專利名稱：桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及花粉介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體是桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
桑樹作為一種重要的經(jīng)濟(jì)植物，在蠶業(yè)、林業(yè)都有極其重要的地位。雜交育種與多倍體育種作為桑樹育種的主要方法，培育出了較多的優(yōu)良品種。但由于桑樹生長周期長，遺傳雜合性高，許多性狀的遺傳機(jī)理尚不明了，前述的育種方法很難定向培育出蠶桑所需要的新型品種，但桑樹基因(分子)育種具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可達(dá)此目的。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過植物基因工程的方法創(chuàng)造新品種成為可能。農(nóng)桿菌感染組培外植體作為目前最為有效的手段，在水稻、小麥等主要農(nóng)作物中得到廣泛應(yīng)用，但是在木本植物中獲得的轉(zhuǎn)基因植株較少，其主要原因在于該方法獲得的轉(zhuǎn)基因苗大多是嵌合體，要經(jīng)過第二代才能形成穩(wěn)定的品種，需要很長的時(shí)間，這不僅加長了育種周期，而且加大了育種難度；二是木本植物組培外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)較為困難。另外，農(nóng)桿菌感染組培外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究的另一局限，是那些組培困難的植物尚無法采用此途徑。到目前為止，尚無有關(guān)桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前桑樹組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化周期較長的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速高效的桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，該方法包括以下步驟
(1)桑樹花粉的收集
選取雄花花藥剛發(fā)白的剛進(jìn)入成熟期的雄花，常規(guī)方法收集花粉，置于冰箱4°C保存?zhèn)?br> 用；
(2)花粉與農(nóng)桿菌混合
將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD=L 5-2. 4之間，6，000 rpm離心5min收集菌體，采用感染培養(yǎng)基重懸菌體2次，最后稀釋0D=2. 0 ；稱取花粉與農(nóng)桿菌混合，比例為0. Ig :5ml，顛倒混勻；用抽真空的方式將含有載體的農(nóng)桿菌與花粉混合，即將花粉與農(nóng)桿菌混合置于真空泵中，0. 09倍標(biāo)準(zhǔn)大氣壓即9119 處理lOmin，然后常壓2_;3min， 再抽真空5min，即得花粉與農(nóng)桿菌混合液；
感染培養(yǎng)基1/2 MS 培養(yǎng)基；44nM 6-BA ；0. 02% Silwet L-77 ；5% 蔗糖；PH=5. 7-6. O
(3)授粉:
方式一先用未經(jīng)處理的普通花粉授粉于雌花后，立即滴注含有載體的農(nóng)桿菌菌液； 方式二 用毛筆將步驟(2)所得花粉與農(nóng)桿菌混合液授粉至桑樹雌花柱頭上；
(4)套袋處理
授粉完畢后雌花用硫酸紙?zhí)状幚?4h避免感雜，24-4 之內(nèi)補(bǔ)滴含有載體的農(nóng)桿菌菌液一次，再套袋Mh，待雌花完全受精后，再除去硫酸紙袋，改用細(xì)紗網(wǎng)罩住桑椹，直至果實(shí)成熟收集種子。上述方法步驟(2)中，將含有載體的農(nóng)桿菌與花粉混合的方式也可用常規(guī)的渦旋方式。上述方法中，選取雜交優(yōu)勢(shì)較好的雄樹上的雄花作雜交父本，如育2號(hào)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，湖桑39號(hào)X廣東桑，1971)、西大廣選(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東雜交桑、沙二 X倫109號(hào)，2006)等，雌花選取雜交優(yōu)勢(shì)較好，開花整齊，結(jié)實(shí)多的品種，如紅果 1號(hào)(陜西省桑蠶絲綢研究所，實(shí)生桑選育，2001)、紅果2號(hào)(西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所，自然芽變，2001 )、中桑5801號(hào)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，湖桑38號(hào)X廣東桑， 1958)等。上述品種均為公知公用桑樹品種。


圖1為轉(zhuǎn)基因種子在含有卡那霉素的雙蒸水中生長情況圖其中A圖為對(duì)照組，采用空白感染培養(yǎng)基混合花粉后授粉所得的種子，B圖為轉(zhuǎn)基因種子，圖中生長良好的植株為抗性植株。圖2為抗性植株的PCR檢測(cè)圖其中1-2泳道為陰性對(duì)照，第3_12泳道為抗性植株,第 13 泳道為 DNA maker (Trans2000)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
通過花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法可以省去組培外植體，它與常規(guī)育種方法一樣，直接借用花粉雜交便可完成植物遺傳轉(zhuǎn)化途徑，從而簡(jiǎn)化植物轉(zhuǎn)基因育種程序，并能縮短育種時(shí)間。 此外，該方法還能為那些組織培養(yǎng)困難的開花植物提供一種可行的遺傳轉(zhuǎn)化方法?；ǚ劢閷?dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法可應(yīng)用于其他開花植物的遺傳轉(zhuǎn)化、分子改良及獲得的轉(zhuǎn)基因品種。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 桑樹的遺傳轉(zhuǎn)化將標(biāo)記基因NPT II導(dǎo)入桑樹基因組中，具體步驟如下
(1)桑樹花粉的收集
取花藥剛發(fā)白的桑樹育2號(hào)雄花，鋪在經(jīng)消毒后的白紙上，在烘箱中保溫一天，輕輕撥開花藥，收集到經(jīng)消毒后的培養(yǎng)皿中，置冰箱4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)花粉與農(nóng)桿菌混合
將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD=L 5-2. 4之間，6，000 rpm離心5min收集菌體，采用感染培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基；44nM 6-BA ；0. 02% Silwet L-77 ;5%蔗糖；PH=5. 7-6. 0)重懸菌體2次，最后稀釋成0D=2. 0 ；稱取花粉與農(nóng)桿菌混合，比例為0. Ig 5ml，顛倒混勻；將花粉與農(nóng)桿菌混合液置于真空泵中，0. 09倍標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(9119Pa)處理 lOmin，然后常壓2-;3min，再抽真空5min ；
(3)授粉與套袋處理
用消毒后的毛筆將花粉與農(nóng)桿菌混合液授粉至紅果1號(hào)雌花柱頭上，然后用硫酸紙?zhí)状幚?4h避免感雜，24-48h之內(nèi)補(bǔ)授粉一次，再套袋Mh，待雌花完全受精后，再除去硫酸紙袋，改用細(xì)紗網(wǎng)罩住桑椹，直至果實(shí)成熟收集種子。轉(zhuǎn)基因苗的分子檢測(cè)實(shí)施例2 種子的抗性篩選將收集的種子在雙蒸水中浸泡M小時(shí)后取出，再置于含有50mg/ml卡那霉素的雙蒸水浸濕的棉花上，28°C光照培養(yǎng)，將生長狀態(tài)良好的小苗移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)。
實(shí)施例3 抗性植株的PCR檢測(cè)
采用CTAB法提取抗性植株幼嫩葉片的基因組，根據(jù)卡那霉素抗性基因NPT II的基因序列設(shè)計(jì)引物(引物序列為 NPT II-F 5，- TACCGTAAAGCACGAGGAAGC-3，，NPT II-R 5，-TATGACTGGGCACAACAGACA _3，，擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變性 4 min ;94°C變性 30 s，50°C退火 30 s，72°C延伸1 min，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min ；4°C保存)，對(duì)提取的基因組進(jìn)行擴(kuò)增， 最后從300株轉(zhuǎn)基因苗子中檢測(cè)到10株抗性植株，其中10株都有PCR陽性，轉(zhuǎn)基因效率為 3. 33%。
權(quán)利要求
1.一種桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)桑樹花粉的收集選取雄花花藥剛發(fā)白的剛進(jìn)入成熟期的雄花，常規(guī)方法收集花粉，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆茫?2)花粉與農(nóng)桿菌混合將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD=L 5-2. 4之間，6，000 rpm離心5min收集菌體，采用感染培養(yǎng)基重懸菌體2次，最后稀釋0D=2. 0 ；稱取花粉與農(nóng)桿菌混合，比例為0. Ig :5ml，顛倒混勻；用抽真空的方式將含有載體的農(nóng)桿菌與花粉混合，即將花粉與農(nóng)桿菌混合置于真空泵中，0. 09倍標(biāo)準(zhǔn)大氣壓即9119 處理lOmin，然后常壓2_;3min， 再抽真空5min，即得花粉與農(nóng)桿菌混合液；感染培養(yǎng)基1/2 MS 培養(yǎng)基；44nM 6-BA ；0. 02% Silwet L-77 ；5% 蔗糖；PH=5. 7-6. O(3)授粉:方式一先用未經(jīng)處理的普通花粉授粉于雌花后，立即滴注含有載體的農(nóng)桿菌菌液； 方式二 用毛筆將步驟(2)所得花粉與農(nóng)桿菌混合液授粉至桑樹雌花柱頭上；(4)套袋處理授粉完畢后雌花用硫酸紙?zhí)状幚?4h避免感雜，24-4 之內(nèi)補(bǔ)滴含有載體的農(nóng)桿菌菌液一次，再套袋Mh，待雌花完全受精后，再除去硫酸紙袋，改用細(xì)紗網(wǎng)罩住桑椹，直至果實(shí)成熟收集種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(2)中，將含有載體的農(nóng)桿菌與花粉混合的方式用常規(guī)的渦旋方式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，選用育2號(hào)或西大廣選作為父本，選用紅果1號(hào)、紅果2號(hào)或中桑5801號(hào)作為母本。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桑樹花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，該方法通過桑樹花粉的收集與保存、農(nóng)桿菌與花粉的混合、桑樹授粉等步驟實(shí)現(xiàn)。與常規(guī)育種方法一樣，該方法直接借用花粉雜交便可完成植物遺傳轉(zhuǎn)化途徑，從而簡(jiǎn)化植物轉(zhuǎn)基因育種程序，并能縮短育種時(shí)間。此外，該方法還能為那些組織培養(yǎng)困難的開花植物提供一種可行的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
文檔編號(hào)A01H5/10GK102392045SQ20111037721
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者余茂德, 吳存容, 張瓊予, 李軍, 李鎮(zhèn)剛, 王茜齡, 祝娟娟, 趙愛春, 金筱耘 申請(qǐng)人:西南大學(xué)