl的玉米原生質(zhì)體中SCMV mRNA的相對表達量降低392. 6% (圖1中C，Real-time RT-PCR檢測玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化24h后SCMV的mRNA水平；每個數(shù)值代表三次獨立實驗數(shù)值士標準偏差，不同字母代表student’ s t-test顯著性差異(P < 0. 05)。實施例2、ZmRopl在玉米植株上的瞬時沉默及其對SCMV侵染的影響一、ZmRopl在玉米植株上的瞬時沉默1、構(gòu)建ZmRopl瞬時沉默載體從美國自交系cv.Va35葉片中提取總RNA為模板，用上下游引物RoplGSF和 RoplGSR,RoplGSF 5 ‘ -CATAAGCTTGTCGACCCACGCGTCCGCCCAG-3 ‘，(下劃線部分為 Hind III酶切位點)， RoplGSR 5 ‘ -CATAAGCTTAGCAGCGGCGGATGAGCAGGGC-3 ‘，(下劃線部分為 Hind III酶切位點)，反轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到ZmRopl非翻譯區(qū)特異性片段，通過HindIII酶切PCR 產(chǎn)物并回收14S3P的基因片段，同時用HindIII酶切雀麥花葉病毒侵染性克隆載體BMVpF3-5/13’ A/G(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得，記載過該載體的非專利文獻是 Ding, X. S. ， Schneider, W. L. ， Chaluvadi, S. R. , Mian, Μ. A. R. ， &Nelson, R. S. (2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions,19, 1229-1239.)，回收2. Ikb的載體片段，將回收的2. Ikb的載體片段與回收的I^bp的基因片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進行測序驗證，測序結(jié)果表明在載體BMVpF3-5/13’ A/ G的HindIII酶切位點處插入了序列表中序列2第1到145位所示的ZmRopl序列，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將構(gòu)建的沉默載體命名為pF3-5/13’ A/G-ZmRopl。2、體外轉(zhuǎn)錄模板的制備在體外轉(zhuǎn)錄之前，用SpeI線性化載體BMVFl-11、用I^shAI線性化載體BMVF2-2 (公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得，記載過載體BMVFl-Il和載體BMVF2-2的非專利文獻是 Ding, X. S. ， Schneider, W. L. ， Chaluvadi, S. R. ， Mian, Μ. A. R. ， &Nelson, R. S. (2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions, 19，1229-1239.)、用 I^shAI 線性化重組載體 pF3_5/13’ A/G-ZmRopl 和用 I^shAI 線性化載體 BMVpF3-5/13’A/G。線性化后的質(zhì)粒DNA用瓊脂糖凝膠電泳分析線性化完全程度，確定線性化完全以后，用DNA回收試劑盒進行回收，測定DNA濃度，所有DNA濃度調(diào)整到500ng/y 1。3、體外轉(zhuǎn)錄以Spe I線性化的BMVFl-Il為模板，進行體外轉(zhuǎn)錄，得到BMVFl-Il體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； 以I^shA I線性化的BMVF2-2為模板，進行體外轉(zhuǎn)錄，得到BMVF2-2體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；以I^shA I 線性化的pF3-5/13’A/G-ZmRopl為模板，進行體外轉(zhuǎn)錄，得到pF3_5/13’A/G-ZmRopl體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；以I3ShA I線性化的BMVpF3-5/13’A/G為模板，進行體外轉(zhuǎn)錄，得到BMVpF3-5/13’A/G體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。體外轉(zhuǎn)錄體系參照Riboprobe andRiboMAX(TM) In Vitro Transcription Systems (!Iomega，美國)，并進行修改，體外轉(zhuǎn)錄體系如下所示最后用無RNA酶的ddH20補足20μ1，在37°C反應lh。體外轉(zhuǎn)錄完成以后，取出 1 μ 1用瓊脂糖凝膠電泳分析體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率和體外轉(zhuǎn)錄物的降解情況。在接種玉米以前，先對上述體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入ddH20，補足至100 μ 1，加入等體積4M LiCl溶液，混勻后，冰浴過夜或-70°c沉淀Ih以上，12，000 Xg 離心20min，充分吸出上清后，用70%乙醇洗滌兩次，干燥后溶于適量RNAase-Free的ddH20 中，-70°C保存?zhèn)溆?。吸出的上清中為雙鏈DNA模板，可以用乙醇沉淀后再次利用做體外轉(zhuǎn)錄的模板。4、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種將載體BMVF1-11、載體BMVF2-2和重組載體pF3-5/13，A/G_ZmRopl三者的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等量混勻后摩擦接種玉米Va35三葉期的第二片葉，即為沉默接種(C-BMVAA;R0p145)。 將載體BMVF1-11、載體BMVF2-2和載體BMVpF3_5/13’A/G三者的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等量混勻后摩擦接種玉米三葉期的第三片葉片，即為空載體對照接種(C-BMVve)；用無RNaseWddH2O 接種的植株作為模擬接種(Mock)。接種方法如下在待接種的葉片的第二片葉上輕微撒上高溫滅菌的金剛砂，按每片葉子接種 l.Oyg體外轉(zhuǎn)錄物的量吸取接種液(體外轉(zhuǎn)錄為混合物)，用帶有乳膠手套的手指輕輕涂抹葉片，盡量均勻且不重復涂抹。5min后，用蒸餾水沖洗葉片，洗去金剛砂。接種后的植物放置在暗處1 后，然后置22°C的溫室中生長。C-BMVaA;和C-BMVAA;/R0p145每次都至少各接種3株，同時用RNAase-Free的ddH20接種相同數(shù)量的植株作為模擬接種。5、結(jié)果(1)體外轉(zhuǎn)錄物接種后美國自交系cv. Va35的表型C-BMVa7g和pC-BMVA/e/R0pl145接種以及模擬接種美國自交系cv. Va35后，在培養(yǎng)箱中生長，觀察美國自交系cv. Va35上出現(xiàn)的癥狀等表型，并用數(shù)碼相機記錄。在代表C-BMVaA;和C-BMVAA;/R0p145的體外轉(zhuǎn)錄物接種后第7天，在接種葉上第一片系統(tǒng)葉均出現(xiàn)輕微的白色條紋癥狀。在接種后第10天，C-BMVA/e/R0p145接種的植株在接種葉上第一片和第二片系統(tǒng)葉均出現(xiàn)緊密的白色或淡黃色條紋，但接種C-BMVve玉米植株系統(tǒng)葉片仍表現(xiàn)輕微的白色條紋癥狀；而模擬接種的玉米植株的葉片未出現(xiàn)白色或淡黃色條紋癥狀，表型正常(圖2中A，ZmRopl瞬時沉默的美國自交系cv. Va35的表型；體外轉(zhuǎn)錄物及模擬接種IOd后對第一片系統(tǒng)葉進行拍照)。
5XT3RNA聚合酶緩沖液 0. IM DTT
RNA酶抑制劑(40υ/μ1)
5mM Cap (m7GpppG)
10 X NTPs (20mMATP、、CTP、UTP，
4 μ 1 2 μ 1 0.5 Ul 2 μ 1 2 μ 1
2mM GTP)
處理好的模板 Τ3 RNA聚合酶
1-2 ug 0.5 Ul
(2)美國自交系cv. Va35中ZmRopl的沉默效率檢測為了驗證接種C-BMVve和C-BMVA/e/R0p145的玉米植株在表型上的差異是由于ZmRopl的沉默引起的，在接種后第12天，提取各接種植株的系統(tǒng)葉片的總RNA，通過 Real-time RT-PCR檢測ZmRoplmRNA水平，所用到的特異性引物為RoplqF 5' -AGGATGTTCTATGATGAACATCTTCGG-3‘，RoplqR 5' -CTGCTTAACTCATAGCTAGCTAACCACAC-3 ‘。具體方法參照實施例 1 中的步驟四。結(jié)果表明，接種C-BMVAA;/R0p145的玉米植株系統(tǒng)葉片中，ZmRopl的mRNA水平是接種C-BMVaaj植株的系統(tǒng)葉片ZmRopl的mRNA水平的20% ，是模擬接種植株(Mock) 系統(tǒng)葉片ZmRopl的mRNA水平的15% 18% (圖2中B，體外轉(zhuǎn)錄物及模擬接種后14天， Real-time RT-PCR檢測ZmRopl沉默效率。每個數(shù)值代表三次獨立實驗數(shù)值士標準偏差， 不同字母代表student，s t-test顯著性差異(P < 0. 05) ；Mock代表模擬接種植株系統(tǒng)葉片ZmRopl的mRNA水平；C-BMVve代表接種C-BMVve植株的系統(tǒng)葉片ZmRopl的mRNA水平； C-BMVA/G/Rop145代表接種C-BMVA/e/R0p145植株的系統(tǒng)葉片ZmRopl的mRNA水平)。二、瞬時沉默ZmRop 1對SCMV侵染的影響1、ZmRopl瞬時沉默的美國自交系cv. Va35挑戰(zhàn)接種SCMV為了研究瞬時沉默對SCMV侵染的影響，在C_BMVAA;/R0pl145等體外轉(zhuǎn)錄物接種后 12天，在接種葉上部第二片系統(tǒng)葉用金剛砂摩擦接種SCMV，具體方法為在步驟1)接種 IOd后，分別在沉默接種(C-BMVve Rop145)、空載體對照接種(C-BMVaA;)和模擬接種(Mock) 的玉米葉片上等量接種(5 μ 1)(等量是指沉默接種、空載體對照以及模擬接種的葉片上接種的SCMV侵染的玉米汁液量是相等的)SCMV侵染的玉米汁液。接種方法為將SCMV侵染的玉米汁液通過機械摩擦方式接種到三葉期玉米的第二片系統(tǒng)葉上，接種SCMV后的美國自交系cv. Va35植株繼續(xù)在相同的生長條件下生長。SCMV侵染的玉米汁液的制備方法如下從北京郊區(qū)顯矮花葉癥狀的玉米葉片經(jīng)鑒定為SCMV侵染后，通過機械摩擦方式接種到玉米(綜31)植株上，保存在防蟲溫室中。接種的玉米植株發(fā)病后采上部花葉癥狀明顯的幼嫩葉片，稱取0. Ig該幼嫩葉片，加入Iml接種緩沖液，充分研磨后轉(zhuǎn)移到Eppendorf 管中，4°C，5000g離心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。接種緩沖液的配制將1. 362g KH2PO4溶于IOOOml蒸餾水中，再將 1. 78IgNa2HPO4 · 2H20 溶于 IOOOml 蒸餾水中，然后將 490ml KH2PO4 溶液和 5IOmlNa2HPO4 溶液混合，4°C保存?zhèn)溆谩?、美國自交系cv. Va35植株在二次接種SCMV后的表型差異這些接種了 C-BMVve和C-BMVAA;/R0pI145以及模擬接種的美國自交系cv. Va35植株在二次接種SCMV后在表型上又出現(xiàn)了差異。一方面表現(xiàn)為，SCMV系統(tǒng)癥狀出現(xiàn)的時間不同，沉默接種(C-BMVaA; Rop145)的美國自交系cv.Va35植株二次接種SCMV后第一片、第二片系統(tǒng)葉出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀的時間是在二次接種SCMV后7d和Ild ；而空載體對照接種(C-BMVaxc) 和模擬接種(Mock)的美國自交系cv.Va35植株中二次接種SCMV后第一、二片系統(tǒng)葉出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀對應的時間是IOd和14d。二次接種SCMV后7d和lld，沉默接種(C_BMVaA; Rop145) 的美國自交系cv. Va35植株，SCMV接種葉上系統(tǒng)葉均能通過RT-PCR檢測到SCMV，而空載體對照接種(C-BMVaA;)和模擬接種(Mock)的美國自交系cv. Va35植株，對應葉位的葉片中檢測不到SCMV。另一方面表現(xiàn)為，沉默接種W-BMVve Rop145)的美國自交系cv. Va35植株中SCMV 系統(tǒng)葉表現(xiàn)的系統(tǒng)花葉癥狀要比空載體對照接種(C-BMVve)和模擬接種(Mock)植株癥狀要嚴重的多(圖3中A，分別為沉默接種(C-BMVve Rop145)、空載體對照接種(C-BMVaA;)和模擬接種(Mock)的美國自交系cv. Va35植株二次接種SCMV后系統(tǒng)葉的表型；SCMV接種后10 天對第一片系統(tǒng)葉片進行拍照)。3、瞬時沉默ZmRopl促進了 SCMV在美國自交系cv. Va35上的系統(tǒng)侵染為了驗證SCMV在以上植株的癥狀差異是由于其在這些植株上侵染程度不同造成的，分別收集沉默接種(C-BMVA/e Rop145)、空載體對照接種(C-BMVve)和模擬接種(Mock)的美國自交系cv. Va35植株二次接種SCMV后的SCMV系統(tǒng)葉用于分析SCMV的mRNA水平和病毒的累積情況。這些系統(tǒng)葉片一部分用來提取總RNA，用Real-time RT-PCR分析SCMV的 mRNA水平，所用到的特異性引物為SCMVqF 5' -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3‘，SCMVqR 5' -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3‘。具體方法參照實施例1中的步驟四。結(jié)果表明，在沉默接種(C-BMVve Rop145)的美國自交系cv.Va35植株中，第一、二片系統(tǒng)葉中，SCMV的mRNA水平要比空載體對照接種(C-BMVve)的美國自交系cv. Va35植株和模擬接種(Mock)的美國自交系cv. Va35植株中對應葉位的系統(tǒng)葉片中SCMV的mRNA 水平均顯著高；沉默接種植株中，第一片系統(tǒng)葉中，SCMV的mRNA水平要比空載體對照接種和模擬接種分別高257. 5%和294% ；第二片系統(tǒng)葉中，SCMV的mRNA水平要比空載體對照接種和模擬接種分別高145. 8%和171. 8% ；(圖3中B，Real-time RT-PCR檢測沉默接種 (C-BMVveRop145)、空載體對照接種(C-BMVve)和模擬接種(Mock)的美國自交系cv. Va35植株二次接種SCMV后系統(tǒng)葉的mRNA水平。每個數(shù)值代表三次獨立實驗數(shù)值士標準偏差，不同字母代表student，s t-test顯著性差異(P < 0. 05) ；Mock代表模擬接種植株系統(tǒng)葉片 SCMV的mRNA水平；C-BMVve代表接種空載體對照接種植株的系統(tǒng)葉片SCMV的mRNA水平； C-BMVA/G/Ropl145代表接種沉默接種植株的系統(tǒng)葉片SCMV的mRNA水平)。
1權(quán)利要求
1.序列表中序列1所示的蛋白在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用。
2.序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用； 所述蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
3.含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的應用，其特征在于所述重組表達載體為在pGFP載體的多克隆位點插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應用，其特征在于所述抑制植物病毒復制為抑制植物病毒在植物體或植物組織或植物細胞中的復制； 所述植物細胞為植物細胞中的原生質(zhì)體； 所述植物病毒為引起玉米矮花葉病的植物病毒； 所述引起玉米矮花葉病的植物病毒為甘蔗花葉病毒。
6.序列表中序列1所示的蛋白在防治植物病毒病害中的應用。
7.序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在防治植物病毒病害中的應用；所述蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
8.含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在防治植物病毒病害中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的應用，其特征在于所述重組表達載體為在pGFP載體的多克隆位點插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的應用，其特征在于 所述植物病毒病害為玉米矮花葉??；所述玉米矮花葉病是由甘蔗花葉病毒引起的； 所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了玉米ZmRop1蛋白的新用途。本發(fā)明所提供的新用途為序列表中序列1所示的蛋白在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用、序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用、以及含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在制備抑制植物病毒復制的產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明通過在玉米原生質(zhì)體中共轉(zhuǎn)化能表達ZmRop1的質(zhì)粒與SCMV RNA，發(fā)現(xiàn)過量表達ZmRop1，SCMV病毒復制水平降低約392.6％，即過量表達ZmRop1可有效抑制SCMV的復制。這些將在防治玉米病毒病害中發(fā)揮重要作用，同時為玉米的分子育種打下良好的基礎。
文檔編號A01N63/00GK102428963SQ201110285569
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者周濤, 施艷, 曹言勇, 范在豐 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學