專利名稱：一種促使梨品種間授粉完全親和的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物授粉生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種促使梨品種間授粉完全親和的方法。
背景技術(shù)：
梨是我國乃至世界主要水果之一，我國現(xiàn)有栽培面積125. 84萬公頃，是我國的第三大水果。梨屬于配子體型自交不親和性果樹，絕大多數(shù)品種自花授粉不結(jié)實(shí)，在生產(chǎn)上必須配置授粉樹，才能獲得預(yù)期的產(chǎn)量和品質(zhì)。但采用人工授粉時(shí)應(yīng)避免所用花粉和被授粉樹的S基因型相同，否則不能完成受精、無法坐果，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，甚至絕收。這就使得我們對梨品種授粉樹的選擇存在著一定的取舍，只能選用與之S基因型不同的品種做授粉樹。 但對那些未知S基因型的梨品種授粉時(shí)往往不知道應(yīng)該選用哪些品種做授粉樹才能保證生產(chǎn)，在授粉時(shí)會(huì)存在一定的盲目和僥幸的心理，在生產(chǎn)實(shí)踐中，各地都有存在一些梨園因建園時(shí)授粉品種配置不當(dāng)或人工輔助授粉品種選擇不當(dāng)而造成僅開花不結(jié)果的問題，給生產(chǎn)者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，尋找一種促使梨品種間雜交完全親和的授粉方法顯得尤為重要?！饓嬂妗恰喞妗难孔兤贩N，雖然其品質(zhì)特性與‘鴨梨’基本一致，但自花結(jié)實(shí)率高達(dá)70%以上。本課題組研究結(jié)果顯示(吳華清，張紹鈴，吳巨友.‘金墜梨’自交親和性突變機(jī)制的初步研究.園藝學(xué)報(bào)，2007，34，2 :295-300)，‘鴨梨，自花結(jié)實(shí)率僅2%，自花花粉管在花柱中中部已經(jīng)停止生長(圖2-B)；而‘金墜梨’自花結(jié)實(shí)率高達(dá)76%，自花花粉能正常生長至花柱基部(圖2-A)；有趣的是‘鴨梨’雌蕊能夠接受‘金墜梨’花粉并受精結(jié)實(shí)(圖2-C)，而‘金墜梨’雌蕊卻與‘鴨梨’花粉雜交不親和(圖2-D)。進(jìn)一步鑒定了 ‘鴨梨’和‘金墜梨’都是基于S-RNase基因的S基因型，兩者S基因型一樣，均為S21^ ；通過克隆兩品種S-RNase基因cDNA全長序列，并進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，該兩品種的1對雌蕊S-RNase 基因在核苷酸序列上完全相同，且都正常表達(dá)，表達(dá)量也沒有明顯差異(圖幻，這從分子水平上證實(shí)了 ‘金墜梨’在雌蕊方面和‘鴨梨’并無差異，其自交親和的原因是由于雄蕊的特異性識(shí)別功能喪失而導(dǎo)致的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種促使梨品種間授粉完全親和的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種促使梨品種間授粉完全親和的方法，用‘金墜梨’花粉對其他梨品種進(jìn)行人工授粉。其中，所述的梨品種‘黃花’、‘豐水’、‘新雅’、‘新雪’、‘大水核’、‘新梨一號’、‘水晶’、‘臺(tái)灣蜜梨’、‘紅皮酥’、‘大南果’、‘胎黃梨’、‘圓香’、‘大理雞腿’、‘灌陽雪梨’、‘冬黃’、 ‘鴨梨’、‘庫爾勒香梨’、‘香椿’、‘晶玉’、‘蒼溪雪梨’、‘紅皮酥’、‘大慈梨’、‘晉蜜梨’、‘早蜜’、‘京白’、‘中梨二號’、‘奧連’、‘寶珠梨’、‘雅清’、‘早美酥’、‘滿天紅’、‘錦香’、‘鵝酥’、‘麥梨’、‘內(nèi)蒙古山梨’、‘黃皮水’和‘政和大雪梨’包含了目前Genebank中已登錄的所有梨 S-RNase 基因。所述的‘金墜梨’花粉通過如下方法制備采含苞待放的‘金墜梨’大鈴鐺花，揉搓花朵，使花藥與花絲分離，用粒徑為1 3mm的細(xì)孔篩篩下花藥?；ㄋ幵跍囟?0 25°C、相對濕度70% 80%、無陽光直射的室內(nèi)單層攤勻，經(jīng)1 2天后即可散出花粉；爆出的花粉用石蠟紙分裝包好，置于變色硅膠盒內(nèi)，外用錫紙包扎整齊，冷藏或置于液氮內(nèi)冷凍貯運(yùn)。在授粉前1天，先將花粉從冷藏環(huán)境中取出，平攤在潔凈的油光紙上，放入在陰暗、潮濕的環(huán)境中，經(jīng)24 48個(gè)小時(shí)左右的適應(yīng)及吸潮過程，方可進(jìn)行授粉；或者在授粉前 1天，先將花粉從液氮冷凍環(huán)境中取出，依次在_73°C、-20°C、4°C中分別放置24小時(shí)，然后平攤在潔凈的油光紙上，放入在陰暗、潮濕的環(huán)境中，經(jīng)24 48個(gè)小時(shí)左右的適應(yīng)及吸潮過程，方可進(jìn)行授粉。所述授粉的時(shí)間優(yōu)選所授品種的初花期，上午10點(diǎn)至下午4點(diǎn)花心柱頭上有分泌粘液的時(shí)期。所述的初花期為15 25%的花開放的時(shí)期。所述授粉的方法優(yōu)選人工點(diǎn)授法、噴粉法或液體噴霧授粉法。所述的人工點(diǎn)授法為將處理好的花粉按其特征在于所述的人工點(diǎn)授法為將處理好的花粉與填充劑按質(zhì)量比1 3 5的比例配好充分拌勻裝入干燥的瓶中，用帶橡皮頭的鉛筆或鵝毛耳棒沾少許花粉，輕點(diǎn)初開花朵，一次授3-5朵花，每個(gè)花序點(diǎn)授2朵邊花，勿授弱花、梢頭花；所述的噴粉法是花粉與填充劑按質(zhì)量比1 10 15的比例配好，經(jīng)拌勻混合，裝入噴粉器或授粉器中，對著盛花初期的樹均勻噴布；所述的液體噴霧授粉在純凈水或蒸餾水中加入花粉、尿素、砂糖、瓊脂粉、硼砂，所述的凈水或蒸餾水花粉尿素砂糖瓊脂粉硼砂的質(zhì)量比為 1000 2 3 50 1 1，用超低容量噴霧器噴灑?！饓嬂妗ǚ圩鳛椤叭f用花粉”在梨樹人工授粉中的應(yīng)用。用‘金墜梨’花粉對其他梨品種進(jìn)行人工授粉，由于‘金墜梨’雄蕊特異性識(shí)別功能喪失，這使得‘金墜梨’花粉與任一 S基因型的梨品種授粉時(shí)均能表現(xiàn)為授粉親和，使被授粉的品種能夠完成受精、正常坐果。因此，‘金墜梨’花粉是一種親和型的“萬能”梨樹授粉花粉，可為梨果穩(wěn)產(chǎn)增收提供簡便易效的技術(shù)保障。有益效果本發(fā)明所提供的促使梨品種間雜交完全親和的授粉方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明在前期研究證實(shí)‘金墜梨’自交親和的原因是由于雄蕊的特異性識(shí)別功能喪失而導(dǎo)致的基礎(chǔ)上，選取37個(gè)梨品種(這些品種包含了目前Gene Bank里登錄的所有梨S基因)，研究了利用‘金墜梨’花粉和其它梨品種授粉，以達(dá)到雜交授粉完全親和的目的的可能性。結(jié)果顯示通過‘金墜梨’花粉和這些品種進(jìn)行雜交授粉，田間坐果率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各雜交組合花序坐果率均高達(dá)70%以上，表現(xiàn)為雜交親和。這一結(jié)果說明，‘金墜梨’花粉和任一 S基因型的梨品種授粉時(shí)均表現(xiàn)為雜交親和，證實(shí)了可以利用‘金墜梨’雄蕊特異性識(shí)別喪失的這一特性，使得‘金墜梨’花粉可以成為梨樹雜交授粉的‘萬能花粉’。(2)傳統(tǒng)的人工授粉應(yīng)避免所用花粉和被授粉樹的S基因型相同，使得對授粉樹的選擇存在著一定的取舍。這使得對不同的主栽品種授粉時(shí)，還需使用不同種類的花粉。本發(fā)明只需采用‘金墜梨’這一種花粉即可解決所有梨品種的授粉問題，大大簡化了人工授粉工作量。本發(fā)明提供的促使梨品種間授粉完全親和的方法，利用‘金墜梨’花粉為父本，由于其S基因特異性識(shí)別功能喪失，這使得它和任一 S基因型的梨品種授粉時(shí)均能表現(xiàn)為雜交親和，很好的解決了這一技術(shù)盲點(diǎn)。(3)本發(fā)明將‘金墜梨’花粉經(jīng)干燥后裝于變色硅膠盒內(nèi)，外用錫紙包扎密封，液氮超低溫貯藏。待來年需要用時(shí)，將貯藏的花粉進(jìn)行逐步蘇醒，黑暗環(huán)境中恢復(fù)至室溫，完成備用。通過這種方法就能很好的解決梨樹生產(chǎn)中花期不遇或異地授粉時(shí)花粉的供應(yīng)問題， 方法易行、有效?！饓嬂妗ǚ哿看?、花粉萌發(fā)率高，是梨品種授粉的很好材料，又因這種花粉攜帶著自交親和的基因，使得它更是培育自花結(jié)實(shí)品種的優(yōu)良種質(zhì)材料，若進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和推廣，將能形成經(jīng)濟(jì)效益良好的花粉種質(zhì)供應(yīng)市場。(4)本發(fā)明應(yīng)用前景廣闊，經(jīng)濟(jì)效益良好。由于單一 ‘金墜梨’花粉就能解決所有梨品種的授粉問題，這一技術(shù)將顛覆目前市場上花樣繁多的梨花粉供應(yīng)局面，進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)將會(huì)有著廣泛的應(yīng)用前景和良好經(jīng)濟(jì)效益。


圖1促使梨品種間授粉完全親和的流程示意圖。圖2 ‘金墜梨’和‘鴨梨’自花授粉及相互授粉條件下花柱內(nèi)花粉管生長情況。A. ‘金墜梨’自花授粉；B. ‘鴨梨’自花授粉；C. ‘鴨梨’早X ‘金墜梨’‘金墜梨，早χ ‘鴨梨，古。圖3 ‘鴨梨，和‘金墜梨’ S-RNase基因的RT-PCR分析，其中1. ‘鴨梨，；2. ‘金墜梨，；MMarker0
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(一 )花粉的制備‘金墜梨’花粉采集方法采含苞待放的‘金墜梨’大鈴鐺花，帶回室內(nèi)，揉搓花朵， 使花藥與花絲分離，用細(xì)孔篩篩下花藥。雨后采花或花瓣沾有露時(shí)，應(yīng)先晾干再揉搓花朵。 花藥在溫度20 25°C、相對濕度70% 80%、無陽光直射的室內(nèi)單層攤勻，經(jīng)1 2天后即可散出花粉。爆出的花粉用石蠟紙分小包包好，置于變色硅膠盒內(nèi)，外用錫紙包扎整齊， 以達(dá)到干燥遮光的目的。若方便異地需求或長期貯藏‘金墜梨’花粉，則需將其置于液氮內(nèi)冷藏貯運(yùn)。( 二 )人工授粉技術(shù)本研究所開發(fā)的‘金墜梨’人工授粉花粉與普通農(nóng)家自制的花粉，在工藝上、使用方法上有所不同，因?yàn)楸狙芯块_發(fā)的花粉是經(jīng)充分除濕干燥的花粉，未經(jīng)吸濕、適應(yīng)過程， 花粉不能解除休眠狀態(tài)。具體步驟如下1、花粉的準(zhǔn)備‘金墜梨’花粉能顯著提高果樹的座果率，改善果形，提高品質(zhì)。當(dāng)年剛散出的花粉，一般保存在4°C環(huán)境中。為提高花粉的活性和發(fā)芽率，確保人工授粉的效果，在授粉前1天，先將4°C保存中的花粉平攤在潔凈的油光紙上，放入在陰暗、潮濕的環(huán)境中(溫度20-250C，濕度70 % )，經(jīng)過24小時(shí)左右的適應(yīng)及吸潮過程，花粉活性會(huì)顯著提高，方可進(jìn)行授粉，否則會(huì)嚴(yán)重影響花粉的發(fā)芽率及授粉效果。若是豎年或異地使用液氮冷凍貯藏后的‘金墜梨’花粉，則需要將貯藏的花粉進(jìn)行逐步蘇醒，依次在_73°C、_20°C、4°C黑暗環(huán)境中各放置24小時(shí)，恢復(fù)至室溫，完成備用。2、授粉時(shí)間所授品種的初花期(大約15 25%的花開放)，上午10點(diǎn)至下午4點(diǎn)花心柱頭上有分泌粘液為最佳授粉期，以保證花粉在柱頭上有良好的發(fā)芽條件。3、授粉方法①人工點(diǎn)授法將處理好的花粉按其特征在于所述的人工點(diǎn)授法為將處理好的花粉與滑石粉按質(zhì)量比1 3的比例配好充分拌勻裝入干燥的瓶中，用帶橡皮頭的鉛筆或鵝毛耳棒沾少許花粉，輕點(diǎn)初開花朵，一次授3-5朵花，每個(gè)花序點(diǎn)授2朵邊花，勿授弱花、梢頭花；②噴粉法該方法省力、高效，適合勞力少的大規(guī)模的果園使用。具體方法是花粉與滑石粉按質(zhì)量比1 10的比例配好，經(jīng)拌勻混合，裝入噴粉器或授粉器中，對著盛花初期的樹均勻噴布③液體噴霧授粉在IOkg水(純凈水或蒸餾水)中加入花粉20g、尿素30g、砂糖 500g、瓊脂粉10g、硼砂10g，用超低容量噴霧器噴灑，為確保授粉效果，配好后在1小時(shí)內(nèi)噴
元ο(三)‘金墜梨’花粉促使梨品種雜交授粉完全親和的驗(yàn)證為了驗(yàn)證‘金墜梨’花粉是否能促使梨品種雜交授粉完全親和，本研究選取37個(gè)梨品種，這些品種包含了目前Gene Bank里登錄的所有梨S基因。通過‘金墜梨’花粉和這些品種進(jìn)行雜交授粉，田間坐果率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各雜交組合花序坐果率均高達(dá)70%以上， 表現(xiàn)為雜交親和(表1)。這一結(jié)果說明，‘金墜梨’花粉和任一 S基因型的梨品種授粉時(shí)均表現(xiàn)為雜交親和，證實(shí)了可以利用‘金墜梨’雄蕊特異性識(shí)別功能喪失的這一特性，使得‘金墜梨’花粉可以成為梨樹雜交授粉的“萬能”花粉。表1以‘金墜梨’做父本與供試37個(gè)梨品種授粉的田間坐果率統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于用‘金墜梨’花粉對其他梨品種進(jìn)行人工授粉，均表現(xiàn)為授粉親和。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述的梨品種‘黃花’、‘豐水’、‘新雅’、‘新雪’、‘大水核’、‘新梨一號’、‘水晶’、‘臺(tái)灣蜜梨’、‘紅皮酥’、 ‘大南果’、‘胎黃梨’、‘圓香’、‘大理雞腿’、‘灌陽雪梨’、‘冬黃’、‘鴨梨’、‘庫爾勒香梨’、‘香椿’、‘晶玉’、‘蒼溪雪梨’、‘紅皮酥’、‘大慈梨’、‘晉蜜梨’、‘早蜜’、‘京白’、‘中梨二號’、‘奧連”、‘寶珠梨’、‘雅清’、‘早美酥’、‘滿天紅’、‘錦香’、‘鵝酥’、‘麥梨’、‘內(nèi)蒙古山梨’、‘黃皮水’和‘政和大雪梨’，包含了目前Genebank中已登錄的所有梨S-RNase基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述的‘金墜梨’花粉通過如下方法制備采含苞待放的‘金墜梨’大鈴鐺花，揉搓花朵，使花藥與花絲分離，用粒徑為1 3mm的細(xì)孔篩篩下花藥；花藥在溫度20 25°C、相對濕度70% 80%、 無陽光直射的室內(nèi)單層攤勻，經(jīng)1 2天后即可散出花粉；爆出的花粉用石蠟紙分裝包好， 置于變色硅膠盒內(nèi)，外用錫紙包扎整齊，冷藏或置于液氮內(nèi)冷凍貯運(yùn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于在授粉前 1天，先將花粉從冷藏環(huán)境中取出，平攤在潔凈的油光紙上，放入在陰暗、潮濕的環(huán)境中，經(jīng) 24 48個(gè)小時(shí)左右的適應(yīng)及吸潮過程，方可進(jìn)行授粉；或者在授粉前1天，先將花粉從液氮冷凍環(huán)境中取出，依次在_73°C、-20°C、4°C中分別放置24小時(shí)，然后平攤在潔凈的油光紙上，放入在陰暗、潮濕的環(huán)境中，經(jīng)24 48個(gè)小時(shí)左右的適應(yīng)及吸潮過程，方可進(jìn)行授粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述授粉的時(shí)間為所授品種的初花期，上午10點(diǎn)至下午4點(diǎn)花心柱頭上有分泌粘液的時(shí)期。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述的初花期為15 25%的花開放的時(shí)期。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述授粉的方法為人工點(diǎn)授法、噴粉法或液體噴霧授粉法。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述的人工點(diǎn)授法為將處理好的花粉與填充劑按質(zhì)量比13 5的比例配好充分拌勻裝入干燥的瓶中，用帶橡皮頭的鉛筆或鵝毛耳棒沾少許花粉，輕點(diǎn)初開花朵，一次授3-5朵花，每個(gè)花序點(diǎn)授2朵邊花，勿授弱花、梢頭花；所述的噴粉法是將花粉與填充劑按質(zhì)量比1 10 15的比例配好，經(jīng)拌勻混合，裝入噴粉器或授粉器中，對著盛花初期的樹均勻噴布；所述的液體噴霧授粉在純凈水或蒸餾水中加入花粉、尿素、砂糖、瓊脂粉、 硼砂，所述的凈水或蒸餾水花粉尿素砂糖瓊脂粉硼砂的質(zhì)量比為 1000 2 3 50 1 1，用超低容量噴霧器噴灑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的促使梨品種間授粉完全親和的方法，其特征在于所述的填充劑為滑石粉。
10.‘金墜梨’花粉作為“萬用花粉”在梨樹人工授粉中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物授粉生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種促使梨品種間授粉完全親和的方法。該方法是利用‘金墜梨’花粉作為萬能花粉對其他梨品種進(jìn)行人工授粉。由于‘金墜梨’雄蕊的特異性識(shí)別功能喪失，使得它和其它任一S基因型的梨品種授粉時(shí)均能表現(xiàn)為雜交親和。這一技術(shù)解決了梨樹人工授粉需選擇合適品種花粉的問題，并可改變目前市場上花樣繁多的梨花粉供應(yīng)局面，長期貯藏‘金墜梨’花粉種質(zhì)，能很好的解決梨在育種過程中花期不遇或異地授粉過程中花粉的供應(yīng)問題，并且該技術(shù)能進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，有著廣泛的花粉種質(zhì)供應(yīng)市場和良好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A01H1/02GK102487810SQ20111037183
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張紹玲, 陶書田, 齊開杰, 齊永杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)