專利名稱：一種刺槐的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)的方法，特別涉及刺槐離體培養(yǎng)和植株再生的方法，屬于刺槐的組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又稱洋槐，屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科刺槐屬(Robinia L.)，落葉喬木，原產(chǎn)于美國(guó)，天然分布于美國(guó)東部阿柏拉契山脈 (Appalachian. Mt.)和奧薩克山脈(Ozank. Mt. ),20世紀(jì)初期引入我國(guó)，引進(jìn)后得到迅速擴(kuò)大栽植，是黃河中下游、淮河流域、海河流域、長(zhǎng)江下游諸省的主要用材林、薪炭林、水土保持林、海提及河提防護(hù)林，僅在河北、河南、山東和山西等6省市就有40億株。它生長(zhǎng)速度快，是重要的速生用材樹種，其木材材質(zhì)堅(jiān)硬、抗壓強(qiáng)度大、具較強(qiáng)的耐旱性、防腐力強(qiáng)。刺槐根系長(zhǎng)有大量根瘤，可以通過(guò)生物固氮增加土壤肥力，在維持生態(tài)平衡、提高林分質(zhì)量等方面發(fā)揮重要作用。刺槐的葉片含有粗蛋白，是優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的家畜飼料資源。刺槐花營(yíng)養(yǎng)豐富，雖花期較短但花量可觀，除直接使用外，還可生產(chǎn)花蜜、提取香料等。
中國(guó)對(duì)刺槐的育種研究始于20世紀(jì)70年代，至今已取得很多成就，但仍不能滿足林業(yè)生產(chǎn)的需要。體細(xì)胞胚再生途徑是對(duì)樹木進(jìn)行繁育和遺傳改良的重要平臺(tái)，也是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的常用再生體系。體胚發(fā)生技術(shù)具有繁殖數(shù)量多、速度快、不受親緣關(guān)系限制、一旦形成結(jié)構(gòu)完整的體細(xì)胞胚一般都可直接萌發(fā)形成小植株等特點(diǎn)，是穩(wěn)定高效的植物再生體系。此外，體細(xì)胞胚胎由單細(xì)胞起源，發(fā)育程序與合子胚相似，可作為胚胎學(xué)研究的模式系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞全能性表達(dá)過(guò)程和細(xì)胞分化機(jī)理等理論問(wèn)題的研究也具有重要意義。Laine E 和Dumet D成功將加勒比松和油棕胚性愈傷組織在超低溫下保存并保持了體胚發(fā)生潛力， 解凍后仍能繼續(xù)培養(yǎng)形成植株，這為挽救瀕危植物提供了可能。刺槐的離體培養(yǎng)研究從20 世紀(jì)50年代末開始，80年代以后達(dá)到高潮。
到目前為止，刺槐通過(guò)形成層培養(yǎng)、莖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、未授粉子房的培養(yǎng)等已獲得了完整的植株，但這些研究都集中在器官發(fā)生途徑，通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的研究還很少。例如，紅艷以刺槐成熟種子的子葉為外植體，對(duì)刺槐體胚培養(yǎng)和誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行了研究，但體細(xì)胞胚發(fā)生率最高也僅有36. 7 %。
大量研究表明，外植體的發(fā)育時(shí)期是影響體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因素，未成熟合子胚因其細(xì)胞全能性高、脫分化容易，在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)具有顯著優(yōu)勢(shì)。大多數(shù)植物離體培養(yǎng)普遍采用未成熟合子胚外植體，但過(guò)于幼嫩或過(guò)度成熟的合子胚的體胚誘導(dǎo)率并不理想。在整個(gè)合子胚的發(fā)育過(guò)程中，只有一個(gè)較短的階段具有很強(qiáng)的體胚發(fā)生潛能。目前，研究合子胚發(fā)育階段對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)影響的研究很多，但就刺槐而言，由于刺槐的體細(xì)胞胚培養(yǎng)比較困難，表現(xiàn)為體胚誘導(dǎo)率低、畸形胚數(shù)量多、體胚質(zhì)量不高等，制約了其遺傳改良的程度，也阻礙了優(yōu)良無(wú)性系的高效繁殖和快速推廣。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)刺槐的體細(xì)胞胚培養(yǎng)的研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道，國(guó)外僅Merkle et al.和Arrillaga et al.發(fā)表了這方面的研究結(jié)果。其中，Merkle等人從開花后第1周開始，每隔一周從3棵刺槐樹上選取未成熟合子胚為外植體，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，研究了外植體胚齡對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響，僅從開花后4周的一粒未成熟合子胚上觀察到體細(xì)胞胚發(fā)生，其體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率低； ArriIlaga等人在Merkle的研究基礎(chǔ)上提高了體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率，以FM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用開花后1-4周的為成熟合子胚為外植體，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明開花后2-3周的外植體體胚誘導(dǎo)率最高，僅達(dá)到12%。上述研究均是以開花后1-4的未成熟合子胚為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其誘導(dǎo)率低，最高誘導(dǎo)率僅為12 %，難以滿足刺槐繁殖和育種的需要，因此，建立刺槐高效體胚發(fā)生體系勢(shì)在必行。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題提供一種新的刺槐離體培養(yǎng)和植株再生的方法，該方法的刺槐體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率高、體胚萌發(fā)率高，可以在較短時(shí)間內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良的刺槐試管苗，可進(jìn)行規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)，可用于刺槐轉(zhuǎn)化體系研究，也可以用于分子育種研究。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種刺槐繁殖方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟
1)采集刺槐莢果；
2)將刺槐莢果進(jìn)行表面滅菌處理后取出其合子胚，獲得無(wú)菌合子胚；
3)將無(wú)菌合子胚接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得愈傷組織；
4)將愈傷組織接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得原胚培養(yǎng)物；
5)將原胚培養(yǎng)物接種于體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)，獲得體細(xì)胞胚；
6)將成熟的體細(xì)胞胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，獲得體胚苗；
7)將體胚苗接種于壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，促進(jìn)體胚苗的生長(zhǎng)，獲得試管壯苗；
8)將試管壯苗進(jìn)行煉苗、移栽，即得。
本發(fā)明中所述體細(xì)胞胚簡(jiǎn)稱體胚。
刺槐的外植體胚齡對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率影響顯著，過(guò)嫩或過(guò)熟的幼胚均不能得到理想的胚性愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處于開花后第25天至第75 天這一時(shí)間段內(nèi)的刺槐莢果作為外植體，其胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果相比于其它時(shí)間段內(nèi)的莢果有明顯的提高；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采集處于刺槐開花后第45天至第65天這一時(shí)間段內(nèi)的莢果作為外植體的繁殖效果有進(jìn)一步的提高，采用處于刺槐開花后第55天至第65天這一時(shí)間段內(nèi)的莢果作為外植體的繁殖效果得到了更進(jìn)一步的提高，采用處于開花后第陽(yáng)天的刺槐莢果作為外植體取得了最好的繁殖效果采集刺槐開花后第陽(yáng)天的莢果中的未成熟合子胚在所有誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的出愈率均高于其它時(shí)期的外植體，其愈傷組織誘導(dǎo)率為 66. 72-95. 42%、誘導(dǎo)得到的愈傷組織生長(zhǎng)速度快，呈淡黃色或嫩黃綠色，結(jié)構(gòu)緊密，呈顆粒狀，經(jīng)多次繼代仍能保持較高的活力；其體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率為76. 88-90. 73%，體胚萌發(fā)率為 80-100%，均明顯高于其它時(shí)段的外植體，所以本發(fā)明最優(yōu)選采集處于開花后第55天的刺4槐莢果作為外植體。
其中，步驟2)中所述滅菌處理包括如下順序進(jìn)行的步驟
A)將采集的刺槐莢果用無(wú)菌水洗凈后，用酒精浸泡莢果后，用無(wú)菌水沖洗干凈；
B)用HgCl2溶液浸泡莢果，用無(wú)菌水沖洗干凈；
C)吸干莢果表面水分后從莢果中取出合子胚，即得。
特別是，步驟A)中所述的酒精的體積百分比濃度為75%;浸泡時(shí)間為30s ；無(wú)菌水沖洗3-5次。
特別是，步驟B)中所述HgCl2溶液的質(zhì)量百分比濃度為0. 1 % ；浸泡時(shí)間為 3-7min，優(yōu)選為5min ；無(wú)菌水沖洗5_6次。
其中，步驟3)中所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MEQ500mg/L+2，4- 二氯苯氧基乙酸0. 3_6mg/L+6-芐氨基腺嘌呤0-3. Omg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基+MES 500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸0. 3-5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0-3. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；進(jìn)一步優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基+MES 500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸1. 0-5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 3-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；更進(jìn)一步優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基 +MES500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6g/L，pH 值為 5.8。
特別是，步驟幻中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件下，培養(yǎng)溫度為洸士2°C。
尤其是，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中的相對(duì)濕度為60-75%。
其中，步驟4)中所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-2. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/ L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-1. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+ 瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；進(jìn)一步優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+ 水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 5mg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L， pH值為5.8。
特別是，步驟4)中所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件下，培養(yǎng)溫度為洸士2°C。
尤其是，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中相對(duì)濕度為60-75%。
其中，步驟幻中所述的體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
特別是，步驟5)中所述體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為 ^±2°C，光照強(qiáng)度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時(shí)光照/8-10小時(shí)黑暗。
尤其是，體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)過(guò)程中相對(duì)濕度為60-75%。
其中，步驟6)中所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH 值為5.8。
特別是，步驟6)中所述萌發(fā)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為^±2°C，光照強(qiáng)度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時(shí)光照/8-10小時(shí)黑暗。
尤其是，體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)過(guò)程中相對(duì)濕度為60-75%。
其中，步驟7)中所述壯苗培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
特別是，步驟7)中所述壯苗培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為^±2°C，光照強(qiáng)度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時(shí)光照/8-10小時(shí)黑暗。
尤其是，體胚苗壯苗培養(yǎng)過(guò)程中相對(duì)濕度為60-75%。
其中，步驟8)中所述的煉苗、移栽包括如下順序進(jìn)行的步驟打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋， 在移栽室中煉苗1天；然后將試管苗取出，用自來(lái)水洗凈根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽到刺槐無(wú)土栽培基質(zhì)中進(jìn)行移栽培養(yǎng)，移栽培養(yǎng)5-6周后再定植于大田。
特別是，還包括將試管苗放置于遮光50%的自然光光照強(qiáng)度下培養(yǎng)5-10天后再打開培養(yǎng)瓶瓶蓋。
特別是，所述刺槐無(wú)土栽培基質(zhì)由珍珠巖、蛭石組成，其中珍珠巖與蛭石的體積之比為1 1。
特別是，移栽培養(yǎng)是自然光光照條件下，培養(yǎng)5-6周
尤其是，移栽培養(yǎng)溫度為25士5°C、相對(duì)濕度為56-90%。
本發(fā)明的刺槐的繁殖方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明利用刺槐未成熟合子胚進(jìn)行離體快速繁殖，每個(gè)培養(yǎng)階段所采用的基本培養(yǎng)基的都是MS基本培養(yǎng)基，具有無(wú)機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀和銨的含量高，可以為組織生長(zhǎng)提供所需礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、分化和萌發(fā)生長(zhǎng)。
2、本發(fā)明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑利于外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖，愈傷組織誘導(dǎo)率高，可達(dá)到95. 42%
3、本發(fā)明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑利于體細(xì)胞胚從愈傷組織上進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖、成熟，萌發(fā)和分化，本發(fā)明中使用的刺槐培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成合理，用量和配比適宜，培育結(jié)果重復(fù)性高，再生體系穩(wěn)定，體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率高，可達(dá)到90. 73%。
4、本發(fā)明方法培育的刺槐再生苗生長(zhǎng)健壯、繁殖系數(shù)高，成熟體細(xì)胞胚萌發(fā)率高， 達(dá)到80-100% ；體胚苗移栽成活率高，達(dá)到100%，是工廠化大規(guī)模生產(chǎn)刺槐植株的簡(jiǎn)便、快捷的技術(shù)體系。


圖1是刺槐未成熟合子胚誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的愈傷組織；
圖2是刺槐愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的原胚培養(yǎng)物；
圖3是原胚培養(yǎng)物的薄層切片的顯微鏡觀測(cè)照片；
圖4是刺槐原胚培養(yǎng)物進(jìn)行成熟培養(yǎng)初期得到的初期培養(yǎng)物；
圖5是刺槐原胚培養(yǎng)物通過(guò)成熟培養(yǎng)得到的成熟的體細(xì)胞胚；
圖6是刺槐成熟體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)得到的體胚苗；
圖7是刺槐體胚苗壯苗培養(yǎng)得到的具有多個(gè)莖葉端的叢生試管壯苗；
圖8是刺槐體胚苗壯苗培養(yǎng)過(guò)程中繼代培養(yǎng)得到的具有優(yōu)勢(shì)主干的試管壯苗；具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
一、試驗(yàn)材料
1、本發(fā)明以北京市延慶米家堡苗圃生長(zhǎng)良好的二倍體刺槐實(shí)生苗群體為取材資源，選取10棵生長(zhǎng)良好、干型較直、結(jié)實(shí)率高的母樹(各株之間的間隔大于50米)，在2010 年6月到9月間，采集開花后第4-12周的刺槐不同發(fā)育階段的合子胚作為外植體試驗(yàn)材料，每間隔10天采集一次，每次采集500個(gè)莢果，即采集開花后25、35、45、55、65、75天的莢果，每次采集500個(gè)莢果，將當(dāng)天采集的莢果在冰盒中低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，之后放在4°C 的冰箱里冷藏備用。
2、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑
本發(fā)明中所使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)采用國(guó)產(chǎn)萘乙酸(NAA)、6_芐氨基腺嘌呤 (6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和吲哚丁酸(IBA)。
3、培養(yǎng)基的配制
(1) "MS基本培養(yǎng)基”的組成或配制方法；
表IMS 培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)
權(quán)利要求
1.一種刺槐繁殖方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟1)采集刺槐莢果；2)將刺槐莢果進(jìn)行表面滅菌后取出其合子胚，獲得無(wú)菌合子胚；3)將無(wú)菌合子胚接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得愈傷組織；4)將愈傷組織接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得原胚培養(yǎng)物；5)將原胚培養(yǎng)物接種于體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)，獲得體細(xì)胞胚；6)將成熟的體細(xì)胞胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，獲得體胚苗；7)將體胚苗接種于壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，促進(jìn)體胚苗的生長(zhǎng)，獲得試管壯苗；8)將試管壯苗進(jìn)行煉苗、移栽，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的刺槐莢果是處于刺槐開花后第25天至第75天這一時(shí)間段內(nèi)的刺槐莢果，優(yōu)選為處于刺槐開花后第45天至第65天這一時(shí)間段內(nèi)的刺槐莢果，更優(yōu)選為處于刺槐開花后第陽(yáng)天至第65天這一時(shí)間段內(nèi)的刺槐莢果，最優(yōu)選為刺槐開花后第陽(yáng)天的刺槐莢果。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸500mg/L+2，4- 二氯苯氧基乙酸0. 3-6. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤 0-3. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征是步驟幻中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件下，培養(yǎng)溫度為^±2°C。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟4)中所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸 0. 1-2. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤 0-1. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟4)中所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件下，培養(yǎng)溫度為^±2°C。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述的體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟6)中所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟7)中所述壯苗培養(yǎng)基為+吲哚丁酸0.2mg/ L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)、步驟6)中所述萌發(fā)培養(yǎng)或步驟7)中所壯苗培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為^±2°C，光照強(qiáng)度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時(shí)光照/8-10小時(shí)黑暗；步驟8)中所述的煉苗移栽包括如下順序進(jìn)行的步驟打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋，在移栽室中煉苗1天；然后將試管苗取出， 用自來(lái)水洗凈根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽到刺槐無(wú)土栽培基質(zhì)中進(jìn)行移栽培養(yǎng)5-6周后再定植于大田。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刺槐的繁殖方法，以不同胚齡的合子胚為外植體，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+瓊脂為胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS基本培養(yǎng)基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-芐氨基腺嘌呤+蔗糖+瓊脂為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)，形成球形胚后將其轉(zhuǎn)接到MS+水解酪蛋白培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)形成完整小植株。本發(fā)明方法中愈傷組織誘導(dǎo)率、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率、萌發(fā)率高，可以在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良的刺槐試管苗，可進(jìn)行規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102499086SQ201110340118
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者習(xí)洋, 孫宇涵, 孫鵬, 戴麗, 李云, 李允菲, 王歡, 胡瑞陽(yáng), 袁存權(quán) 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)