專利名稱：利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法
利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法。
背景技術(shù)：
熊果苷是源于杜鵑花科熊果屬植物熊果葉的一種成份。研究表明熊果苷具有抑制酪氨酸酶活性、鎮(zhèn)咳、利尿、抗菌等生物活性。熊果苷能有效地與酪氨酸酶結(jié)合，使黑色素的合成減少，從而減少皮膚中色素沉積，是目前國內(nèi)外常用于美白化妝品中的主要原料，國內(nèi)外市場需求十分巨大。目前熊果苷的生產(chǎn)主要是通過化學(xué)合成，但是化學(xué)合成需要4 6 步反應(yīng)完成，合成成本高、污染大、副產(chǎn)物多。
生物轉(zhuǎn)化是指通過培養(yǎng)微生物、植物細(xì)胞、植物組織，利用其體內(nèi)的酶對外源底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價值產(chǎn)物的一種技術(shù)。該技術(shù)與化學(xué)合成相比，具有無毒、無污染、 低能耗、高效率、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、無污染并且轉(zhuǎn)化率高的利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
培養(yǎng)黃芩毛狀根，利用培養(yǎng)后的黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷。
所述培養(yǎng)黃芩毛狀根的培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基，該改良MS培養(yǎng)基包含大量元素、 微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，pH為5. 4 6. 0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述鐵鹽包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有機(jī)成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、 0. 5mg/L鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
上述改良MS培養(yǎng)基通過改變現(xiàn)有MS培養(yǎng)基(1962年由Murashige，T.和Skoo-ge， F. 二人設(shè)計的，故簡稱MS培養(yǎng)基。)的組成，更適合黃芩毛狀根的生長。
所述培養(yǎng)黃芩毛狀根的方法為
1)將黃芩毛狀根以4-5g/L接種于黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基中于100 150r/min下避光震蕩培養(yǎng)18 20天得黃芩毛狀根種子，培養(yǎng)的溫度25 ^°C，黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基為添加40-50g/L蔗糖的改良MS培養(yǎng)基；
2)將黃芩毛狀根種子以4-5g/L接種于培養(yǎng)基中于100 150r/min下避光震蕩培養(yǎng)20 30天，培養(yǎng)的溫度為25 ，培養(yǎng)基為添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養(yǎng)基。加入一定量的蔗糖、葡萄糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的作用在于促進(jìn)黃芩毛狀根快速生長，提高了黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化合成熊果苷的能力，有利于節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
所述轉(zhuǎn)化的時間為30 40h，轉(zhuǎn)化時的溫度為20 ^°C。
所述對苯二酚在加入前用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液進(jìn)行溶解，溶解比例為每 l-5mL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚。乙醇水溶液的作用在于降低加入對苯二酚的過程中黃芩毛狀根染菌的機(jī)率，避免黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚過程中染菌。
所述對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養(yǎng)液中加入15 25mg。當(dāng)每 IOOmL培養(yǎng)液的加入量超過25mg時，對苯二酚抑制黃芩毛狀根的生長。
與現(xiàn)有的熊果苷生產(chǎn)技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果
1.與化學(xué)合成法相比，本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡便，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50 60 %，具有低污染、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)；2.與從植物提取方法相比，熊果苷生產(chǎn)周期短，條件可控，不受季節(jié)限制；3.本發(fā)明利用黃芩毛狀根的糖苷轉(zhuǎn)化功能，可作為新產(chǎn)物的生物反應(yīng)器，為熊果苷的合成提供了一種新途徑，也為開發(fā)新型藥材提供了新途徑和新思路。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，所述實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
本發(fā)明公開了一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，通過預(yù)培養(yǎng)黃芩毛狀根，然后將一定量對苯二酚作為底物加入到黃芩毛狀根培養(yǎng)液中，利用黃芩毛狀根細(xì)胞內(nèi)的糖苷酶轉(zhuǎn)化對苯二酚生成熊果苷。
實(shí)施例1
1)將黃芩毛狀根以4g/L接種于黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基中J8°C，120r/min，避光培養(yǎng)18天；所述的黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基為添加50g/L蔗糖的改良MS培養(yǎng)基；
2)將經(jīng)過步驟1)培養(yǎng)18天的黃芩毛狀根，以5g/L接種到培養(yǎng)基中，28°C，150r/ min，避光培養(yǎng)28天；所述的培養(yǎng)基為添加50g/L蔗糖的改良MS培養(yǎng)基。
3)將對苯二酚溶于體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液中，溶解比例為每ImL乙醇水溶液溶解20mg，在無菌條件下加入到經(jīng)過步驟2、培養(yǎng)后的黃芩毛狀根培養(yǎng)液中，利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化40h，轉(zhuǎn)化時的溫度為25°C，轉(zhuǎn)化在避光條件下進(jìn)行；所述的對苯二酚的加入量為 20mg/IOOmL 培養(yǎng)液；
所述改良MS培養(yǎng)基采用以下配方
包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，pH為5. 4 6. 0 ；
所述的大量元素為KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；水解乳蛋白:500mg/L ；
微量元素為KI 0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；
鐵鹽為 Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；
有機(jī)成分為肌醇100mg/L、甘氨酸dmg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L 和煙酸0. 5mg/L ；
4) HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量為4. 42%，對苯二酚的轉(zhuǎn)化率為51. 6%。
實(shí)施例2
1)將黃芩毛狀根以5g/L接種于黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基中，28°C，100r/min，避光培養(yǎng)20天；所述的黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基為添加40g/L蔗糖的改良的MS培養(yǎng)基；
2)將經(jīng)過步驟1)培養(yǎng)20天的鮮嫩黃芩毛狀根種子以5g/L接種到培養(yǎng)基中， 28 0C，100r/min,避光培養(yǎng)20天；所述培養(yǎng)基為添加50g/L蔗糖和10g/L葡萄糖以及 0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養(yǎng)基；所述改良MS培養(yǎng)基采用如實(shí)施例1的配方；
3)將對苯二酚溶于體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液中，溶解比例為每2mL乙醇水溶液溶解20mg，在無菌條件下加入到經(jīng)過步驟2、培養(yǎng)后的黃芩毛狀根培養(yǎng)液中，利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化40h，轉(zhuǎn)化時的溫度為；轉(zhuǎn)化在避光條件下進(jìn)行，所述的對苯二酚的加入量為 20mg/IOOmL 培養(yǎng)液；
4)HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量為4. 71%，對苯二酚的轉(zhuǎn)化率為56. 13%。與實(shí)施例1相比，通過在毛狀根培養(yǎng)階段的的培養(yǎng)基中加入葡萄糖以及苯丙氨酸，提高了對苯二酚的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例3
培養(yǎng)黃芩毛狀根，利用培養(yǎng)后的黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷，所述轉(zhuǎn)化的時間為30h，轉(zhuǎn)化時的溫度為20°C，轉(zhuǎn)化在避光條件下進(jìn)行，所述對苯二酚在加入前用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液進(jìn)行溶解，溶解比例為每ImL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚，對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養(yǎng)液中加入15mg。
所述培養(yǎng)黃芩毛狀根的方法為
1)將黃芩毛狀根以5g/L接種于黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基中于150r/min下避光震蕩培養(yǎng)19天得黃芩毛狀根種子，培養(yǎng)的溫度25°C，黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基為添加40g/L蔗糖的改良MS培養(yǎng)基；
2)將黃芩毛狀根種子以4g/L接種于培養(yǎng)基中于120r/min下避光震蕩培養(yǎng)30天， 培養(yǎng)的溫度為25°C，培養(yǎng)基為添加30g/L葡萄糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養(yǎng)基。
上述改良MS培養(yǎng)基，包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，pH為5. 4 6.0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述鐵鹽包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有機(jī)成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、 0. 5mg/L鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量可達(dá)4 6%，對苯二酚的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50 60%。
實(shí)施例4
培養(yǎng)黃芩毛狀根，利用培養(yǎng)后的黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷，所述轉(zhuǎn)化的時間為35h，轉(zhuǎn)化時的溫度為22°C，轉(zhuǎn)化在避光條件下進(jìn)行，所述對苯二酚在加入前用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液進(jìn)行溶解，溶解比例為每5mL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚，對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養(yǎng)液中加入25mg。
所述培養(yǎng)黃芩毛狀根的方法為
1)將黃芩毛狀根以4g/L接種于黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基中于130r/min下避光震蕩培養(yǎng)19天得黃芩毛狀根種子，培養(yǎng)的溫度^rc,黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基為添加50g/L蔗糖的改良MS培養(yǎng)基；
2)將黃芩毛狀根種子以4g/L接種于培養(yǎng)基中于140r/min下避光震蕩培養(yǎng)對天， 培養(yǎng)的溫度為27°C，培養(yǎng)基為添加60g/L蔗糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養(yǎng)基。
上述改良MS培養(yǎng)基，包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，pH為5. 4 6.0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述鐵鹽包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有機(jī)成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、 0. 5mg/L鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量可達(dá)4 6%，對苯二酚的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50 60%。
HPLC測定黃芩毛狀根中熊果苷的方法收獲轉(zhuǎn)化后的毛狀根，80°C烘干，95% 乙醇，以1 100料液比，回流提取^!;HPLC法測定毛狀根中熊果苷含量的測定條件 waters-2487, Symmetry_C18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m),、流速 0. 8mL/min,、流云力才目V 甲醇V水= 15 85，檢測波長287nm。
本發(fā)明所述利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，該方法是通過培養(yǎng)黃芩毛狀根，利用黃芩毛狀根細(xì)胞內(nèi)的糖苷酶，轉(zhuǎn)化對苯二酚，生成熊果苷。轉(zhuǎn)化后的黃芩毛狀根中熊果苷的含量可達(dá)4 6%，對苯二酚的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50 60%。本發(fā)明具低污染、 副產(chǎn)物少等特點(diǎn)，為熊果苷生產(chǎn)提供了一種新技術(shù)、新途徑。
權(quán)利要求
1.一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于包括以下步驟 培養(yǎng)黃芩毛狀根，利用培養(yǎng)后的黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述培養(yǎng)黃芩毛狀根的培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基，該改良MS培養(yǎng)基包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)成分，pH為5. 4 6. 0 ；所述大量元素包含 950mg/L 的 ΚΝ03、42· 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 7H20,220mg/ L的CaCl2 · 2H20和500mg/L的水解乳蛋白；所述微量元素包含 0. 83mg/L 的 KI、6. 2mg/L 的 H3B03、22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4Η20、8· 6mg/ L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 禾口 0. 025mg/L 的 CoCl2 ；所述鐵鹽包含 18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；所述有機(jī)成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、0. 5mg/L 鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述培養(yǎng)黃芩毛狀根的方法為1)將黃芩毛狀根以4-5g/L接種于黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基中于100 150r/min下避光震蕩培養(yǎng)18 20天得黃芩毛狀根種子，培養(yǎng)的溫度25 ^°C，黃芩毛狀根種子培養(yǎng)基為添加40-50g/L蔗糖的改良MS培養(yǎng)基；2)將黃芩毛狀根種子以4-5g/L接種于培養(yǎng)基中于100 150r/min下避光震蕩培養(yǎng) 20 30天，培養(yǎng)的溫度為25 ^°C，培養(yǎng)基為添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和 0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化的時間為30 40h，轉(zhuǎn)化時的溫度為20 ^°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述對苯二酚在加入前用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液進(jìn)行溶解，溶解比例為每 l-5mL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養(yǎng)液中加入15 25mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用黃芩毛狀根轉(zhuǎn)化對苯二酚合成熊果苷的方法，該方法是通過培養(yǎng)黃芩毛狀根，利用黃芩毛狀根細(xì)胞，轉(zhuǎn)化對苯二酚，生成熊果苷。轉(zhuǎn)化后的黃芩毛狀根中熊果苷的含量可達(dá)4～6％，對苯二酚的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50～60％。本發(fā)明具低污染、副產(chǎn)物少等特點(diǎn)，為熊果苷生產(chǎn)提供了一種新技術(shù)、新途徑。
文檔編號A01H4/00GK102505031SQ20111030040
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者彭飛宇, 施春陽, 錢衛(wèi)東, 齊香君 申請人:陜西科技大學(xué)