專利名稱：OsPP18基因在控制水稻抗旱性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗(yàn)證得到一種能夠提高干旱耐受能力的水稻OsPPlS基因在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用候選基因篩選方法，克隆到控制水稻抗旱基因0SPP18，通過共分離檢測(cè)表明0SPP18突變體與干旱敏感表型是緊密關(guān)聯(lián)的，超量表達(dá)OsPPlS基因，可以提高轉(zhuǎn)基因水稻抗干旱的能力，證實(shí)了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過程中會(huì)受到諸多環(huán)境因素的影響，干旱、冷害和高溫會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。培育耐逆性的作物品種一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。為了抵抗或適應(yīng)這些不利的因素，植物體感受細(xì)胞外環(huán)境條件的變化并通過多種途徑將其傳遞到細(xì)胞內(nèi)，會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)一些應(yīng)答基因，產(chǎn)生一些使細(xì)胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，從而對(duì)外界的變化做出相應(yīng)的反應(yīng)(Xiong等，Cell signaling during cold,drought and salt stress. Plant Cell. 14 (suppl), S165-S183, 2002)。而那些功能基因?qū)Νh(huán)境做出反應(yīng)的過程中能否正確表達(dá)受到了調(diào)控因子的精細(xì)調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子作為一種調(diào)控基因，當(dāng)生物體感受逆境脅迫時(shí)，能調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物體對(duì)逆境的耐受能力，達(dá)到抵 抗不良環(huán)境條件脅迫的效果。大多數(shù)類型的轉(zhuǎn)錄因子都參與了植物的非生物逆境應(yīng)答反應(yīng)，包括 AP2/EREBP，bZip、HD-ZIP、MYB、MYC、NAC 和 Zinc finger 類轉(zhuǎn)錄因子(Yamaguch1-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcript ional regulatory networksin cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annu RevPlant Biol, 2006, 57 :781-803) 0通過基因工程，部分逆境應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)成功應(yīng)用于水稻抗逆遺傳育種。利用SNACl培育的轉(zhuǎn)基因水稻植株在大田干旱環(huán)境下能提高結(jié)實(shí)率30%左右，而在正常條件下產(chǎn)量不受影響且沒有其他表型變化。轉(zhuǎn)基因植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期對(duì)干旱和高鹽的抗性也顯著提高(Hu等· Overexpressing a NAM, ATAF, and QJC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 :12987-12992)。這些抗逆轉(zhuǎn)錄因子是通過調(diào)控大量下游基因的表達(dá)來體現(xiàn)其功能。這些下游基因中往往含有參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的調(diào)控蛋白，它們又進(jìn)一步形成次級(jí)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些下游基因同樣可以用于作物抗逆境的遺傳改良。擬南芥中抗高溫轉(zhuǎn)錄因子DREB2A的下游基因HsfA3同樣可以提高轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株對(duì)高溫的抗性(Yoshida 等· Functional analysis of an Arabidopsis heat-shocktranscription factor HsfA3in the transcriptional cascade downstream of theDREB2A stress-regulatory system. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 368 :515-21)。植物對(duì)外界環(huán)境做出及時(shí)而精確的反應(yīng)，除了相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，還有很多其他調(diào)控因子參與了逆境信號(hào)的感知與傳遞。蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)可逆磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)生的重要事件之一。在磷酸化作用中，蛋白激酶在底物上加上一個(gè)磷酸基團(tuán)；而蛋白磷酸酶通過去除底物的磷酸基團(tuán)行使相反的功能。在一個(gè)酶上添加或去除一個(gè)磷酸基團(tuán)一般會(huì)導(dǎo)致酶的激活或失活，正是通過這樣的方式，蛋白激酶和蛋白磷酸酶在酶的活性調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，進(jìn)而調(diào)控著酶參與的生物學(xué)過程。蛋白磷酸酶2C是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，作為蛋白激酶的中和物，它們?cè)谀婢澈桶l(fā)育相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用(Rodriguez. Protein phosphatase 2C (PP2C) function in higherplants. Plant Mol Biol，1998，38 :919-27)。水稻蛋白磷酸酶2C家族共有90個(gè)成員，目前尚沒有與非生物逆境應(yīng)答相關(guān)的水稻蛋白磷酸酶2C被報(bào)道，本發(fā)明涉及的OsPPlS基因是SNACl下游基因之一。水稻是重要的糧食作物和模式植物，在極端氣候條件頻發(fā)的今天，培育抗逆性增強(qiáng)的水稻具有重要的意義。鑒于0SPP16基因是抗旱轉(zhuǎn)錄因子SNACl的下游基因，是否能提聞水稻的抗逆性目如尚無相關(guān)報(bào)道。因此，從水稻中分尚出0sPP18基因，并鑒定它在提聞水稻抗逆性方面所發(fā)揮的功能，對(duì)于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及一個(gè)蛋白磷酸酶2C家族成員0sPP18基因在控制水稻抗旱性改良中的應(yīng)用。在SNACl超表達(dá)植株上升表達(dá)的基因中挑選候選基因，因?yàn)槠鋵儆诘鞍琢姿崦?C家族，申請(qǐng)人將該基因命名為0sPP18。本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含0sPP18基因的DNA片段，該片段賦予水稻在干旱條件下抗旱性增強(qiáng)的能力。其中，所述的含有OsPPlS基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列長(zhǎng)度為1162bp，它對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQID NO :1所不,其對(duì)應(yīng)的氣基酸序列為348個(gè)。它的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID N0:2所不。攜帶有本發(fā)明0sPP18基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化,微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998,Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411—463 ；Geiserson andCorey, 1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

可使用包括本發(fā)明的OsPPlS基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗旱植物品種。本發(fā)明基因是受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的干旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子結(jié)合后連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在干旱條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提高植物抗旱性。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離克隆的包含有0sPP18基因的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1162bp，從38-1084位是它的編碼區(qū)，編碼348個(gè)氨基酸。序列表SEQ ID NO :2是0sPP18基因的蛋白質(zhì)的序列。圖1 :是osppl8突變體中0sPP18基因的表達(dá)情況。途中WT為轉(zhuǎn)基因家系分離出的陰性對(duì)照，osppl8為0sPP18T-DNA插入突變體。圖2 :是OsPPlS基因在多種逆境和激素處理下的表達(dá)情況。各處理樣品為干旱(drought)處理 0d, 3d, 5d, 7d,復(fù)水 Id ;高鹽(salt)處理 Oh, lh, 3h, 6h, 12h, 24h ;低溫(cold)處理 Oh, lh, 3h, 6h, 12h, 24h ;高溫(heat)處理 Omin, IOmin, 30min, lh, 3h, 6h ;氧化脅迫(H2O2)處理 Oh，lh，3h，6h，12h ;紫外線(UV)處理 0h，3h，6h，12h ;傷害(wound)處理 0h，lh, 3h, 6h ;淹水脅迫(submerge)處理Oh, 6h, 12h, 24h, 72h。激素處理脫落酸(ΑΒΑ),茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)處理011，111，311，611，1211。圖3 :是水稻osppl8突變體苗期干旱脅迫表型和osppl8突變體苗期干旱脅迫后存活率的統(tǒng)計(jì)。圖中A為水稻osppl8突變體苗期干旱脅迫表型。osppl8#l，#2，#3為3個(gè)0sPP18T-DNA插入突變體純合家系。WT#1，#2，#3為雜合突變體分離出的3個(gè)陰性家系。B為水稻osppl8突變體苗期干旱脅迫后存活率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。osppl8#l，#2，#3為3個(gè)0sPP18突變體純合家系。WT#1，#2，#3為雜合突變體分離出的3個(gè)陰性家系。圖4 :是水稻osppl8突變體成株期大田干旱脅迫表型、osppl8突變體成株期大田干旱脅迫后生物量統(tǒng)計(jì)結(jié)果、ospplS突變體成株期大田干旱脅迫后株高統(tǒng)計(jì)結(jié)果及osppl8突變體成株期大田干旱脅迫后相對(duì)結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖中A為水稻osppl8突變體成株期大田干旱脅迫表型。osppl8為純合突變體，WT為分離出的陰性家系。B為水稻osppl8突變體成株期大田干旱脅迫后生物量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。ospplS為純合突變體，WT為分離出的陰性家系。C為水稻osppl8突變體成株期大田干旱脅迫后株高統(tǒng)計(jì)結(jié)果。osppl8為純合突變體，WT為分離出的陰性家系。D為水稻osppl8突變體成株期大田干旱脅迫后相對(duì)結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。osppl8為純合突變體，WT為分離出的陰性家系。圖5 :是水稻osppl8突變體滲透脅迫表型和osppl8突變體滲透脅迫后株高的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖中A為水稻osppl8突變體滲透脅迫表型。osppl8為純合突變體，WT為分離出的陰性家系。B為水稻osppl8突變體滲透脅迫后株高的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。osppl8為純合突變體，WT為分離出的陰性家系。圖6 0sPP18 超表達(dá)載體構(gòu)建示意圖、0sPP18超表達(dá)植株中0sPP18基因的表達(dá)情況、0sPP18超表達(dá)植株滲透脅迫表型及0sPP18超表達(dá)植株滲透脅迫后株高的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖中A為0sPP18超表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。B為0sPP18超表達(dá)植株中0sPP18基因的表達(dá)情況。中花11 (ZHll)為野生型家系。C為0sPP18超表達(dá)植株滲透脅迫表型。0sPP18-0X_4，-7為2個(gè)獨(dú)立超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因Tl代家系，中花11 (ZHll)為野生型家系。D為0sPP18超表達(dá)植株滲透脅迫后株高的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。0sPP18-0X-4，-7為2個(gè)獨(dú)立超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因Tl代家系，中花Il(ZHll)為野生型家系。圖7 :是pCAMBIA1301載體的質(zhì)粒圖譜。圖8 :是pU1301載體及0sPP18超表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離0sPP18T_DNA插入突變體，克隆包含有OsPPlS基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗(yàn)證OsPPlS基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。1、分離 0sPP18T_DNA 突變體從水稻突變體庫Rice T-DNA Insertion Seqence Database (RISD)(本發(fā)明的起始材料即突變體 2D-21407,檢索地址http://signal, salk. edu/cg1-bin/RiceGE,韓國(guó)植物功能基因組實(shí)驗(yàn)室(Plant Functional Genomics Laboratory)管理)中挑取0sPP18基因位點(diǎn)相應(yīng)的T-DNA插入突變體2D-21407。產(chǎn)生這個(gè)突變體株系的載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化方法可參照相關(guān)文獻(xiàn)(Jeong等· Generation of a flanking sequence-tag database foractivation-tagging lines in japonica rice. Plant J. 2006,45 :123-32.),限于篇幅本說明書不再展開描述。其中在上述網(wǎng)站突變體庫中所登錄的0sPP18T-DNA突變體2D-21407的側(cè)翼序列(該序列長(zhǎng)度為480bp)如下所示GNNATNCCCCAGTTGTCATGTATTAGCCACATAGCAAAAAAAATAGCACCGTGGTAGTAAGAATGGAACTCACCTGGTACCTGGTACCTCGGATCCGTGTTTTCGTGTTAGGGGGAAGATCCAAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGAAGGATGACAAGTTTTTCATGGCGCGGTCAGGGGCTTTGTGCTTGATTTGATTGGCGGCTAACTATCGAGTAGTGATTCTTGAATCAGAGGCTAGGACATGAGGTTTCAGTGGCGGATTTTGAATTAGATCTGCCCGATTTTGCTCTGAATTAGCTTAGCCTAATCGGGTTCCAGCTCCTGGCTGGTGTGAGGATGTGGCCATGATTTTGAATTTGAGGAGTGTTTGAAAACNAAAAGTCTAATCCTTTGTAAGGGCATATGGTANAGGAATTAACCTTTTTCTTGTTTGATGTGTCTGTGTGNANCANCTGATTTTTATGGANTGTTNTTANTT根據(jù)T-DNA插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，對(duì)突變體中OsPPlS基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。用引物(0sPP18-F :5，-CACAAACCCGACCAGTCAGA-3，和 0sPP18_R :5，-CGTCCCAGCCCACATCA-3，)對(duì)OsPP18基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增。同時(shí)用引物(AF :5’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR :5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)對(duì)水稻Actinl基因做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)76bp)，以作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分析。表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，在osppl8T-DNA插入純合突變體中，0sPP18基因的表達(dá)顯著低于分離出的陰性對(duì)照(圖1)。即osppl8突變體中0sPP18基因被顯著抑制。2、檢測(cè)水稻內(nèi)源0sPP18基因的表達(dá)水平申請(qǐng)人:選用粳稻品種“中花11號(hào)”(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所培育的一個(gè)公開推廣應(yīng)用的水稻品 種)作為表達(dá)譜分析的材料。生長(zhǎng)至4葉期幼苗進(jìn)行各種逆境和激素的處理。干旱處理是不澆水讓其自然干燥，0d, 3d，5d，7d及復(fù)水Id后取樣；高鹽脅迫是將幼苗根部浸泡在200mM NaCl的溶液，Oh, lh, 3h，6h，12h，24h后取樣；低溫脅迫是將幼苗放入4°C人工氣候室，0h，lh，3h，6h，12h，24h后取樣。高溫脅迫是將幼苗放入42°C人工氣候室，Omin，I Omin, 30min, lh, 3h，6h后取樣。紫外線處理是將幼苗置于紫外燈下，0h，3h,6h, 12h后取樣。傷害處理是用鑷子對(duì)幼苗進(jìn)行機(jī)械損傷,Oh, lh, 3h, 6h后取樣。氧化脅迫是將幼苗根部浸泡在1%11202溶液中，011，111，311，611，1211后取樣。淹水脅迫是將幼苗置于裝滿水的四面透光容器內(nèi)，011，611，1211，2411，7211后取樣。激素處理是用ΙΟΟμΜ的脫落酸(ABA)，茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)分別均勻的噴灑水稻植株表面后并加到幼苗根部，011，111，311，611，1211后取樣?？俁NA的提取采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSIII (購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為65°C 5min,50°C 120min,70°C IOmin0以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(OsPP18-F :5，-CACAAACCCGACCAGTCAGA-3’ 和 OsPP18-R :5，-CGTCCCAGCCCACATCA-3，)對(duì)OsPP18基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增。同時(shí)用引物(AF :5’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR :5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)對(duì)水稻Actinl基因做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)76bp)，以作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分析。結(jié)果表明，OsPP18基因(SEQ NO 1)在干旱，高鹽，低溫，高溫，紫外線和氧化脅迫后誘導(dǎo)上升表達(dá)。OsPPlS基因受茉莉酸和水楊酸的快速誘導(dǎo)，不受ABA的誘導(dǎo)(圖2)。3、鑒定ospp 18突變體干旱脅迫表型將已鑒定好基因型的純合突變體(osppl8)和野生型家系(WT)催芽后直播到小圓桶中。試驗(yàn)用的土壤為中國(guó)南方水稻土與粗沙按體積比為2 3混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水，水自行滲漏確保土壤的緊實(shí)度一致，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。對(duì)健康生長(zhǎng)的4葉期的植株進(jìn)行斷水干旱脅迫6-10天(具體根據(jù)天氣情況而定)，然后復(fù)水恢復(fù)5-7天，拍照并調(diào)查植株的存活率。與野生型對(duì)照相比，T-DNA純合植株表現(xiàn)為干旱敏感表型，為了驗(yàn)證該突變體與干旱表型共分離情況，將Tl代雜合單株收獲的種子播種得到T2代純合和陰性種子繁殖成家系。隨機(jī)選取3個(gè)純合突變體家系(osppl8#l，#2，#3)和3個(gè)分離出的野生型家系(WT#1，#2, #3)，同樣進(jìn)行上述脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果純合突變體較陰性對(duì)照對(duì)干旱敏感(圖3中A)。復(fù)水后，純合家系存活率低于25%，而野生型家系仍有40%以上的存活率(圖3中B)。該試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果一致。說明該突變表型確實(shí)是T-DNA插入造成的。為了鑒定突變體成株期的表型將突變體及其對(duì)照種植于上面有可移動(dòng)遮雨棚的沙土大田中南方水稻土與粗沙按體積比為1: 2混合而成，每行10株每家系種植2行，試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)做嚴(yán)重干旱脅迫實(shí)驗(yàn)。干旱脅迫是對(duì)健康生長(zhǎng)的成株期植株進(jìn)行斷水15-20天(具體根據(jù)天氣情況而定，雨天有可移動(dòng)遮雨棚覆蓋)，再復(fù)水生長(zhǎng)。與雜合家系分離出的陰型對(duì)照相比，純合突變體植株生長(zhǎng)明顯受到抑制表現(xiàn)為干旱敏感表型(圖4中A)，對(duì)株高，生物量和結(jié)實(shí)率等性狀進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)成株期突變體干旱脅迫條件下地上部分生物量(圖4中B)和株高(圖4中C)顯著低于對(duì)照。因?yàn)樵谡ＩL(zhǎng)條件下，突變體植株與對(duì)照的結(jié)實(shí)率不一致，用相對(duì)結(jié)實(shí)率(干旱脅迫下植株的結(jié)實(shí)率除以正常條件下生長(zhǎng)植株的結(jié)實(shí)率)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示突變體相對(duì)結(jié)實(shí)率顯著低于對(duì)照(圖4中D)。為了鑒定突變體對(duì)滲透脅迫的表型，將突變體及其對(duì)照發(fā)芽后，置于含有IOOmM甘露醇(形成高滲透環(huán)境，模擬滲透脅迫)的1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，結(jié)果突變體的長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于對(duì)照(圖5中A)。對(duì)株高進(jìn)行測(cè)量，突變體的株高顯著低于對(duì)照(圖5中B)。4、0sPP18基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好的分析OsPPlS基因的功能，申請(qǐng)人將其在水稻中超量表達(dá)。從轉(zhuǎn)基因植株的表型研究該基因的功能。超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下:首先通過查找在水稻基因組注釋網(wǎng)站RGAP(http://rice, plantbiology. msu. edu/) 0sPP18 基因注釋號(hào)L0C 0s02g05630,與 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc. go.1p/cDNA/) 0sPP18 灃釋號(hào)AK066016,預(yù)測(cè)為一個(gè) PP2C 家族某閔,以此為參考設(shè)計(jì)引物。以水稻品種“中旱5號(hào)”(由中國(guó)上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的商業(yè)品種)的愈傷總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，用引物0SPP18FLF(5’ -ATCGGTACCCTCCTCCATCCATTCCC-3’，序列特異引物外加接頭 KpnI 位點(diǎn))和 0SPP18FLR(5’ -ATCGGTACCGGTGCCGCCACTGTAA-3’，序列特異引物外加接頭KpnI位點(diǎn))，擴(kuò)增出包含0sPP18基因完整編碼區(qū)的cDNA片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物就是本發(fā)明SEQ ID NO :所示的序列(l-1162bp)。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 70sec,32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測(cè)序，獲得所需的全長(zhǎng)基因。將該克隆命名為PGEM-0sPP18。陽性克隆PGEM_0sPP18質(zhì)粒用KpnI酶切，回收外源片段；同時(shí)，用同樣的方法酶切攜帶ubiquitin啟動(dòng)子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301 (pU1301是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(圖7)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體，圖譜見圖8)，酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比24 I)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含OsPPlS基因的酶切片段和酶切的PU1301載體做連接反應(yīng)，其后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOii (該大腸桿菌DHlOii菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為0sPP18-0X-pU1301 (載體上的0sPP18基因序列就是SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1162bp，見圖6A)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(其具體步驟如下所述)將上述超表達(dá)載體0sPP18-0X-pU1301轉(zhuǎn)入到水稻品種“中花11” (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所培育的一個(gè)公開使用的水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花11)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在 Hiei 等人 艮道的方法(Hiei 等，Efficient transformation of rice, Oryzasativa L. ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA, Plant J,6 :271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進(jìn)行。本實(shí)施例的具體遺傳轉(zhuǎn) 化步驟如下(I)電轉(zhuǎn)化將最終超表達(dá)目標(biāo)載體0sPP18-0X_pU1301(質(zhì)粒圖譜見圖8)，用1800v電壓，電轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105菌株，涂到帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的常用的LA培養(yǎng)基上，篩選出陽性克隆，用于下述轉(zhuǎn)化愈傷。(2)愈傷組織誘導(dǎo)將成熟的水稻種子中花11去殼，然后依次用70%的乙醇處理I分鐘，O. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將該消過毒的種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見后)；將接種后的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成分見后)置于黑暗處培養(yǎng)4周,溫度25± 1°C。(3)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，培養(yǎng)溫度25 ± I °C。(4)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，培養(yǎng)溫度25± 1°C。(5)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上(成分見后)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(來源于澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室商用菌株，攜帶有本發(fā)明的超表達(dá)載體0sPP18-0X-pU1301)兩天，培養(yǎng)溫度28°C ;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(成分見后)里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。(6)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D6000. 8-1. O ;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基(成分見后)上培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度19-20°C。(7)愈傷洗漆和選擇培養(yǎng)滅菌水洗漆愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400ppm，第二次及以后為250ppm,潮霉素濃度為250ppm)。(8)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7周 ’轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上(成分見后)，光照下培養(yǎng)，溫度26°C。(9)生根剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。(10)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。培養(yǎng)基組分及其配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表不如下6_BA (6-Benzy IaminoPur ine, 6-節(jié)基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧節(jié)青霉素)；KT(Kinetin,激動(dòng)素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid, Π引哚乙酸)；2,4_D(2,4_Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH (Casein EnzymaticHydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制
硝酸鉀(KNO3)28. 3 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0 g
硫酸銨((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)1.85 g
氯化鈣(CaCl2 · 2H20)1.66 g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制
碘化鉀(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0. 16 g
硫酸錳(MnSO4 · 4H20)O. 44 g
硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)O. 15 g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinic acid)0.1 g
維生素 BI (Thiamine HCl)0.1 g
維生素 B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)O. 2 g
肌醇(Inositol)10 g加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸銨(NH4NO3)16. 5 g
硝酸鉀19. O g
磷酸二氫鉀1. 7 g
硫酸鎂3. 7 g
氯化鈣4. 4 g室溫下溶解并定容至1000ml。

6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0.083 g
硼酸O. 62 g
硫酸錳O. 86 g
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)O. 025 g
硫酸銅(CuSO4 · 5H20)O. 0025 g室溫下溶解并定容至1000ml。7) 2，4-D貯存液，6-BA貯存液，萘乙酸(NAA)貯存液，吲哚乙酸(IAA)貯存液I均為 mg/ml ο8)葡萄糖貯存液0. 5g/ml。9) AS 貯存液的配制秤取 AS O. 392g，DMSO 10ml。(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10 ml
維生素貯存液(100X)10 ml2, 4-D 貯存液2. 5 ml
脯氨酸(Proline)0. 3 g
CH0.6 g
鹿糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6raix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA C存液(100X)10 ml
維生素貯存液(100X)10 ml
2, 4-D 貯存液2. O ml
脯氨酸O. 5 g CHO. 6 g
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12. 5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2, 4-D 貯存液O. 75 ml
CHO. 15 g
蔗糖5 g
瓊脂粉(Agarose)1. 75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1. 25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2, 4-D 貯存液O. 75 ml
CHO. 2 g
蔗糖5 g
瓊脂粉1. 75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA Jt存液(100X)0.5 ml
維生素貯存液(100X)I ml
2，4-D 貯存液O. 2 ml
CHO. 08 g
蔗糖2 g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)IOOml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 μ I AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基
N6raax 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2，4-D 貯存液O. 625 ml
CHO. 15 g
蔗糖7. 5 g
瓊脂粉1. 75 g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ IHN和400ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6raax 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml Fe2+EDTA Jt存液(100X) 2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
6-BA貯存液0. 5 ml
KT貯存液0. 5 ml
NAA It存液50 μ
IM It存液50 μ
CH0. 15 g
蔗糖7. 5 g
瓊脂粉1. 75 g
加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ I HN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )。8)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA Jt存液(100X)10 ml
維生素貯存液(100X)10 ml
6-BA貯存液2 ml
KT貯存液2 ml
NAA貯存液O. 2 ml
IAA It存液0_ 2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基
MSraax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)5 ml
維生素貯存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。5、0sPP18超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因T1代家系滲透脅迫下的生長(zhǎng)狀況本發(fā)明采用熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量的方法對(duì)部分轉(zhuǎn)基因水稻植株中OsPPlS基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR的具體步驟同實(shí)施例2 (圖6B為表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果)，結(jié)果顯示，獲得了 OsPPlS基因的表達(dá)量相對(duì)于野生型顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。本實(shí)施例選取了轉(zhuǎn)0sPP18基因(序列見序列表SEQ NO 1)的超量表達(dá)的2個(gè)T1家系(編號(hào)為0sPP18-0X-4，0sPP18-0X-7)進(jìn)行了滲透脅迫實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下將超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系(0sPP18-0X-4，0sPP18-0X-7)種子去殼消毒(用濃度為70%的酒精處理lmin，再用O. 15%氯化汞處理lOmin，無菌水清洗數(shù)次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，中花11 (ZHll)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，2-3天后挑選發(fā)芽好且長(zhǎng)勢(shì)一致的種子轉(zhuǎn)移到含有或不含150mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)。10天后拍照并調(diào)查植株的株高(見圖6中C)。因?yàn)樵诓缓事洞寂囵B(yǎng)基(圖6中C上部)上超量表達(dá)植株與對(duì)照的長(zhǎng)勢(shì)不一致，用相對(duì)株高(甘露醇培養(yǎng)基(圖6中C下部)上生長(zhǎng)植株的株高除以正常培養(yǎng) 基(圖6中C上部)上生長(zhǎng)植株的株高)進(jìn)行比較。超量表達(dá)植株的相對(duì)株高顯著高于野生型(見圖6中D)，該試驗(yàn)每個(gè)家系設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果一致。說明超表達(dá)0sPP18基因的確具有提聞轉(zhuǎn)基因植株抗干旱的能力。
權(quán)利要求
1.一種控制水稻抗旱性的基因OsPPlS在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.一種控制水稻抗旱性的基因OsPPlS在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗(yàn)證得到一種能夠提高干旱耐受能力的水稻OsPP18基因在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，克隆到控制水稻抗旱基因OsPP18，通過表達(dá)量檢測(cè)和干旱脅迫表型鑒定表明該突變體與干旱敏感表型是共分離的。超量表達(dá)OsPP18基因能提高轉(zhuǎn)基因水稻抗干旱的能力，證實(shí)了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103060285SQ20111032166
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者熊立仲, 游均 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)