專利名稱：一種作物病害防治復(fù)合生物制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種作物病害防治復(fù)合生物制劑，具體地說是一種生物農(nóng)藥和肥料集一體的無公害復(fù)合生物制劑，既可防治農(nóng)作物常見的土傳病害，又能提供農(nóng)作物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。
背景技術(shù)：
目前，世界范圍內(nèi)公認(rèn)的五大難防治的病害為土傳病害、維管束病害、病毒病害、 細(xì)菌病害和線蟲病害。其中，土傳病害是指土壤中的土傳病原體從農(nóng)作物的根部侵染，導(dǎo)致植物大量死亡，造成減產(chǎn)，影響經(jīng)濟(jì)效益的提高，屬于毀滅性的病害。由于其危害廣泛、嚴(yán)重，被列為這五大難防治的病害之首，而在我國每年因土傳病害造成的損失就高達(dá)240億。 土傳病害的防治走過了漫長的歷程，從殺生性的土壤消毒劑如氯化苦、溴甲烷以及多種殺菌劑的應(yīng)用發(fā)展到生物防治，但土傳病害的傳播與危害依然倡獗。究其原因在于耕作面積小，種植品種單一，土傳病原菌在土壤中大量積累，而土傳病原菌對(duì)土壤環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，合適的條件下就會(huì)大規(guī)模爆發(fā)，因此，解決好農(nóng)作物土傳病害防治問題越來越緊迫。嚴(yán)重危害農(nóng)作物的土傳病害主要包括枯萎病，黃萎病，灰霉病，辣椒疫霉病，立枯病，猝倒病等等。其中，枯萎病和黃萎病是我國北方地區(qū)兩種危害性極大的病害?？菸。怯烧婢蚣?xì)菌引致的植物病害，發(fā)病突然，癥狀包括嚴(yán)重的點(diǎn)斑、凋萎， 葉、花、果、莖或整株植物的死亡。疫病可影響花、葉、芽包、幼苗、小枝、莖(藤)及頂梢。大多數(shù)重要經(jīng)濟(jì)作物均受一種或多種疫病感染。例如，西瓜枯萎病是由半知菌亞門真菌西瓜尖鐮孢菌侵染所致。病菌在土壤中和未腐熟的帶菌肥料中越冬，在離開寄主的情況下，能存活5 — 6年，部分病菌可存活10年以上。西瓜枯萎病菌主要通過根部傷口或根毛頂端細(xì)胞間隙侵入，先在寄主管壁細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)生長，然后進(jìn)入維管束，在導(dǎo)管內(nèi)發(fā)育，病菌分泌果膠酶和纖維素酶，分解破壞細(xì)胞，使導(dǎo)管內(nèi)積累果膠類物質(zhì)，堵塞導(dǎo)管，影響水分運(yùn)輸，引起植株萎蔫，病株率可達(dá)70%左右，病殘?bào)w及病糞，種子亦可傳病。西瓜枯萎病各個(gè)時(shí)期均可發(fā)生，以結(jié)果期發(fā)病最重。其病菌適宜溫度在25 - 30°C，土溫低于23°C或高于34°C，發(fā)病較輕，土壤含水量高，濕度大時(shí)發(fā)病重。黃萎病，由半知菌亞門、淡色孢科、輪枝菌屬侵染所致。其病原菌主要為大麗輪枝菌{Verticillium dahliae Kleb)和黑白輪枝菌{Verticillium alboatrum)。黑白輪枝菌主要侵染茄科植物及首稽等植物；而大麗輪枝菌由于寄主極其廣泛，對(duì)高溫和劇烈溫度變化的適應(yīng)能力較強(qiáng)，所以主要感染在棉花，茄子、番茄、青椒、甜瓜、黃豆、菊、薔薇等植物。最初，下部葉片局部萎蔫，葉邊上卷，2—3天后，病部由黃白色轉(zhuǎn)為黃色。葉片邊緣變色較多， 以小葉脈為中心呈楔形。隨后，變色部位逐漸擴(kuò)大，整片小葉黃變，慢慢褐變枯死。病害加重時(shí)，上部葉片也依次發(fā)病枯死，并導(dǎo)致下部葉片慢性枯萎。因此，病株株高降低、果實(shí)的坐果及生長明顯受影響。有些年份發(fā)病率可達(dá)70 80%，產(chǎn)量損失達(dá)50 80%，重則絕收。面對(duì)如此嚴(yán)峻的形勢(shì)，以往的利用化學(xué)農(nóng)藥處理嚴(yán)重污染土壤，并且由于化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，長期的積累又造成了對(duì)土壤的重復(fù)污染。同時(shí)，造成的病原體抗性增強(qiáng)，殺滅有益菌株，已經(jīng)難以取得很好的防治效果。化學(xué)農(nóng)藥在防治病害同時(shí)，無選擇地大量傷害了有益生物，破壞了自然界生物種群復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)平衡失調(diào)。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足， 我們采取了微生物防治技術(shù)。由于其通過微生物間或代謝產(chǎn)物與微生物間相互拮抗起作用，具有選擇性強(qiáng)，對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全，不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，而越來越受到人們的關(guān)注?？莶菅挎邨U菌和木霉作為可選用的生防菌株，早在二十世紀(jì)初就開始探討和用于土傳病原體的防治。枯草芽孢桿菌^Bacillus sMiihi)BACI是一種嗜溫的好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌，具有廣泛的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，因此一直是植病生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)木霉(Jrichoderma )是一種非常具有生防潛力的拮抗菌，其拮抗機(jī)制多種多樣，包括產(chǎn)生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競(jìng)爭(zhēng)作用等機(jī)制，對(duì)土壤中其他菌株都具有較好的抑菌效果，并且具有延長防效的作用。當(dāng)前我國的生物防治劑盡管種類繁多，但總體來說，品種及有效成分雜亂，所選用的菌種防治效果偏低和配方無針對(duì)性，生物防治制品的質(zhì)量和實(shí)際應(yīng)用效果不理想，生產(chǎn)成本高，大規(guī)模推廣應(yīng)用范例較少。具有針對(duì)性的高效菌種的分離篩選、純化培養(yǎng)以及配方實(shí)現(xiàn)和生產(chǎn)成本問題，制約了生物防治制劑的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
面對(duì)現(xiàn)在缺乏有效抑制土傳病害的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種作物病害防治復(fù)合生物制劑，主要用于防治作物土傳病害，特別是防治黃萎病和枯萎病為主的、高效的、無公害的生物防治、增產(chǎn)復(fù)合制劑。本發(fā)明所述的作物病害防治復(fù)合生物制劑的組分包括擬康氏木霉發(fā)酵液和枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。本發(fā)明所述的作物病害防治復(fù)合生物制劑，包括以下主要組分 擬康氏木霉發(fā)酵液、
枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、 水溶性甲殼素、 味精殘液、 黃腐酸鉀。本發(fā)明所述的作物病害防治復(fù)合生物制劑中所使用的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) MCI發(fā)酵制得的。本發(fā)明中枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus sub tills) BACI是從植株根際土壤中分離、然后經(jīng)誘變、篩選的新型菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis BACI)-0該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 1442，保藏時(shí)間為2005年8月22日，保藏地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明人將從試驗(yàn)田植物病害發(fā)生嚴(yán)重的田塊中無明顯發(fā)病癥狀的植株根際土壤中分離出的枯草芽孢桿菌原始菌株，經(jīng)過紫外線二次復(fù)合誘變(1 X IO7個(gè)/ml的菌懸液放于直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，紫外燈預(yù)熱20 min,將培養(yǎng)皿至于磁力攪拌器上并使培養(yǎng)皿在20 W紫外燈垂直距離30 cm左右，照射150S)篩選出具有較高生長速度、β -甘露聚糖酶、β葡聚糖酶、蛋白酶和抑菌活性的菌株，即為本發(fā)明所提供的保藏號(hào)為CGMCC NO. 1442 的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ^ACl。本發(fā)明中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) BACI的培養(yǎng)方法為 采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)獲得枯草芽孢桿菌芽孢
①將保藏的枯草芽孢桿菌(β— sMiihdBACI菌種，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏0. 3g、蛋白胨lg、氯化鈉0. 5g、瓊脂2g、蒸餾水100ml、ρΗ7· 0 7. 2)活化24h ； ②接種環(huán)挑取菌體接種于LB培養(yǎng)基(胰化蛋白胨IOg、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸餾水 1000ml),擴(kuò)大培養(yǎng)Mi ；③以1%接種量接種于PDB培養(yǎng)基中(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml)，發(fā)酵條件為溫度37°C，pH=7，溶解氧氣濃度維持在20-30%飽和度，220rpm， 培養(yǎng)時(shí)間為2 3天，有效菌體濃度為1-3X IO9個(gè)/ml。將篩選出的該菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，其優(yōu)良性狀遺傳穩(wěn)定。表1枯草芽孢桿菌誘變結(jié)果
出發(fā)菌株和突變菌株搖瓶培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液(SOOOr/min，離心20min) β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶活性和盆栽實(shí)驗(yàn)中對(duì)黃瓜黃萎病菌(/^sariy oxysporum f.sp. 腫eri/ 腫)、西瓜枯萎病菌(/7W1Sari腫oxysporum f.sp. niveum)的防治效果。
權(quán)利要求
1.一種作物病害防治復(fù)合生物制劑，其組分包括枯草芽孢桿菌發(fā)酵液和擬康氏木霉發(fā)酵液。
2.如權(quán)利要求1所述的作物病害防治復(fù)合生物制劑，其特征在于包括以下主要組分 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、擬康氏木霉發(fā)酵液、 水溶性甲殼素、 味精殘液、 黃腐酸鉀。
3.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑，其特征在于其中枯草芽孢桿菌發(fā)酵液是由枯草芽孢桿菌mallus subtilis) BACI發(fā)酵制得的，該菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 1442。
4.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑，其特征在于其中擬康氏木霉發(fā)酵液是由擬康氏木霉(rricAoiferaa pseudokiningii) WWl菌種發(fā)酵制得的，該菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 1443。
5.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑，其特征在于各主要組分的重量份數(shù)如下枯草芽孢桿菌發(fā)酵液38-42份、擬康氏木霉發(fā)酵液38-42份、水溶性甲殼素0. 5-1. 5 份、味精殘液8-10份、黃腐酸鉀8-12份。
6.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑，其特征在于各主要組分的重量份數(shù)如下枯草芽孢桿菌發(fā)酵液40份、擬康氏木霉發(fā)酵液40份、水溶性甲殼素1份、味精殘液9 份、黃腐酸鉀10份。
7.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑的應(yīng)用，其特征在于適用于番茄、 辣椒、茄子、黃瓜、西瓜、蘋果、韭菜、棉花等多種蔬菜、瓜果及農(nóng)作物的病害防治和增產(chǎn)。
8.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑的應(yīng)用，其特征在于用于對(duì)枯萎病、黃萎病、灰霉病、辣椒疫霉病、霜霉病、白粉病、灰霉病、葉霉病等病害防治。
9.如權(quán)利要求1或2所述作物病害防治復(fù)合生物制劑的應(yīng)用方法，其特征在于將液體作物病害防治復(fù)合生物制劑加水稀釋100-200倍，先進(jìn)行一次灌根，之后每隔10 - 15天噴施一次，灌根與噴施交替使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種作物病害防治復(fù)合生物制劑。其原料組成為擬康氏木霉發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、水溶性甲殼糖、味精殘液、黃腐酸鉀。其中，擬康氏木霉和枯草芽孢桿菌是經(jīng)過篩選和誘變處理獲得的高效菌株，并通過液體深層發(fā)酵技術(shù)獲得擬康氏木霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，再組合制成作物病害防治復(fù)合生物制劑。本發(fā)明作物病害防治復(fù)合生物制劑，對(duì)枯萎病、黃萎病、灰霉病、辣椒疫霉病、霜霉病、白粉病、灰霉病、葉霉病等病害都有明顯防治效果，特別是用于農(nóng)業(yè)中常見的危害性極大的枯萎病和黃萎病的防治。適用于番茄、辣椒、茄子、黃瓜、西瓜、蘋果、韭菜、棉花等多種蔬菜、瓜果及農(nóng)作物的病害防治和增產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102428966SQ20111029211
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者王立華, 耿小青, 陳靠山 申請(qǐng)人:山東靠山生物科技有限公司