專利名稱：鐵皮石斛的組培繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種鐵皮石斛的無激素組織培養(yǎng)快繁方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Dendrobium officinale)，別名黑節(jié)草，是蘭科(Orchidaceae)石斛屬 (Dendrobium)中名貴的藥用植物，是中華九大仙草之首，有極其豐富的藥用價(jià)值，野生資源極少，主要分布于云南、廣西、安徽等地。據(jù)《本草綱目》記載，鐵皮石斛具有“主治傷中、補(bǔ)五臟虛勞、強(qiáng)陰益精、厚腸胃、補(bǔ)內(nèi)絕不足、平胃氣、長肌肉、益智除驚、輕身延年之功效”。由于其莖干入藥，對咽喉疾病、提高人體免疫力乃至腫瘤都具有顯著療效，成為了馳名中外的保健佳品。由于人們長期的野外采挖，野生的鐵皮石斛已經(jīng)到了瀕危的狀況。鐵皮石斛坐果率很低，種子不易發(fā)芽，自然繁殖率極低。建立組培快繁體系可以從根本上解決這一問題。迄今，鐵皮石斛組培快繁立法大多都選用莖尖、新芽、休眠芽為外植體，通過擬原球莖途徑培養(yǎng)。用無菌種子產(chǎn)生原球莖組培方法鮮有報(bào)道。盡管這些方法優(yōu)化了傳統(tǒng)生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分，操作簡便，生產(chǎn)成本低，藥用成分接近野生鐵皮石斛，但存在繁殖率較低，分化慢，難于進(jìn)行批量生產(chǎn)和工廠化生產(chǎn)等問題。發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明旨在提供一種鐵皮石斛的無激素組織快繁方法，各階段采用不同的優(yōu)化培養(yǎng)基配方，使之在野生種源缺乏及繁殖率低的情況下能夠快速繁衍，使該物種的優(yōu)良性狀的保存能夠得到保障，同時(shí)避免了通過擬原球莖途徑造成的周期長的缺點(diǎn)，縮短離體培養(yǎng)時(shí)間及生產(chǎn)成本，提高生根率和幼苗移栽率，為鐵皮石斛的可持續(xù)利用奠定組培種苗繁育基礎(chǔ)。本發(fā)明的上述目的是用下述的技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的鐵皮石斛的無激素組培繁殖方法，包括蒴果消毒、原球莖誘導(dǎo)，分化并壯苗生根培養(yǎng)，試管苗移栽步驟，取鐵皮石斛的成熟蒴果進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)， 培養(yǎng)的溫度為20-23°C，濕度為30-45%，光照條件為自然光2000-2500LUX+人工輔助光 1500-2000LUX，光照時(shí)間為Uh/d ；所述的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+10%香蕉+10%馬鈴薯+蛋白胨1 %，分化培養(yǎng)基為&+10 %香蕉+10%馬鈴薯，壯苗生根培養(yǎng)基為1/2改良 MS+20%香蕉+活性炭0. 5% ；改良MS用KNO3減半，NH4NO3減半。所述的組培繁殖方法中，蒴果消毒先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用無菌水沖洗至無泡沫，然后采用75 %的酒精滅菌3min，無菌水沖洗3遍后再用0. 1 %升汞溶液進(jìn)行表面消毒10min-15min，分兩次進(jìn)行，第一次消毒5-8min，不斷震蕩后用無菌水清洗3_5遍， 再用0. 升汞消毒5-7min后用無菌水清洗3_5遍。所述的組培繁殖方法，移栽是生根組培苗在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)45天以后煉苗30天，再移栽于溫室大棚。所述的組培繁殖方法，移栽基質(zhì)為白水苔或鋸末、松樹皮，PH為5. 8。
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所述的組培繁殖方法，移栽在早上8-11點(diǎn)，溫度18-25°c下進(jìn)行。具體地，本發(fā)明的組培繁殖方法為選取鐵皮石斛成熟的蒴果，先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用無菌水沖洗至無泡沫，然后采用75%的酒精滅菌3min，無菌水沖洗3 遍后再用0. 升汞溶液進(jìn)行表面消毒10min-15min，分兩次進(jìn)行，第一次消毒5-8min，不斷震蕩后用無菌水清洗3-5遍，再用0. 升汞消毒5-7min后用無菌水清洗3_5遍。將蒴果置于消毒后的濾紙上，切去兩端后縱切，將種子撒播于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基即改良MS+10% 香蕉+10%馬鈴薯+蛋白胨中，pH為5. 8，改良MS用KNO3減半，NH4NO3減半，1.5個(gè)月后將長出的原球莖放入分化培養(yǎng)基即B5+10%香蕉+10%馬鈴薯中進(jìn)行苗分化，1. 5個(gè)月后將形成的小苗放入壯苗及生根培養(yǎng)基即1/2改良1/2改良MS+20 %香蕉+活性炭0. 5 %中，瓶內(nèi)培養(yǎng)45天生根后進(jìn)行組培苗煉苗30天，移栽于白水苔或鋸末、松樹皮、濕度40%-50%、 PH為5.8的基質(zhì)苗床上，空氣濕度為60% -80%，每天早晚各噴水一次。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的組培方法的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明方法在培養(yǎng)不同階段采用了不同配方的培養(yǎng)基，以適應(yīng)植物在不同時(shí)期對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，在原球莖誘導(dǎo)階段，加入了蛋白胨，有效的提高了種子的誘導(dǎo)率，在原球莖分化階段，采用了 &培養(yǎng)基，使得增值系數(shù)提高到10，從根本上解決了鐵皮石斛組織培養(yǎng)分化率低的問題。在生根過程中，添加了 0. 5%的活性炭，使得生根條數(shù)比無添加活性炭的增加一倍，且根系粗壯發(fā)達(dá)，提高了移栽成活率。建立了本發(fā)明的有效的工廠化鐵皮石斛組培快繁方法，解決了傳統(tǒng)種子繁殖困難，繁殖受阻的狀況。通過本發(fā)明組培快繁得到的幼苗，成苗容易，一致性強(qiáng)，生長健壯，葉色濃綠，很少病蟲害，易于管理。不受季節(jié)限制，任何時(shí)候都可以進(jìn)行組培?？梢员３治锓N特性，使該品種能夠延續(xù)和可持續(xù)利用。由于無激素添加，不存在誘變、污染等食品安全問題，節(jié)約了生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)過程中分化率高，繁殖速度快。通過本發(fā)明的組培快繁方法，繁育的鐵皮石斛在一月內(nèi)可增殖系數(shù)為10，平均生根率為98%，平均移栽成活率為95%，極大地提高了鐵皮石斛的繁殖系數(shù)，阻止了由于野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導(dǎo)致該物種滅絕的危險(xiǎn)，為該物種的保存和可持續(xù)利用提供了非常有效的繁殖方法。利用本發(fā)明的蒴果無菌種子繁殖方法，能解決一直以來使用蒴果繁育時(shí)遇到的原球莖分化率低，增殖率低，代數(shù)低，試管苗長勢弱的問題，使用本發(fā)明優(yōu)化的配方，生產(chǎn)的鐵皮石斛的藥用成分與野生相當(dāng)或略高于野生鐵皮石斛的有效成分，達(dá)到了高效快繁的目的。本發(fā)明通過不斷的探索實(shí)驗(yàn)，形成了一套專門的無激素鐵皮石斛組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)體系，克服了之前專利培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)過程繁瑣，無實(shí)際工廠化繁殖經(jīng)驗(yàn)，為大規(guī)模人工種植鐵皮石斛提供了保障，現(xiàn)階段已使用本發(fā)明工廠化生產(chǎn)鐵皮石斛瓶苗4年之久，生產(chǎn)過程中問題少，分化率高，繁殖速度快，繼代代數(shù)多，成分與野生鐵皮石斛相當(dāng)或略高于野生鐵皮石斛的有效成分含量，證明了該繁殖技術(shù)是目前為止適合工廠化生產(chǎn)的組培方法。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案和實(shí)施例
4的描述，也許同領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上還可以對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行一些修改和改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明主要技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的修改和改進(jìn)，均應(yīng)屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 以鐵皮石斛(Dendrobium officinale)的成熟蒴果為外植體探索原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基。先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用無菌水沖洗至無泡沫，然后采用75%的酒精滅菌3min，無菌水沖洗3遍后再用0. 1 %升汞溶液進(jìn)行表面消毒10min-15min，分兩次進(jìn)行，第一次消毒5-8min，不斷震蕩后用無菌水清洗3_5遍，再用0. 1 %升汞消毒5-7min后用無菌水清洗3-5遍。將蒴果置于消毒后的濾紙上，切去兩端后縱切，將種子撒播于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基即改良MS+10%香蕉+10%馬鈴薯+蛋白胨1 %中，pH為5. 8，改良MS用KNO3減半， NH4NO3減半。1. 5個(gè)月后將長出的原球莖放入分化培養(yǎng)基即B5+10%香蕉+10%馬鈴薯中進(jìn)行苗分化，1. 5個(gè)月后將形成的小苗放入壯苗及生根培養(yǎng)基即1/2改良1/2改良MS+20%香蕉+活性炭0. 5%中，瓶內(nèi)培養(yǎng)45天生根后進(jìn)行組培苗煉苗30天，移栽于白水苔或鋸末、松樹皮、濕度40% -50%, pH為5.8的基質(zhì)苗床上，大棚內(nèi)濕度為60% -80%，每天早晚各噴水一次。本發(fā)明方法在培養(yǎng)不同階段采用了不同配方的培養(yǎng)基，以適應(yīng)植物在不同時(shí)期對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，在原球莖誘導(dǎo)階段，加入了蛋白胨，有效的提高了種子的誘導(dǎo)率，在原球莖分化階段，采用了 &培養(yǎng)基，使得增值系數(shù)提高到10，從根本上解決了鐵皮石斛組織培養(yǎng)分化率低的問題。在生根過程中，添加了 0. 5%的活性炭，使得生根條數(shù)比無添加活性炭的增加一倍，且根系粗壯發(fā)達(dá)，提高了移栽成活率。本發(fā)明優(yōu)化的培養(yǎng)基配方不僅提高了分化系數(shù)而且促進(jìn)了生根，繼代30天后，每個(gè)芽生長葉片7-8片，株高3cm，大量須根白綠色。另外，溫度對叢芽的誘導(dǎo)和組培苗的生長和生根也起到了非常關(guān)鍵的作用，溫度在21-23°C，光照為自然光2000-2500LUX+人工輔助光1500-2000LUX，光照時(shí)間12h/d，有利于原球莖分化。在此條件下葉色濃綠，生長健壯，試管苗的增殖系數(shù)較高，平均生根率為98%，平均移栽成活率為95%，極大地提高了鐵皮石斛的繁殖系數(shù)。當(dāng)每株鐵皮石斛在瓶內(nèi)生根較密，根長為l_3cm時(shí)可作移栽準(zhǔn)備。首先將瓶蓋打開進(jìn)行煉苗，同時(shí)，在溫室準(zhǔn)備移栽準(zhǔn)備，移栽基質(zhì)為白水苔或鋸末松樹皮等，PH5.8。將移栽基質(zhì)裝入移栽盤內(nèi)，清水浸透，將煉苗30天后的組培苗移栽于溫室內(nèi)的移苗盤內(nèi)，移栽時(shí)間最好在早上8-11點(diǎn)進(jìn)行，溫度在18-25°C，覆薄膜并每天澆水1-2次，注意在早上8-10 點(diǎn)以前打開薄膜以通氣，濕度在50-60%之間。10天以后即可揭掉薄膜，進(jìn)行正常管理。通過上述本發(fā)明的組培快繁方法，繁育的鐵皮石斛在一月內(nèi)可增殖系數(shù)為10，平均生根率為98%，平均移栽成活率為95%，極大地提高了鐵皮石斛的繁殖系數(shù)，阻止了由于野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導(dǎo)致該物種滅絕的危險(xiǎn)，為該物種的保存和可持續(xù)利用提供了非常有效的繁殖方法。利用本發(fā)明的蒴果無菌種子繁殖方法，能解決一直以來使用蒴果繁育時(shí)遇到的原球莖分化率低，增殖率低，代數(shù)低，試管苗長勢弱的問題，使用本發(fā)明優(yōu)化的配方，生產(chǎn)的鐵皮石斛的藥用成分與野生相當(dāng)或略高于野生鐵皮石斛的有效成分，達(dá)到了高效快繁的目的。
本發(fā)明通過不斷的探索實(shí)驗(yàn)，形成了一套專門的無激素鐵皮石斛組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)體系，克服了之前專利培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)過程繁瑣，無實(shí)際工廠化繁殖經(jīng)驗(yàn)，為大規(guī)模人工種植鐵皮石斛提供了保障，現(xiàn)階段已使用本發(fā)明工廠化生產(chǎn)鐵皮石斛瓶苗4年之久，生產(chǎn)過程中問題少，分化率高，繁殖速度快，不添加任何激素，不存在誘變、污染等食品安全問題，生根苗健壯，移栽成活率高，藥用成分與野生鐵皮石斛相當(dāng)或略高于野生鐵皮石斛的有效成分含量，證明了該繁殖技術(shù)是目前為止適合工廠化生產(chǎn)的組培方法。
權(quán)利要求
1.鐵皮石斛的無激素組培繁殖方法，包括蒴果消毒、原球莖誘導(dǎo)，分化并壯苗生根培養(yǎng)，試管苗移栽步驟，其特征在于取鐵皮石斛的成熟蒴果進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度為20-23°C，濕度為30-45%，光照條件為自然光2000-2500LUX+人工輔助光1500-2000LUX，光照時(shí)間為Uh/d ；所述的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+10%香蕉+10% 馬鈴薯+蛋白胨1%，分化培養(yǎng)基為香蕉+10%馬鈴薯，壯苗生根培養(yǎng)基為1/2改良 MS+20%香蕉+活性炭0. 5% ；其中改良MS用KNO3減半，NH4NO3減半。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培繁殖方法，其特征在于所述蒴果消毒先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用無菌水沖洗至無泡沫，然后采用75%的酒精滅菌3min，無菌水沖洗3 遍后再用0. 升汞溶液進(jìn)行表面消毒10min-15min，分兩次進(jìn)行，第一次消毒5-8min，不斷震蕩后用無菌水清洗3-5遍，再用0. 升汞消毒5-7min后用無菌水清洗3_5遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培繁殖方法，其特征在于移栽是生根組培苗在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)45天以后煉苗30天，再移栽于溫室大棚。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述組培繁殖方法，其特征在于移栽基質(zhì)為白水苔或鋸末、松樹皮， pH 為 5. 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組培繁殖方法，其特征在于移栽在早上8-11點(diǎn)，溫度 18-25 °C下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1-5中的任意一項(xiàng)所述的組培繁殖方法，其特征在于所述蒴果消毒先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用無菌水沖洗至無泡沫，然后采用75%的酒精滅菌 3min，無菌水沖洗3遍后再用0. 1 %升汞溶液進(jìn)行表面消毒10min-15min，分兩次進(jìn)行，第一次消毒5-8min，不斷震蕩后用無菌水清洗3_5遍，再用0. 1 %升汞消毒5-7min后用無菌水清洗3-5遍。將蒴果置于消毒后的濾紙上，切去兩端后縱切，將種子均勻撒播于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基即改良MS+10%香蕉+10%馬鈴薯+蛋白胨中，pH為5. 8，改良MS用KNO3減半， NH4NO3減半；1. 5個(gè)月后將長出的原球莖放入分化培養(yǎng)基即B5+10%香蕉+10%馬鈴薯中進(jìn)行苗分化，1. 5個(gè)月后將形成的小苗放入壯苗及生根培養(yǎng)基即1/2改良1/2改良MS+20%香蕉+活性炭0. 5%中，瓶內(nèi)培養(yǎng)45天生根后進(jìn)行組培苗煉苗30天，移栽于白水苔或鋸末、松樹皮、濕度40% -50%, pH為5.8的基質(zhì)苗床上，大棚內(nèi)濕度為60% -80%，每天早晚各噴水一次。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鐵皮石斛無菌苗無激素培養(yǎng)及快速繁殖的方法。內(nèi)容包括，鐵皮石斛無菌種子萌發(fā)，原球莖的形成及分化，以及壯苗與生根的培養(yǎng)技術(shù)。選取成熟的蒴果，無菌播種到原球莖培養(yǎng)基，1.5個(gè)月后將長出的原球莖放入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行苗分化，1.5個(gè)月后將形成的1cm小苗放入壯苗及生根培養(yǎng)基中，2個(gè)月后可觀察到生長一致、株高約6-8cm的瓶苗，每顆瓶苗至少5條發(fā)達(dá)的根系。與傳統(tǒng)繁殖方式相比，本方法采用無激素培養(yǎng)，極大提高了種苗繁殖速度，苗生長健壯，假鱗莖明顯，發(fā)根多，移栽成活率高，生產(chǎn)成本低，不存在誘變、污染等食品安全問題，且繁殖速度快，生根苗健壯，移栽成活率高，達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平。
文檔編號A01H4/00GK102422811SQ201110293419
公開日2012年4月25日 申請日期2011年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月6日
發(fā)明者楊曉寅, 羅桂芬, 馬知遙 申請人:紅河州巨豐生物科技有限公司