專利名稱：一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種苦蕎麥組培苗的快速繁殖方法，特別是涉及一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
蕎麥?zhǔn)且环N藥食同源的植物，有苦蕎和甜蕎兩種。由于苦蕎其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類物質(zhì)，因而被譽(yù)為“降血糖、降血壓、降血脂”的三降食品。 隨著其營養(yǎng)價值和藥用價值的不斷發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥植物資源越來越受到人們的青睞。由于苦蕎麥植物自花授粉的特點(diǎn)使其在生產(chǎn)育種上人工雜交難以成功，因此目前苦蕎麥在育種方面仍未獲得重大突破。
組織培養(yǎng)可在一定程度上解決苦養(yǎng)麥在育種上所遇到的一些問題。目前已有利用蕎麥的胚軸、子葉、原生質(zhì)體為外植體的植株再生研究，但采用以苦蕎麥葉柄為外植體進(jìn)行的植株再生研究還未見有任何的報(bào)道。
目前以蕎麥葉柄為外植體的組織培養(yǎng)研究只進(jìn)行到愈傷組織階段，如于寒松等人的論文《利用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法提高蕎麥中總黃酮含量的研究》和王愛國等人的論文《普通蕎麥愈傷組織誘導(dǎo)及其分化的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究》。在王愛國等人的論文研究中，還檢測了蕎麥植物葉柄以及由蕎麥葉柄形成的愈傷組織中各自含有的總黃酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕎麥葉柄中的總黃酮含量為18. 97mg/g(高于蕎麥的其它部位)，而由蕎麥葉柄形成的愈傷組織中的總黃酮含量為58. 80mg/g，總黃酮含量共增加了 2. 1倍。
綜上所述，苦蕎麥植物由于人工雜交難以成功，因此不易選育出優(yōu)良品種。而以蕎麥的胚軸、子葉、原生質(zhì)體為外植體進(jìn)行植株再生研究，雖然可解決苦養(yǎng)麥在育種上的一些問題，但由于胚軸、子葉、原生質(zhì)體為幼嫩體，其總黃酮含量及其它次生代謝物含量均低于葉柄，因此用胚軸、子葉、原生質(zhì)體培養(yǎng)出的再生植株的品種不及用葉柄培養(yǎng)出的再生植株的品種優(yōu)良。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，該方法可實(shí)現(xiàn)苦蕎麥植物優(yōu)良品種的選育和快速繁殖。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案由如下步驟構(gòu)成
(1)外植體的處理選取生長健康和無病蟲害的苦蕎葉，切去葉片部分，將葉柄用濃度為0. 的升汞消毒2 6分鐘，再用無菌水清洗3 4次；
(2)愈傷組織誘導(dǎo)將消毒后的葉柄外植體上的水分吸干，再切成0. 7cm 1. 5cm 的長度，然后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 0. 1 2. 0mg/L+2,4-D 1 6mg/L+IAA 0 lmg/L中進(jìn)行培養(yǎng)；
(3)芽分化培養(yǎng)選取質(zhì)地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，將其切成0. 5 1. Ocm2的塊狀后，接入芽分化培養(yǎng)基MS+6-BA 1. 0 4. 0mg/L+NAA0. 1 lmg/L+KT 0 1. 5mg/L中進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)生根培養(yǎng)當(dāng)不定芽長至2.0 4. Ocm時，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA 0 2. Omg/L上進(jìn)行生根培養(yǎng)；
(5)煉苗和移栽當(dāng)組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，先在室內(nèi)煉苗2 4天， 再將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的土壤中生長；
上述所有培養(yǎng)基的pH值為5. 5 6. 7、蔗糖15 50g .L-1、瓊脂6. O 7. Og .L—1 ；
上述光照培養(yǎng)條件均為每天光照8 16小時、光照強(qiáng)度為1500 25001x、培養(yǎng)溫度 20 27°C。
上述步驟(1)中苦蕎葉應(yīng)在晴天選取且葉齡為3 40天。
上述步驟O)中消毒后的葉柄外植體在切成0. 7cm 1. 5cm的長度前，應(yīng)先切去葉柄兩端少量的游離末端，使切口保持新鮮。
上述步驟( 中葉柄外植體接入培養(yǎng)基的方式為正接(形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基)、 反接(形態(tài)學(xué)上端插入培養(yǎng)基)或平放(不插入培養(yǎng)基即平放在培養(yǎng)基表面)。
上述步驟(5)中將組培苗移栽至松軟的土壤中生長時應(yīng)適當(dāng)遮光，溫度保持在 20 27°C，相對濕度在70 80%。
本發(fā)明以苦養(yǎng)麥葉柄為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和移栽，可快速繁殖品種優(yōu)良的苦蕎麥再生植株，為苦蕎麥植物優(yōu)良品種的選育和快速繁殖提供了一條新途徑。另外本發(fā)明所用葉柄來源豐富，取材容易，可充分利用資源。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(1)外植體的處理選取生長健康、無病蟲害、葉齡在15天左右的苦蕎葉，切去葉片部分，將葉柄放在超凈工作臺上用濃度為0. 的升汞消毒4分鐘，再用無菌水清洗4 次；
(2)愈傷組織誘導(dǎo)將消毒后的葉柄外植體上的水分吸干，并切去其兩端少量的游離末端，再沿45°方向?qū)⑷~柄斜切成Icm的長度，然后采用正接(形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基)的接種方式，將其接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 0. 5mg/L+2,4-D 4mg/L+IAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 8g/L中進(jìn)行培養(yǎng)，葉柄在接入培養(yǎng)基后第3天開始出現(xiàn)膨大， 并在隨后的培養(yǎng)過程中，可觀察到葉柄膨大處開始長出質(zhì)地較緊密的愈傷組織，在培養(yǎng)20 天后統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率為100% ；
(3)芽分化培養(yǎng)選取質(zhì)地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，將其切成0. Scm2的塊狀后，接入芽分化培養(yǎng)基MS+6-BA 2. Omg/L+NAAO. lmg/L+KT lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6. 8g/L中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)其不定芽誘導(dǎo)率為34. 45% ；
(4)生根培養(yǎng)當(dāng)不定芽長至3. Ocm左右時，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA 0. 5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂6. 8g/L上進(jìn)行生根培養(yǎng)，在培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)其生根率為 85. 0% ；
(5)煉苗和移栽當(dāng)組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，先在室內(nèi)煉苗3天，再將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的土壤中，適當(dāng)遮光，溫度保持在左右，相對濕度在75%左右；組培苗生長健壯，成活率在90%以上；
上述所有培養(yǎng)基的pH值為5. 5 6. 7，光照培養(yǎng)條件均為每天光照8 16小時、 光照強(qiáng)度為1500 25001x、培養(yǎng)溫度20 27°C。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1步驟中產(chǎn)生的不定芽切下后，轉(zhuǎn)接到不加激素的MS培養(yǎng)基中，其它步驟同實(shí)施例1，在培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)其生根率為71. 4%;但產(chǎn)生的不定根數(shù)目較少、且根細(xì)長和根毛不發(fā)達(dá)；并在后期的組培苗移栽過程中，成活率較低，為68. 8%。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1步驟( 中葉柄接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的接種方式改為平放(不插入培養(yǎng)基、平放在培養(yǎng)基表面)，其它步驟同實(shí)施例1 ；盡管葉柄在培養(yǎng)20后統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率也為100%，但愈傷組織生長的速度慢、產(chǎn)生的數(shù)量也少，僅為采用正接方式產(chǎn)生愈傷組織量的1/5。
權(quán)利要求
1.一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體的處理選取生長健康和無病蟲害的苦蕎葉，切去葉片部分，將葉柄用濃度為0. 1 %的升汞消毒2 6分鐘，再用無菌水清洗3 4次；(2)愈傷組織誘導(dǎo)將消毒后的葉柄外植體上的水分吸干，再切成0.7cm 1.5cm的長度，然后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 0. 1 2. 0mg/L+2,4-D 1 6mg/L+IAA 0 lmg/L中進(jìn)行培養(yǎng)；(3)芽分化培養(yǎng)選取質(zhì)地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，將其切成0.5 1. Ocm2 的塊狀后，接入芽分化培養(yǎng)基MS+6-BA 1. 0 4. 0mg/L+NAA0. 1 lmg/L+KT 0 1. 5mg/L 中進(jìn)行培養(yǎng)；(4)生根培養(yǎng)當(dāng)不定芽長至2.0 4.Ocm時，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MS+IBA 0 2. Omg/L上進(jìn)行生根培養(yǎng)；(5)煉苗和移栽當(dāng)組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，先在室內(nèi)煉苗2 4天，再將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的土壤中生長；上述所有培養(yǎng)基的pH值為5. 5 6. 7、蔗糖15 50g · L-1、瓊脂6. 0 7. Og · L-1 ；上述光照培養(yǎng)條件均為每天光照8 16小時、光照強(qiáng)度為1500 25001x、培養(yǎng)溫度 20 27°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特征在于步驟(1)中苦蕎葉應(yīng)在晴天選取且葉齡為3 40天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中消毒后的葉柄外植體在切成0. 7cm 1. 5cm的長度前，應(yīng) 先切去葉柄兩端少量的游離末端，使切口保持新鮮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特征在于步驟O)中葉柄外植體接入培養(yǎng)基的方式為正接、反接或平放。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特征在于步驟(5)中將組培苗移栽至松軟的土壤中生長時應(yīng)適當(dāng)遮光，溫度保持在20 27°C， 相對濕度在70 80%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，該方法包括如下步驟外植體的處理→愈傷組織誘導(dǎo)→芽分化培養(yǎng)→生根培養(yǎng)→煉苗和移栽。本發(fā)明以苦蕎麥次生代謝物總黃酮含量高的葉柄為外植體可快速繁殖品種優(yōu)良的苦蕎麥再生植株，為苦蕎麥植物優(yōu)良品種的選育和快速繁殖提供一條新途徑。
文檔編號A01H4/00GK102499080SQ20111032441
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月23日
發(fā)明者孫雁霞, 宋超, 彭鐮心, 段有麗, 王躍華, 胡一冰, 趙鋼, 鄔曉勇, 鄒亮, 陳麗 申請人:成都大學(xué)