專利名稱：一種微生物抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物抑制劑。
背景技術(shù)：
化學(xué)農(nóng)藥具有嚴(yán)重的污染性，長期使用對人類的身體健康造成安全隱患。生物農(nóng)藥不僅安全性高、選擇性強(qiáng)，而且具有易降解及活性高的特點(diǎn)，受到全世界的廣泛關(guān)注。研究者發(fā)現(xiàn)，微生物源農(nóng)用抗生素已成為化學(xué)農(nóng)藥的重要替代物，從而成為各國研究者的研
J Ll ； ^^ O紫色桿菌素是細(xì)菌以L-色氨酸為前體物合成的一種吲哚衍生物。紫色桿菌素生物合成途徑已基本清楚。紫色桿菌素中所有的C、H、N原子都來自色氨酸分子。紫色桿菌素的整個合成途徑中涉及到5個基因vioabcde，分布在同一轉(zhuǎn)錄單元。VioC、VioD兩者都?xì)w屬單加氧酶家族，依賴NAD (P) H，在合成途徑的結(jié)尾部分起一定作用。VioC對脫氧紫色桿菌素前體、紫色桿菌素前體均起催化作用，體內(nèi)一旦缺失，只能合成紫色桿菌素前體。VioD只對脫氧紫色桿菌素前體起作用，體內(nèi)一旦缺失只能合成脫氧紫色桿菌素。自從19世紀(jì)末紫色桿菌素被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其生物功能進(jìn)行了大量的探索，發(fā)現(xiàn)它具有如下功能(1)廣譜抗菌性1945年Lichstein等用51株細(xì)菌(包括21個種)對紫色桿菌素粗提物進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌對革蘭氏陽性細(xì)菌有顯著的抑制作用，對革蘭氏陰性細(xì)菌有較小的抑制性。隨后，1983年Duran等用純化后的紫色桿菌素進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，純的紫色桿菌素與紫色桿菌素+10%脫氧紫色桿菌素的混合物抗菌效果一樣。紫色桿菌素還可以抑制植物真菌病原菌如Rosellinia necatrix，可以抑制桑樹根腐病。在體外紫色桿菌素還具有抗分枝桿菌如Mycobacterium tuberculosis H37Ra的活性，其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為64yg/mL和1 μ g/mL，與對肺結(jié)核進(jìn)行化學(xué)療法中使用吡嗪酰胺 (Pyrazinamide)的濃度相當(dāng)。(2)抗原生動物活性紫色桿菌素具有殺錐蟲和抗利什曼原蟲(Leishmania)的活性。(3)抗病毒性紫色桿菌素和10%脫氧紫色桿菌素的混合物對侵染Hela細(xì)胞的單純性皰疹病毒 (Herpes Simplex Virus，HSV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polioviruses)有抵抗活性。(4)抗腫瘤細(xì)胞紫色桿菌素對成纖維細(xì)胞(V79)系有很高的細(xì)胞毒素活性。紫色桿菌素對白血病細(xì)胞(leukemia cells)、淋巴瘤(lymphoma)、肺、結(jié)腸以及由艾滋病毒(AIDS)引起的淋巴瘤都有很好的細(xì)胞毒性作用。脫氧紫色桿菌素、氧化紫色桿菌素是紫色桿菌素的衍生物，生物合成過程中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量低，目前對其生物功能尚未開展研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物抑制劑。本發(fā)明提供的微生物抑制劑，包括式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素。所述微生物抑制劑還可包括式(III)所示的氧化紫色桿菌素。
式(I )。r.,:.、t.式(II )。
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―‘H式(III)。所述微生物抑制劑具體可包括式(I)所示的紫色桿菌素和式(Ii)所示的脫氧紫色桿菌素；式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素的質(zhì)量比具體可為 89.6 10.4。所述微生物抑制劑具體可包括式(I)所示的紫色桿菌素、式(II)所示的脫氧紫色桿菌素組成和式(III)所示的氧化紫色桿菌素；式(I)所示的紫色桿菌素、式(II)所示的脫氧紫色桿菌素和式(III)所示的氧化紫色桿菌素的質(zhì)量比具體可為12. 7 9. 1 78. 2。所述微生物抑制劑可為如下(a)或(b)或(C)或(d)(a)將Citrobacter freundii (pCOMlO)菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；(b)將(a)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物甲)；(c)將杜搟氏菌(Duganella)B2菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液； 所述杜搟氏菌(Duganella) B2菌株的保藏編號為CGMCC NO. 2056 ；(d)將(C)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物乙)。所述(a)中的所述提取的方法具體如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻， 先-20°C冷凍30min，然后30°C振蕩30min，最后12000g離心IOmin收集上清。所述振蕩的參數(shù)優(yōu)選為180r · miiT1、振蕩半徑為16mm。所述(c)中的所述提取的方法具體如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻，然后在200W超聲波條件下振蕩1小時，最后9000Xg離心5min收集上清。所述振蕩的參數(shù)優(yōu)選為30°C、180r · miiT1、振蕩半徑為16mm。所述微生物可為細(xì)菌和/或真菌。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌金黃亞種、枯草芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌和鏈球菌中的至少一種。所述真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌萎蔫?；汀⒑吮P菌、葫蘆科刺盤孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻綠核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大麗花輪枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)如下⑴或(II)或(III)或(IV)或(V)或(VI)在制備微生物抑制劑中的應(yīng)用(I)將Citrobacter freundii (pCOMlO)菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；(II)將(I)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物甲)；(III)將所述杜搟氏菌(Duganella)B2菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；(IV)將(III)所述的提取液真空干燥得到的粉末(提取物乙)；(V)式(I)所示的紫色桿菌素、式(II)所示的脫氧紫色桿菌素和式(III)所示的氧化紫色桿菌素；(VI)式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素。所述(I)中的所述提取的方法具體如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻， 先-20°C冷凍30min，然后30°C振蕩30min，最后12000g離心IOmin收集上清。所述振蕩的參數(shù)優(yōu)選為180r · miiT1、振蕩半徑為16mm。所述(III)中的所述提取的方法具體如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻， 然后在200W超聲波條件下振蕩1小時，最后9000Xg離心5min收集上清。所述振蕩的參數(shù)優(yōu)選為30°C、180r · miiT1、振蕩半徑為16mm。所述(V)中，式(I)所示的紫色桿菌素、式(II)所示的脫氧紫色桿菌素和式(III) 所示的氧化紫色桿菌素的質(zhì)量比具體可為12.7 9. 1 78.2。所述(VI)中，式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素的質(zhì)量比具體可為89. 6 10.4。所述微生物可為細(xì)菌和/或真菌。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌金黃亞種、枯草芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌和鏈球菌中的至少一種。所述真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌萎蔫?；?、核盤菌、葫蘆科刺盤孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻綠核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大麗花輪枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)所述⑴、所述(II)、所述(III)、所述(IV)、所述(V)或所述(VI) 在抑制微生物中的應(yīng)用。所述微生物可為細(xì)菌和/或真菌。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌金黃亞種、枯草芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌和鏈球菌中的至少一種。所述真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌萎蔫?；?、核盤菌、葫蘆科刺盤孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻綠核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大麗花輪枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)式(II)所示脫氧紫色桿菌素在制備微生物抑制劑中的應(yīng)用。所述微生物可為細(xì)菌和/或真菌。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌金黃亞種、枯草芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌和鏈球菌中的至少一種。所述真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌萎蔫?；汀⒑吮P菌、 葫蘆科刺盤孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻綠核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大麗花輪枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)所述將BL21-CodonPlus(DE3)_RIL(pET30aVioAD)菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液，或所述提取液真空干燥得到的粉末(提取物丙)，在制備微生物抑制劑中的應(yīng)用。所述提取的方法具體如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻， 先-20°C冷凍30min，然后30°C振蕩30min，最后12000g離心IOmin收集上清。所述振蕩的參數(shù)優(yōu)選為180r ^irTk振蕩半徑為16mm。所述微生物可為細(xì)菌和/或真菌。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌金黃亞種、枯草芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌和鏈球菌中的至少一種。所述真菌為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌萎蔫?；汀⒑吮P菌、葫蘆科刺盤孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻綠核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大麗花輪枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一種。本文分別將Citrobacter freundii (pCOMlO)菌株、Duganella B2 菌株和 BL21_Co donPlus (DE3) -RIL (pET30aVio Δ D)菌株發(fā)酵，通過無水乙醇提取和真空干燥后得到了三種不同的提取物，含有具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的紫色桿菌素類物質(zhì)(包括紫色桿菌素或紫色桿菌素衍生物)。Citrobacter freundii (pCOMlO)菌株得到的提取物為提取物甲。Duganella B2菌株得到的提取物為提取物乙。BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(pET30aVioAD)菌株得到的提取物為提取物丙。分別檢測各個提取物對真菌和細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果表明，三種胞內(nèi)提取物對供試菌株有不同程度的生長抑制作用，抑菌活性由強(qiáng)到弱表現(xiàn)為提取物甲(氧化紫色桿菌素+脫氧紫色桿菌素+紫色桿菌素)>提取物乙(脫氧紫色桿菌素+紫色桿菌素)>提取物丙(脫氧紫色桿菌素)，在供試菌株中，辣椒疫霉病原真菌對提取物甲最為敏感。提取物甲和提取物乙都能夠較強(qiáng)的抑制多種植物病原真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌。提取物甲能夠?qū)Χ喾N植物病原真菌抑制，在濃度為細(xì)g/mL時對辣椒疫霉菌的抑制率達(dá)到100%。本發(fā)明將為下一步探討紫色桿菌素衍生物對植物病原菌的抑制機(jī)理打下基礎(chǔ)，最終為開發(fā)農(nóng)用抗生素奠定基礎(chǔ)。


圖1為提取物甲的HPLC色譜圖。圖2為提取物甲第一個峰的洗脫液質(zhì)譜圖。圖3為提取物甲第二個峰的洗脫液質(zhì)譜圖。圖4為提取物甲第三個峰的洗脫液質(zhì)譜圖。圖5為提取物乙的HPLC色譜圖。圖6為提取物丙的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Ippm代表該溶質(zhì)占溶液總質(zhì)量的百萬分之一。杜搟氏菌(Duganella)B2 菌株CGMCC NO. 2056 (申請?zhí)?200710120074，授權(quán)號101139564)；簡稱B2菌株；是合成紫色桿菌素的野生菌株，其基因組中含該色素合成的五個酶基因(VioA-VioB-VioC-VioD-VioE)。Citrobacter freundii (pCOMlO)菌株參考文獻(xiàn)Peixia Jiang, Haisheng Wang, Chong Zhang, Kai Lou, Xin-Hui Xing. Reconstruction of the Violacein Biosynthetic, Pathway from Duganella sp.B2indifferent Heterologous Hosts. Appl. Microbiol.Biotechnol, (2010)86(4) :1077-88 ； 簡稱 C. freundii(pCOMlO)菌株；是含 VioA-VioB-VioC-VioD-VioE 基因簇的工程菌株， 其紫色桿菌素產(chǎn)量高于B2菌株。BL21-CodonPlus (DE3) -RIL(pET30aVio Δ D)菌株(別名為“Pseudomonas putida-Vio Δ D”)參考文獻(xiàn)王海勝《一株產(chǎn)藍(lán)色素細(xì)菌的鑒定、色素的結(jié)構(gòu)解析及其基因的克隆與表達(dá)》博士論文，2008中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院；是含 VioA-VioB-VioC-VioE基因簇的工程菌株，產(chǎn)生脫氧紫色桿菌素。實(shí)施例中用于抑菌譜測定所選用的供試菌株共有對株，其中植物病原真菌14株， 細(xì)菌10株，均獲自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。供試菌株見表1。表1實(shí)施例中用于抑菌譜測定所選用的供試菌株
權(quán)利要求
1.一種微生物抑制劑，它包括式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素；
2.如權(quán)利要求1所述的微生物抑制劑，其特征在于色桿菌素；式(II)。 它還包括式(III)所示的氧化紫
3.如權(quán)利要求1所述的微生物抑制劑，其特征在于所述微生物抑制劑為如下(a)或 (b)或(c)或(d)(a)將Citrobacterfreundii pCOMlO菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；(b)將(a)所述的提取液真空干燥后的粉末；(c)將杜搟氏菌(Duganella)B2菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；所述杜搟氏菌(Duganella) B2菌株的保藏編號為CGMCC NO. 2056 ；(d)將(c)所述的提取液真空干燥后的粉末。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物抑制劑，其特征在于所述(a)中的所述提取的方法如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻，先-200C冷凍30min，然后30°C振蕩30min，最后 12000g離心IOmin收集上清；所述振蕩的參數(shù)優(yōu)選為180r · mirT1、振蕩半徑為16mm。
5.如權(quán)利要求3所述的微生物抑制劑，其特征在于所述(c)中的所述提取的方法如下將所述菌體重懸于無水乙醇中混勻，然后在200W超聲波條件下振蕩1小時，最后 9000 Xg離心5min收集上清。
6.如權(quán)利要求1至6中任一所述的微生物抑制劑，其特征在于所述微生物為細(xì)菌和/ 或真菌；所述細(xì)菌優(yōu)選為金黃色葡萄球菌金黃亞種、枯草芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌和鏈球菌中的至少一種；所述真菌優(yōu)選為立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌萎蔫?；?、核盤菌、葫蘆科刺盤孢、玉蜀黍赤霉、稻梨孢菌、稻綠核菌、灰葡萄孢、辣椒疫霉菌、大麗花輪枝孢、大豆根腐病菌和大豆炭疽病菌的至少一種。
7.如下⑴或(II)或(III)或(IV)或(V)或(VI)在制備微生物抑制劑中的應(yīng)用 (I)將Citrobacter freundii pCOMlO菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；(II)將(I)所述的提取液真空干燥后的粉末；(III)將杜搟氏菌(Duganella)B2菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；所述杜搟氏菌(Duganella) B2菌株的保藏編號為CGMCC NO. 2056 ；(IV)將(III)所述的提取液真空干燥后的粉末；(V)式(I)所示的紫色桿菌素、式(II)所示的脫氧紫色桿菌素和式(III)所示的氧化紫色桿菌素；(VI)式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素。
8.如下⑴或(II)或(III)或(IV)或(V)或(VI)在抑制微生物中的應(yīng)用(I)將Citrobacterfreundii pCOMlO菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；(II)將(I)所述的提取液真空干燥后的粉末；(III)將杜搟氏菌(Duganella)B2菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液；所述杜搟氏菌(Duganella) B2菌株的保藏編號為CGMCC NO. 2056 ；(IV)將(III)所述的提取液真空干燥后的粉末；(V)式(I)所示的紫色桿菌素、式(II)所示的脫氧紫色桿菌素和式(III)所示的氧化紫色桿菌素；(VI)式(I)所示的紫色桿菌素和式(II)所示的脫氧紫色桿菌素。
9.式(II)所示脫氧紫色桿菌素在制備微生物抑制劑中的應(yīng)用。
10.將BL21-CodonPlus(DE3)-RILpET30aVio Δ D菌株的菌體用無水乙醇進(jìn)行提取得到的提取液，或所述提取液真空干燥得到的粉末，在制備微生物抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物抑制劑。本發(fā)明提供的微生物抑制劑，是從Citrobacter freundii(pCOM10)菌株、Citrobacter freundii(pCOMΔD)菌株或Duganella B2菌株中提取的具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的紫色桿菌素類物質(zhì)(包括紫色桿菌素或紫色桿菌素衍生物)。本發(fā)明提供的三種提取物中有兩種能夠較強(qiáng)的抑制多種植物病原真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌。其中Citrobacter freundii(pCOM10)菌株的提取物能夠?qū)Χ喾N植物病原真菌抑制，在濃度為4mg/mL時對辣椒疫霉菌的抑制率達(dá)到100％。本發(fā)明將為利用紫色桿菌素及其衍生物開發(fā)農(nóng)用抗生素奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A01P1/00GK102511484SQ201110326619
公開日2012年6月27日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者王海勝, 邢新會, 閆艷春 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 清華大學(xué)