專利名稱：一種凡納濱對蝦的免疫增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)飼料免疫增強(qiáng)劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種凡納濱對蝦的免疫增強(qiáng)劑，即可以提高凡納濱對蝦免疫力和抗病力的羧甲基酵母多糖。
背景技術(shù)：
養(yǎng)殖對蝦疾病是一個世界性難題，其原因在于種質(zhì)的退化和由于片面追求產(chǎn)量造成的養(yǎng)殖環(huán)境惡化。1996年至2010年間，世界范圍內(nèi)由于對蝦疾病造成的損失達(dá)到27. 5 億美元。免疫增強(qiáng)劑是指具有促進(jìn)或誘發(fā)宿主防御反應(yīng)，增強(qiáng)生物機(jī)體抗病能力的一類物質(zhì)，主要作用于水生無脊椎動物的非特異性免疫系統(tǒng)，激活機(jī)體自身的免疫機(jī)能從而達(dá)到防御效果，增強(qiáng)其抗病力。與抗生素和疫苗相比，免疫增強(qiáng)劑具有安全、無殘留、作用范圍廣和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。但是免疫增強(qiáng)劑在凡納濱對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中效果不佳，主要表現(xiàn)在當(dāng)疾病爆發(fā)時，使用免疫增強(qiáng)劑往往沒有預(yù)期效果。酵母多糖是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的免疫增強(qiáng)劑， 但也存在對養(yǎng)殖對蝦免疫力和抗病力提高不顯著等缺點(diǎn)。因此，急需一種對凡納濱對蝦具有顯著免疫效果的免疫增強(qiáng)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高凡納濱對蝦免疫力和抗病力的羧甲基酵母多糖，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的凡納濱對蝦的免疫增強(qiáng)劑，為羧甲基酵母多糖，其羧甲基取代度為 0. 348 0. 356。本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑的制備方法，是在堿性的反應(yīng)體系下，添加氯乙酸鈉與酵母多糖反應(yīng)制備羧甲基酵母多糖。上述制備方法中添加的氯乙酸鈉與酵母多糖的質(zhì)量比為11 25。本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑，添加在凡納濱對蝦飼料中，與飼料的質(zhì)量比為1 500 1000。上述的飼料配方優(yōu)選為魚粉20 24%，蝦殼粉4 8%，面粉34 39%，魷魚內(nèi)臟粉4 8%，豆粕10 14%，花生粕8 12%，魚油2.0 2.4%，大豆軟磷脂0.8 1.4%,對蝦用維生素礦物質(zhì)預(yù)混料4 4. 5%。本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑在對蝦飼料中使用，添加量僅為0. -0. 2%，就能明顯促進(jìn)凡納濱對蝦的生長，顯著提高凡納濱對蝦的免疫力和抗病力。其應(yīng)用效果顯著好于酵母多糖。同時，本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑配合申請人制備的凡納濱對蝦餌料來使用時，能夠獲得更好的效果。說明書附1 本發(fā)明的羧甲基酵母多糖的結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑羧甲基酵母多糖進(jìn)行詳細(xì)描述實(shí)施例1 不同取代度的羧甲基酵母多糖的制作取6.2ml 30%的氫氧化鈉溶液和62. 5ml異丙醇，在10°C下將二者混勻，制成反應(yīng)體系。向反應(yīng)體系中慢慢加入5g酵母多糖，在10°C下反應(yīng)1小時，反應(yīng)期間不斷攪拌，使反應(yīng)得以充分進(jìn)行。另取2. 2克氯乙酸鈉溶解于7ml去離子水中，將此7ml氯乙酸鈉水溶液迅速加入上述反應(yīng)體系中。將反應(yīng)體系置于70°C下反應(yīng)2小時，在此期間，不斷攪拌，使反應(yīng)得以充分進(jìn)行。2小時后，用6mol/L鹽酸溶液將反應(yīng)體系pH調(diào)至7. 0 ；最后將反應(yīng)體系用去離子水透析72小時，得到不含有氯離子的羧甲基酵母多糖的溶液。將此溶液真空干燥，得到羧甲基酵母多糖A。為制作不同取代度的羧甲基酵母多糖，在反應(yīng)中，增加氯乙酸鈉的量，同時保持制備步驟和其它參數(shù)不變。氯乙酸的添加量，分別選取3. 95g、7. 15g和10. llg，制得羧甲基酵母多糖B、羧甲基酵母多糖C、羧甲基酵母多糖D。實(shí)施例2 羧甲基酵母多糖取代度的測定將Ig羧甲基酵母多糖溶解于15ml丙酮中，充分混勻。向上述體系加入3ml6mol/ L鹽酸溶液，反應(yīng)30分鐘，在此期間內(nèi)，不斷攪拌，使之充分反應(yīng)。將反應(yīng)液過濾，以80%的甲醇洗滌濾渣，使濾渣呈中性。將濾渣在50°C下烘烤2小時，使其充分干燥。取0. 5g濾渣， 溶于20ml 0. 2mol/L氫氧化鈉溶液，并用蒸餾水定容到100ml。取25ml定容液，加入1滴酚酞試劑，以0.05M鹽酸滴定至無色，記下所用體積VI。另取20ml 0. 2mol/L氫氧化鈉溶液， 并用蒸餾水定容到100ml。取25ml定容液，加入1滴酚酞試劑，以0. 05mol/L鹽酸溶液滴定至無色，記下所用體積V2。取代度的計(jì)算如下取代度=162X (V2-V1) X0. 05 X 4/ (0. 5-58 X (V2-V1) X0. 05 X 4)經(jīng)過測量和計(jì)算，羧甲基酵母多糖A的取代度為0. 348-0. 356。羧甲基酵母多糖B 的取代度為0.446-0. 453。羧甲基酵母多糖C的取代度為0. 768-0. 775。羧甲基酵母多糖 D的取代度為0. 941-0. 947。實(shí)施例3 酵母多糖和羧甲基酵母多糖溶解率的測定取2g酵母多糖或羧甲基酵母多糖，加入到IOml去離子水中，振蕩20分鐘。20分鐘后，將上述混合液于離心20分鐘，取上清液，于100°C下烘干。稱量干燥出的粉末，計(jì)M。溶解率=M/2X100%經(jīng)過測量和計(jì)算，羧甲基酵母多糖A的溶解率為33. 76%。羧甲基酵母多糖B的溶解率為41. 06%。羧甲基酵母多糖C的溶解率為62. 69%。羧甲基酵母多糖D的溶解率為 86.56%。酵母多糖的溶解率為4. 07%。實(shí)施例4 篩選適用于凡納濱對蝦的羧甲基酵母多糖以不添加免疫增強(qiáng)劑的凡納濱對蝦飼料作為對照組飼料。在對照組飼料中，分別加入0. 酵母多糖和0. 1%的羧甲基酵母多糖4』、(、0，制成酵母多糖飼料和羧甲基酵母多糖飼料A、B、C、D。以這六種飼料作為實(shí)驗(yàn)飼料，進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。選用當(dāng)年人工孵化的同一批凡納濱對蝦，體重約0. 65g左右，作為實(shí)驗(yàn)用蝦。經(jīng)1 周的馴養(yǎng)后，挑選出體格健壯、規(guī)格一致的凡納濱對蝦進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。共分為6組，分別投喂一種實(shí)驗(yàn)飼料。每組設(shè)3個平行，每個平行為1個250L的玻璃鋼桶，放養(yǎng)30尾實(shí)驗(yàn)用凡納濱對蝦。實(shí)驗(yàn)過程中，每天換水一次，換水量為總體積的3/4，充氣。在為期4周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中，海水的溶氧在7.8-8. 2mg/L，pH 7. 5-8. 0，鹽度30-32，溫度27-31 °C。每天投喂四次， 分別在06 00、12 00、18 00、24 00，飽食投喂，每日清除殘餌及排泄物。實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時對每個平行的凡納濱對蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)、稱重，計(jì)算凡納濱對蝦的特定生長率。計(jì)算方法如下特定生長率=(LnWt-LnWtl)X 100/t其中，Wtl和Wt分別為每個平行凡納濱對蝦初始體重和終末體重，t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每個平行隨機(jī)選取5尾蝦，用于免疫力的測定。首先抽取凡納濱對蝦血液，與抗凝劑(27mmol/L檸檬酸鈉、385mmol/L氯化鈉、115mmol/L葡萄糖，pH調(diào)至7. 5)按照體積比1 9混勻。將5尾蝦的抗凝血混合均勻，進(jìn)行酚氧化酶和呼吸爆發(fā)的測定。(1)呼吸爆發(fā)的測定在96孔板中先加入50 μ 1抗凝血液，離心，去除上清，然后每個孔加入100 μ 1酵母多糖溶液，反應(yīng)30min。加入200 μ 1的0. 2%的四唑氮藍(lán)(NBT)溶液，反應(yīng)30min。離心去掉上清液，向每個孔加入200 μ 1 100% (體積百分濃度)甲醇，固定lOmin，再以70% (體積百分濃度)的甲醇水溶液洗2次，將96孔板自然風(fēng)干。風(fēng)干后，每孔加入120μ1 2mol/l 的氫氧化鉀水溶液和140 μ 1的二甲基亞砜(DMSO)，沉淀溶解后于室溫下用酶標(biāo)儀在630nm 波長下讀取吸光值。(2)酚氧化酶活力的測定在96孔板中先加入50 μ 1抗凝血上清液，加入200 μ 1左旋多巴(L-DOPA)溶液。 后于室溫下用酶標(biāo)儀在490nm波長下測定20min內(nèi)吸光值的變化。采用患對蝦白斑綜合癥而致死的凡納濱對蝦來檢測本實(shí)驗(yàn)用的凡納濱對蝦的抗病力。取患對蝦白斑綜合癥致死的凡納濱對蝦，去除蝦頭和外殼，將蝦肉打碎、混勻。每個平行隨機(jī)選取14尾凡納濱對蝦，用于抗病力的測定。按每尾凡納濱對蝦投喂0. Ig病蝦肉的劑量投喂，連續(xù)觀察7天，計(jì)算凡納濱對蝦的累積死亡率。采用SPSS 13.0 for Windows軟件對上述測定數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(mean 士 S. D.)表示。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2 投喂酵母多糖和不同取代度的羧甲基酵母多糖對凡納濱對蝦生長、免疫力和抗病力的影響。結(jié)果以平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一行數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母，表示差異顯著 (P < 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種凡納濱對蝦的免疫增強(qiáng)劑，其特征在于，所述的免疫增強(qiáng)劑為羧甲基酵母多糖， 其羧甲基取代度為0. 348 0. 356。
2.權(quán)利要求1所述的免疫增強(qiáng)劑的制備方法，是在堿性的反應(yīng)體系下，添加氯乙酸鈉與酵母多糖反應(yīng)制備羧甲基酵母多糖。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的氯乙酸鈉與酵母多糖的質(zhì)量比為 11 25。
4.權(quán)利要求1所述的凡納濱對蝦免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用，是添加在凡納濱對蝦飼料中，與飼料的質(zhì)量比為1 500 1000。
5.如權(quán)利要求4所述的免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用，其特征在于所述的飼料的配方組分及其質(zhì)量百分比為魚粉20 24%，蝦殼粉4 8 %，面粉34 39 %，魷魚內(nèi)臟粉4 8 %，豆粕 10 14%，花生粕8 12%，魚油2.0 2.4%，大豆軟磷脂0.8 1.4%，對蝦用維生素礦物質(zhì)預(yù)混料4 4.5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種凡納濱對蝦的免疫增強(qiáng)劑，為羧甲基酵母多糖，其羧甲基取代度為0.348～0.356。該免疫增強(qiáng)劑是在堿性的反應(yīng)體系下，添加氯乙酸鈉與酵母多糖反應(yīng)制備的。同時本發(fā)明還包括一種同羧甲基酵母多糖免疫增強(qiáng)劑配合使用的餌料。本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑在對蝦飼料中使用，添加量僅為0.1％-0.2％，就能明顯促進(jìn)凡納濱對蝦的生長，顯著提高凡納濱對蝦的免疫力和抗病力。其應(yīng)用效果顯著好于酵母多糖。同時，本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑配合申請人制備的凡納濱對蝦餌料來使用時，能夠獲得更好效果。
文檔編號A23K1/18GK102318786SQ20111033493
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月29日
發(fā)明者張文兵, 徐瑋, 白楠, 谷珉, 麥康森 申請人:中國海洋大學(xué)