專利名稱：一種提高紫花苜蓿組織培養(yǎng)效率的方法
一種提高紫花苜蓿組織培養(yǎng)效率的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過(guò)開(kāi)發(fā)了新的組培技術(shù)方法，重點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)步驟中種子消毒和愈傷組織形成與分化兩大技術(shù)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)與創(chuàng)新，從而獲得高效、低毒、低褐化的苜蓿組培新技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是重要的豆科牧草，因其具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”。紫花苜蓿組織培養(yǎng)主要是指是利用苜蓿離體器官(子葉、 胚根等)，通過(guò)人工培養(yǎng)，進(jìn)行植株再生的技術(shù)方法。該方法對(duì)于苜蓿珍貴遺傳材料的繁殖、 保存與苜蓿轉(zhuǎn)基因植物培育等方面具有重要意義。苜蓿組培技術(shù)主要包括五個(gè)步驟外植體培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體形成與芽分化、根誘導(dǎo)、再生植株。
目前苜蓿組織培養(yǎng)中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基一般采用單一植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，該方法雖然簡(jiǎn)單，但愈傷組織分化慢、分化率低、愈傷組織質(zhì)量也較差。例如，舒文華等(舒文華，耿華珠，閆倫興等，紫花苜蓿胚軸愈傷組織培養(yǎng)與植株再生，草業(yè)科學(xué)，1993， 10(3) :65-67)以和田苜蓿為材料，通過(guò)單一 2，4-W2，4-二氯苯氧乙酸)激素誘導(dǎo)愈傷，出愈率為81 %，愈傷形成需7 8天，每塊愈傷平均出芽數(shù)0. 75 1. 0個(gè)；
此外，梁慧敏等(梁慧敏，黃劍，夏陽(yáng)等，苜蓿組織培養(yǎng)高頻率再生體系的建立，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11 (3) =321-322)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，胚狀體誘導(dǎo)率58% ；
此外，肖荷霞(肖荷霞，苜蓿轉(zhuǎn)化再生體系的建立及LEA-3基因研究D，河北大學(xué)，200 研究發(fā)現(xiàn)，以下胚軸、莖、葉為材料進(jìn)行培養(yǎng)，其中下胚軸效果最好，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2. Omg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6-BA，胚狀體誘導(dǎo)率45%，褐化率為22%。
此外，趙金梅(趙金梅，李芳，周禾等，紫花苜蓿組織培養(yǎng)體系的建立，核農(nóng)學(xué)報(bào)， 2010,24(3) :507-51 研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，形成兩種方法。其方法一苜蓿愈傷組織后期分化率最高可達(dá)90%，但早期愈傷組織誘導(dǎo)困難，黃色、水漬狀，質(zhì)量較差，而且褐化率高達(dá)為25%。其方案二苜蓿早期愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，且呈黃綠色，疏松、質(zhì)量高。但該方法形成的愈傷組織后期分化率低，僅為10%，褐化也將為嚴(yán)重。
此外，徐春波等(CN101946711A)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，苜蓿愈傷組織后期誘導(dǎo)率達(dá)85%，但愈傷組織呈黃色、水漬狀，質(zhì)量較差。褐化率高達(dá)為33%。后期分化率也較低， 僅為63%。
盡管紫花苜蓿再生體系已趨于成熟，但仍存在兩大關(guān)鍵技術(shù)難題
(1)種子消毒當(dāng)前種子消毒方法，要不消毒效果好，但對(duì)種子損傷大，影響種子萌發(fā)；要不對(duì)種子損傷小，但效果差，容易出現(xiàn)污染，致使組培失敗；
(2)愈傷組織形成與分化目前技術(shù)體系早期紫花苜蓿愈傷組織形成速度慢、胚性愈傷組織少，中后期胚狀愈傷分化速度慢、出芽少、褐化現(xiàn)象嚴(yán)重等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響苜蓿組織效率乃至成敗。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，雖然愈傷組織質(zhì)量和分化率有所提高，但仍存在要么是高質(zhì)量愈傷組織，低愈傷組織分化；要么是高愈傷組織分化率，低愈傷組織誘導(dǎo)效率的關(guān)鍵技術(shù)難題。因此，開(kāi)發(fā)一種新的高效培養(yǎng)技術(shù)方法，既能保證高的愈傷組織誘導(dǎo)率，又能保證高的愈傷組織分化率，是十分必要的。
因此，開(kāi)展一種高效、低毒的種子消毒技術(shù)方法是十分必需的；同時(shí)，在愈傷組織形成與分化階段需要開(kāi)發(fā)一種技術(shù)方法，既能在早期促進(jìn)苜蓿愈傷組織的形成，又能提高胚性愈傷的分化能力，降低褐化率。
本發(fā)明重點(diǎn)圍繞這兩大技術(shù)難題，開(kāi)發(fā)了新的組培技術(shù)方法，重點(diǎn)對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)難題進(jìn)行改進(jìn)與創(chuàng)新，從而獲得高效、省時(shí)、低毒、低褐化的苜蓿組培新技術(shù)方法。發(fā)明內(nèi)容
目前苜蓿組織培養(yǎng)中，主要存在外植體污染嚴(yán)重、愈傷組織形成和分化不足這兩大技術(shù)難題，這導(dǎo)致苜蓿組培誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)、效率低、質(zhì)量差、褐化嚴(yán)重等問(wèn)題。
外植體污染嚴(yán)重主要是由于種子消毒不徹底造成的。目前種子消毒方法主要分為升汞消毒法、次氯酸鈉消毒法和雙氧水消毒法三種(參見(jiàn)表1)。其中升汞消毒法消毒效果最好，但毒性大，對(duì)種子損傷嚴(yán)重，不利用后期外植體培養(yǎng)；次氯酸鈉消毒效果僅次于升汞， 但也有一定毒性。如果消毒時(shí)間過(guò)短，則存在消毒不徹底，種子污染嚴(yán)重的問(wèn)題；如果消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同樣也造成種子損傷；雙氧水對(duì)種子損傷最小，但消毒效果不理想，種子污染嚴(yán)重。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明通過(guò)采用升汞與雙氧水復(fù)合消毒法，實(shí)現(xiàn)既消毒效果徹底，污染率低，又對(duì)種子損傷最小的目的，最終解決當(dāng)前外植體污染嚴(yán)重的問(wèn)題。
表1 不同消毒方法對(duì)苜蓿種子萌發(fā)及種苗生長(zhǎng)的影響
消毒方法種子數(shù)發(fā)芽率污染率畸變率發(fā)芽時(shí)間升汞消毒法10053%5%15%10-15天次氯酸鈉消毒法10085%45%2%7-10 天雙氧水消毒法10080%10%5%7-10 天
同時(shí)，紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)過(guò)程中，存在愈傷組織形成慢，胚狀體誘導(dǎo)率低，出芽數(shù)少，分化率低，褐化嚴(yán)重，一般愈傷組織出現(xiàn)需要5 7天時(shí)間，最終胚狀體誘導(dǎo)率50%，愈傷褐化嚴(yán)重，褐化率高達(dá)20 60%。目前苜蓿組培愈傷誘導(dǎo)主要使用的是2， 4-D或KT。使用2，4-D，愈傷組織誘導(dǎo)率低、形成速度慢；如果加大使用量，因2，4-D是一種生長(zhǎng)抑制劑，不利于胚狀體分化與芽的形成，而且還容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，導(dǎo)致組培失敗。
本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化激素配比與組培技術(shù)流程，形成新的技術(shù)方法，本技術(shù)首次采用 TDZ+6-BA配合使用的方法，不僅可以顯著提高愈傷誘導(dǎo)率、形成速率，提高愈傷質(zhì)量，而且還最大限度保留了愈傷組織的分化能力，促進(jìn)胚狀體芽的形成。該技術(shù)出愈快、愈傷組織質(zhì)量好、褐化率低，可以解決當(dāng)前愈傷培養(yǎng)存在的出愈時(shí)間長(zhǎng)、質(zhì)量差，褐化嚴(yán)重的技術(shù)難題。 應(yīng)用該技術(shù)后，愈傷誘導(dǎo)時(shí)間為3天，縮短40%;愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，且愈傷組織呈黃4綠色，疏松、質(zhì)量較高；后期愈傷組織分化率達(dá)75%，褐化情況基本消失。本發(fā)明的目的是提供了一種紫花苜蓿的組織培養(yǎng)方法，其由種子滅菌及無(wú)菌苗的獲得、外植體培養(yǎng)、愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)、胚狀體的誘導(dǎo)、胚性愈傷的分化、生根培養(yǎng)階段組成，具體制各步驟如下選取健壯幼苗，截取下胚軸，將其切成Icm小段，置于愈傷培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)4周，將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-8天；將愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體的形成，培養(yǎng)7-10天，每隔Mh，更換一次培養(yǎng)基。將誘導(dǎo)出的胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4周。將分化出的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4周而得，愈傷培養(yǎng)基配方為SH+2，4-D(2. Omg/ L)+6-BA(0.5mg/L)+瓊脂(7.5g/L) +蔗糖(30g/L)；繼代培養(yǎng)基配方為 SH+2，4_D (2. Omg/ L) +6-BA (0. 25mg/L) +TDZ (0. 25mg/L) +7. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖；胚狀體培養(yǎng)基配方 MS0+NAA (1. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/L) + 水解酪蛋白 Gg/L) +7. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖；分化培養(yǎng)基 MS0+NAA (1. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/L) + 瓊脂(7. 5g/L) + 蔗糖(30g/L)；生根培養(yǎng)基配方為 1/2MS+ 瓊脂(7. 5g/L) + 蔗糖(30g/L)。本發(fā)明的另一個(gè)目的就是提供一種苜蓿種子的滅菌方法，具體步驟如下選取籽粒飽滿的種子，75 %酒精浸泡Imin后，1 %升汞浸泡5min，接著30 %過(guò)氧化氫浸泡30min，然后用蒸餾水沖洗3-4次，將沖洗干凈的種子放在濾紙上吸干水，接種于固體培養(yǎng)基中(pH = 6. 0)，固體培養(yǎng)基配方MS+7. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖；培養(yǎng)條件25°C，光照強(qiáng)度25001k，分為光暗周期16/8h，培養(yǎng)5-7天。綜上所述，本發(fā)明不僅對(duì)種子消毒過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，采用升汞和過(guò)氧化氫混合滅菌法，該方法不僅消毒效果好，種子污染率低；而且對(duì)苜蓿種子損傷小，處理后種子2-3天即可萌發(fā)；還首次采用TDZ+6-BA配合使用的方法，不僅可以顯著提高愈傷誘導(dǎo)率、形成速率，提高愈傷質(zhì)量，而且還最大限度保留了愈傷組織的分化能力，促進(jìn)胚狀體芽的形成。以上概括的描述了本發(fā)明，可通過(guò)參照本文提供的某些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。對(duì)其中的一些本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基及其成分進(jìn)行了闡釋如下SOC培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨209克，酵母提取物59克，NaCl 0. 59 克，250mmol/L KCL 溶液 IOml, ρΗ7· 0。臨用前加人 2mol/L MgCl2 溶液 5ml 禾口 lmol/L 葡萄糖溶液20ml。SH培養(yǎng)基硝酸鉀Q830mg/L)，硝酸銨(46;3mg/L)，七水合硫酸鎂(185mg/L)，二水合氯化鈣(166mg/L)，磷酸二氫鉀GOOmg/L)，七水合硫酸鋅(8. 6mg/L)，二水合鉬酸鈉 (0. 25mg/L)，五水合硫酸銅(0. 025mg/L)，六水合氯化鈷(0. 025mg/L)，鹽酸吡哆醇(9. 5mg/ L)，鹽酸硫胺素(9. 9mg/L)，煙酸(4. 5mg/L)，乙二胺四乙酸二鈉(37. 3mg/L)，七水合硫酸亞鐵(27. 8mg/L)。MSO培養(yǎng)基硝酸鉀(1900mg/L)，硝酸銨(1650mg/L)，七水合硫酸鎂(370mg/L)， 二水合氯化鈣(440mg/L)，磷酸二氫鉀(170mg/L)，四水合硫酸錳3mg/L)，七水合硫酸鋅(8. 6mg/L)，硼酸(6. 2mg/L)，碘化鉀(0. 83mg/L)，二水合鉬酸鈉(0. 25mg/L)，五水合硫酸銅(0.025mg/L)，六水合氯化鈷(0. 025mg/L)，肌醇(100mg/L)，鹽酸吡哆醇(1. 0mg/L)， 鹽酸硫胺素(10. 0mg/L)，煙酸(1. 0mg/L)，乙二胺四乙酸二鈉(37. :3mg/L)，七水合硫酸亞鐵 (27. 8mg/L)。
MS培養(yǎng)基硝酸鉀(1900mg/L)，硝酸銨(1650mg/L)，七水合硫酸鎂(370mg/L)，二水合氯化鈣(440mg/L)，磷酸二氫鉀(170mg/L)，四水合硫酸錳3mg/L)，七水合硫酸鋅 (8. 6mg/L)，硼酸(6. 2mg/L)，碘化鉀(0. 83mg/L)，二水合鉬酸鈉(0. 25mg/L)，五水合硫酸銅 (0. 025mg/L)，六水合氯化鈷(0. 025mg/L)，肌醇(100mg/L)，甘氨酸(2. Omg/L)，鹽酸吡哆醇 (0. 5mg/L)，鹽酸硫胺素(0. lmg/L)，煙酸(0. 5mg/L)，乙二胺四乙酸二鈉(37. 3mg/L)，七水合硫酸亞鐵、2 . 8mg/L)。苯基噻二唑基脲(TDZ)—種新興的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。2，4-二氯苯氧乙酸Q，4-D)—種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成。6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)—種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成。a-萘乙酸(NAA)—種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成。N6-呋喃甲氨基嘌呤(KT):又名激動(dòng)素，一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成。


圖1 紫花苜蓿的組織培養(yǎng)效果對(duì)比，左圖(L)為使用前愈傷組織，右圖(R)為使用該技術(shù)后的愈傷組織；圖2 紫花苜蓿的組織培養(yǎng)效果圖，A 無(wú)菌苗；B 愈傷組織誘導(dǎo)；C 胚狀體誘導(dǎo)； D 不定芽形成；E 分化植株；F 再生植株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.種子滅菌及無(wú)菌苗的獲得選取籽粒飽滿的種子，75 %酒精浸泡Imin后，1 %升汞浸泡5min，接著30 %過(guò)氧化氫浸泡30min，然后用蒸餾水沖洗3-4次，將沖洗干凈的種子放在濾紙上吸干水，接種于固體培養(yǎng)基中(pH = 6. 0)。培養(yǎng)基配方MS+瓊脂(7. 5g/L) +蔗糖(30g/L)。培養(yǎng)條件，25°C， 光照強(qiáng)度25001k，分為光暗周期16/8h，培養(yǎng)5-7天。通過(guò)采用升汞與雙氧水復(fù)合消毒法，實(shí)現(xiàn)既消毒效果徹底，污染率低，又對(duì)種子損傷最小的目的，最終解決當(dāng)前外植體污染嚴(yán)重的問(wèn)題。2.愈傷組織的誘導(dǎo)選取健壯幼苗，截取下胚軸(根上部分莖以下部分)。將其切成Icm小段，置于愈傷培養(yǎng)基培養(yǎng)。愈傷培養(yǎng)基配方SH+2，4-D (2. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/L) +7. 5g/L瓊脂+30g/ L蔗糖。培養(yǎng)四周。(參見(jiàn)圖1)。3.愈傷組織的繼代將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。愈傷組織產(chǎn)生后，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。愈傷培養(yǎng)基配方SH+2，4-D(2. Omg/L)+6-BA(0. 25mg/L) +TDZ (0. 25mg/L) +7. 5g/L 瓊脂+30g/L蔗糖。培養(yǎng)條件，25°C，光照強(qiáng)度25001k，分為光暗周期16/8h，培養(yǎng)5_8天。4.胚狀體的誘導(dǎo)將愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體的形成。胚狀體培養(yǎng)基配方 MS0+NAA(1. Omg/L)+6-BA (0. 5mg/L)+ 水解酪蛋白(4g/L)+7. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖。培養(yǎng)7-10天，每隔Mh，更換一次培養(yǎng)基。5.植物組織的分化將誘導(dǎo)出的胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基MS0+NAA(1. Omg/ L) +6-BA (0. 5mg/L) +7. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖。連續(xù)培養(yǎng) 4 周。6.生根培養(yǎng)將分化出的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基1/2MS+7. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖。連續(xù)培養(yǎng)4-5周，整個(gè)紫花苜蓿的培養(yǎng)過(guò)程參見(jiàn)圖2。應(yīng)用該技術(shù)后，愈傷誘導(dǎo)時(shí)間為3天，縮短40% ；胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)到90%，增加 40% ；褐化情況基本消失，褐化率降低20%。而且愈傷不定芽的形成數(shù)量增加，增加近150% (出芽數(shù)從1. 0個(gè)/每塊愈傷增加到2. 1個(gè)/每塊愈傷)，出芽時(shí)間縮短30%。
權(quán)利要求
1.一種紫花苜蓿的組織培養(yǎng)方法，其特征在于其由種子滅菌及無(wú)菌苗的獲得、外植體培養(yǎng)、愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)、胚狀體的誘導(dǎo)、胚性愈傷的分化、生根培養(yǎng)階段組成，具體制備步驟如下選取健壯幼苗，截取下胚軸，將其切成Icm小段，置于愈傷培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)4周，將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-8天；將愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體的形成，培養(yǎng)7-10天，每隔Mh，更換一次培養(yǎng)基。將誘導(dǎo)出的胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4周。將分化出的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)， 連續(xù)培養(yǎng)4周而得，愈傷培養(yǎng)基配方為SH+2，4-D(2. 0mg/L)+6-BA(0. 5mg/L)+瓊脂(7. 5g/ L) + 蔗糖(30g/L)；繼代培養(yǎng)基配方為 SH+2，4-D(2. Omg/L) +6-BA(0. 25mg/L) +TDZ (0. 25mg/ L)+7. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖；胚狀體培養(yǎng)基配方MS0+NAA(1. Omg/L)+6-BA (0. 5mg/L) + 水解酪蛋白 Gg/L) +7. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖；分化培養(yǎng)基 MSO+NAA (1. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/ L)+瓊脂(7.5g/L) +蔗糖(30g/L)；生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+瓊脂(7.5g/L) +蔗糖(30g/ L)。
2.—種權(quán)利要求1中所述的紫花苜蓿的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，種子滅菌的具體步驟為選取籽粒飽滿的種子，75%酒精浸泡Imin后，升汞浸泡5min，接著30%過(guò)氧化氫浸泡30min，然后用蒸餾水沖洗3-4次，將沖洗干凈的種子放在濾紙上吸干水，接種于固體培養(yǎng)基中(pH = 6. 0)，固體培養(yǎng)基配方MS+7. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖；培養(yǎng)條件25°C， 光照強(qiáng)度25001k，分為光暗周期16/8h，培養(yǎng)5-7天。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過(guò)開(kāi)發(fā)了新的組培技術(shù)方法，重點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)步驟中種子消毒和愈傷組織形成與分化兩大技術(shù)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)與創(chuàng)新，本發(fā)明通過(guò)采用升汞與雙氧水復(fù)合消毒法，實(shí)現(xiàn)既消毒效果徹底，污染率低，又對(duì)種子損傷最小的目的，最終解決當(dāng)前外植體污染嚴(yán)重的問(wèn)題；同時(shí)，首次采用TDZ+6-BA配合使用的方法，不僅可以顯著提高愈傷誘導(dǎo)率、形成速率，提高愈傷質(zhì)量，而且還最大限度保留了愈傷組織的分化能力，促進(jìn)胚狀體芽的形成，從而獲得高效、省時(shí)、低毒、低褐化的苜蓿組培新技術(shù)方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102499094SQ20111037753
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者任衛(wèi)波, 劉雅學(xué), 張文靜, 李晶, 王茅雁, 解繼紅, 趙海霞, 郭慧琴 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所