專利名稱：一種人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人臍帶華通氏膠組織塊的凍存保護(hù)液。
背景技術(shù)：
人臍帶華通氏膠(Wharton's Jelly)內(nèi)的細(xì)胞具有能自我更新和多向分化、增殖能力強(qiáng)等干細(xì)胞的特征，我們稱之為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(huMSCs)。間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員，是一種低免疫原性的干細(xì)胞，具有支持造血和促進(jìn)干細(xì)胞植入、調(diào)控免疫等特點(diǎn)，是用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)的理想種子細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因其來源廣泛，易獲得，并具有間充質(zhì)干細(xì)胞的所有特性，日益受到人們的關(guān)注，越來越多的人開始儲(chǔ)存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以為將來不時(shí)之需。凍存保護(hù)液的配方及凍存的操作方案直接影響儲(chǔ)存的臍帶華通氏膠中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量，對(duì)將來的細(xì)胞移植效果至關(guān)重要。細(xì)胞或者組織的冷凍保存有幾個(gè)關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)冷凍保護(hù)劑的選擇和組合，各種冷凍保護(hù)劑的配比，凍存的步驟，凍存溫度及復(fù)蘇溫度。目前，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法多采用傳統(tǒng)的細(xì)胞冷凍方法，細(xì)胞冷凍主要采用含有滲透性冷凍保護(hù)劑的凍存保護(hù)液，作用是降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，減輕冷凍過程中細(xì)胞的損傷。通常情況下，人們選擇單一的滲透性冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜凍存干細(xì)胞，凍存后復(fù)蘇后會(huì)有凍存保護(hù)液的殘留，臨床使用殘留凍存保護(hù)液二甲基亞砜的干細(xì)胞，有較高的毒副作用，易造成惡心、嘔吐、腹痛等不良反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用一種由基礎(chǔ)液、滲透性冷凍保護(hù)劑、非滲透性冷凍保護(hù)劑組成的直接對(duì)人臍帶華通氏膠組織塊進(jìn)行長期安全冷凍儲(chǔ)存的凍存保護(hù)液，凍存效果好，細(xì)胞損傷少，凍存保護(hù)液殘留低，毒副作用小，臨床使用時(shí)對(duì)人體無傷害。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的一種人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液，IL的體積中包含乙二醇0.8-1. 2mol、二甲基亞砜0.4-0. 6 mol、蔗糖0. 1-0. 3 mol、自體臍血血清 100-200ml、余量為培養(yǎng)液 DMEM/F12。進(jìn)一步地，一種人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液，IL的體積中優(yōu)選包含乙二醇 0.9-1. 1 mol、二甲基亞砜 0. 4-0. 5 mol、蔗糖 0. 1-0.2 mol、自體臍血血清 100_150ml、余量為培養(yǎng)液DMEM/F12。本發(fā)明采用自體臍血血清、培養(yǎng)液DMEM/F12作為基礎(chǔ)液，能夠保證組織內(nèi)細(xì)胞的滲透平衡，尤其是采用了源于同一個(gè)體的自體臍血血清作為基礎(chǔ)液為組織塊提供養(yǎng)分，自體臍血血清簡單易得，臨床容易實(shí)現(xiàn)，最大限度保證了凍存過程中組織塊內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境一致，凍存效果好；采用乙二醇、二甲基亞砜作為滲透性冷凍保護(hù)劑，可以透過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)，減少冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，其濃度都處在較低的水平上，最大限度降低了凍存保護(hù)液的毒性；采用蔗糖作為非滲透性冷凍保護(hù)劑，其價(jià)格便宜，較為常見，分子量大不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，很少的一部分就能大大增加溶液的粘度，使細(xì)胞脫水，緩解細(xì)胞凍存時(shí)細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓，減少冷凍時(shí)細(xì)胞的冰晶形成，且對(duì)干細(xì)胞無毒性。本發(fā)明改變傳統(tǒng)含單一冷凍保護(hù)劑的凍存保護(hù)液，采用對(duì)人臍帶華通氏膠組織塊直接凍存的含多種冷凍保護(hù)劑的凍存保護(hù)液，凍存效果好，細(xì)胞損傷少，最大限度降低凍存保護(hù)液在組織塊復(fù)蘇后細(xì)胞內(nèi)的殘留，毒副作用小，臨床使用時(shí)對(duì)人體無傷害，能為臨床上提供較高質(zhì)量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。


圖1為經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)出的Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀態(tài)圖2為經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)出的Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線圖3為經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)出的Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)鑒定圖4為經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)出的Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)鑒定圖。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于實(shí)施例列出的范圍。實(shí)例一
取500ml的培養(yǎng)液DMEM/F12加入蔗糖0.1 mol充分混勻后以0. 22um濾膜的濾器過濾后4°C預(yù)冷，冰浴上依次加入4°C預(yù)冷的自體臍血血清IOOml，4°C預(yù)冷的乙二醇0. 8mo 1,4°C 預(yù)冷的二甲基亞砜0. 4mol，補(bǔ)加培養(yǎng)液DMEM/F12至IL即為人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液。實(shí)例二
取500ml的培養(yǎng)液DMEM/F12，加入蔗糖0. 3mol充分混勻后以0. 22um濾膜的濾器過濾后4°C預(yù)冷，冰浴上依次加入4°C預(yù)冷的自體臍血血清200ml，4°C預(yù)冷的乙二醇1. 2mol，4°C 預(yù)冷的二甲基亞砜0. 6mol，補(bǔ)加培養(yǎng)液DMEM/F12至IL即為人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液。實(shí)例三
取500ml的培養(yǎng)液DMEM/F12，加入蔗糖0. 2mol充分混勻后以0. 22um濾膜的濾器過濾后4°C預(yù)冷，冰浴上依次加入4°C預(yù)冷的自體臍血血清150ml，4°C預(yù)冷的乙二醇1 mol，4°C 預(yù)冷的二甲基亞砜0. 5mol，補(bǔ)加培養(yǎng)液DMEM/F12至IL即為人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液。以下是對(duì)最佳實(shí)例一的凍存保護(hù)液冷凍保存臍帶華通氏膠效果的測試
經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)15天后，PO代細(xì)胞總數(shù)為2. 58 XlO5/克，Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞融合至80-90%，將其置于倒置顯微鏡下拍照， 細(xì)胞形狀為短梭形，大小均一，排列整齊，如圖1所示。實(shí)驗(yàn)組以此凍存保護(hù)液常規(guī)冷凍保存臍帶華通氏膠組織塊148天，對(duì)照組以含 10%DMS0的培養(yǎng)液DMEM/F12作為冷凍保護(hù)液，采用同樣方法進(jìn)行冷凍保存，經(jīng)冷凍保存的臍帶華通氏膠組織塊培養(yǎng)出Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以MTT方法繪制生長曲線，生長曲線顯示在培養(yǎng)同樣的時(shí)間下，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)出的細(xì)胞的OD值高于對(duì)照組培養(yǎng)出的細(xì)胞，即實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)出的細(xì)胞增殖能力優(yōu)于對(duì)照組培養(yǎng)出的細(xì)胞，如圖2所示。經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)出Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以lxl04/ml的細(xì)胞濃度接種于M孔培養(yǎng)板中，0. 5ml/孔；細(xì)胞融合至60_80%， 換成hvitrogen公司的成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，0. 5ml/孔；每3_4天全量更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液； 誘導(dǎo)14天后，油紅0染色后拍照，可見細(xì)胞內(nèi)有脂滴產(chǎn)生，如圖3所示。經(jīng)此凍存保護(hù)液冷凍保存148天的臍帶華通氏膠組織塊，培養(yǎng)出Pl代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以lxl04/ml的細(xì)胞濃度接種于M孔培養(yǎng)板中，0. 5ml/孔；細(xì)胞融合至60_80%， 換成hvitrogen公司的成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，0. 5ml/孔；每3_4天全量更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液； 誘導(dǎo)7天后，茜素紅染色后拍照，可見有大量鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生，如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液，IL的體積中包含 乙二醇0. 8-1. 2mol二甲基亞砜0.4-0. 6mol臍血血清100-200ml蔗糖0. 1-0. 3mol余量為培養(yǎng)液DMEM/F12。
2.根據(jù)權(quán)利人要求1所述的一種人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液，IL的體積中優(yōu)選包含乙二醇0. 9-1. Imol二甲基亞砜0.4-0. 5mol臍血血清100-150ml蔗糖0. 1-0. 2mol余量為培養(yǎng)液DMEM/F12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護(hù)液，1L的體積中包含乙二醇0.8-1.2mol、二甲基亞砜0.4-0.6mol、蔗糖0.1-0.3mol、自體臍血血清100-200ml、余量為培養(yǎng)液DMEM/F12。本發(fā)明采用自體臍血血清、培養(yǎng)液DMEM/F12作為基礎(chǔ)液為組織塊提供養(yǎng)分，保證細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，保證組織塊內(nèi)的細(xì)胞的環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相近，凍存效果好；采用低濃度的乙二醇、二甲基亞砜作為滲透性冷凍保護(hù)劑，使凍存保護(hù)液對(duì)細(xì)胞的毒性減??；采用蔗糖作為非滲透性冷凍保護(hù)劑，增加溶液粘度，緩解細(xì)胞凍存時(shí)細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓。本凍存保護(hù)液直接對(duì)人臍帶華通氏膠組織塊凍存，凍存效果好，細(xì)胞損傷少，能夠?yàn)榕R床提供較高質(zhì)量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102428910SQ20111034342
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者宋云慶, 李偉, 楊兵, 歐陽溪, 胡祥 申請(qǐng)人:江蘇省北科生物科技有限公司