專利名稱：小麥甲羥戊酸激酶基因TaMVK及其分離克隆、酶活性測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種從小麥品種玉麥中獲得的，參與小麥葉綠素、類胡蘿卜素、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素、長萜醇、類萜、輔酶Q、留醇和植物毒素等類異戊二烯物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶基因甲羥戊酸激酶基因TaMVK的分離克隆、酶蛋白的原核表達、 酶蛋白的分離純化及其酶活性的體外檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
類異戊二烯物質(zhì)存在于所有生物體中，在植物中含量尤其豐富，是維持植物生長發(fā)育、光合作用等所必需的重要有機物質(zhì)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 3萬余種植物類異戊二烯， 而且這個數(shù)字還在逐年增加。該類物質(zhì)在生物體中具有各種不同的作用，可作為光合色素 (如葉綠素、類胡蘿卜素)、生長物質(zhì)和植物激素(細胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內(nèi)酯)、膜結(jié)構(gòu)的一部分如谷留醇、電子傳遞受體如質(zhì)體醌、作為葡萄糖基化反應中葡萄糖的受體如多萜醇，并能調(diào)控細胞的生長(如異戊烯基蛋白，細胞分裂素)。此外，很多植物類異戊二烯還具有重要的商業(yè)價值如作為食物香料、飲料、維生素A、D、E，天然殺蟲劑如除蟲菊素和橡膠等。類異戊二烯物質(zhì)的生物合成主要由甲羥戊酸途徑中的一系列酶酶促合成的，甲羥戊酸激酶(MVk，MK ；ATP :mevalonate-5-phosphotransferase ；EC2. 7. 1. 36)是該代謝途徑中三個連續(xù)ATP依賴酶中的第一個，它將ATP γ位上的一個磷酸基團轉(zhuǎn)移到甲羥戊酸第5 位的羥基上形成甲羥戊酸-5-磷酸，并伴隨著ADP的釋放，是控制整個代謝途徑的限速酶之一。目前已分別從擬南芥(Arabidopsis thaiiana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、檢膠(Hevea brasiliensis)、蓖麻(Ricinus communis)等植物中分離克隆了甲羥戊酸激酶基因，但是現(xiàn)有技術(shù)中還沒有成功的從小麥品種中分離出甲羥戊酸激酶基因的先例，因此制約了克隆甲羥戊酸激酶基因在小麥生產(chǎn)中的應用。在本發(fā)明申請之前，還沒有公開或發(fā)表過關(guān)于從任何一種小麥(Triticum aestivum)品種中分離克隆甲羥戊酸激酶基因TaMVK、編碼蛋白酶的原核基因表達、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學參數(shù)等研究資料信息。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中在小麥中甲羥戊酸激酶基因相關(guān)技術(shù)的缺失，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一整套關(guān)于小麥，特別是小麥品種“玉麥”甲羥戊酸激酶基因TaMVK克隆、編碼蛋白酶的原核基因表達、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學參數(shù)測定的技術(shù)。測得自小麥品種玉麥甲羥戊酸激酶的Vmax為56. 5士5. 6 μ mol/min/mg, Kcat為65. 3士6. 5S-1， Kcat/KM 為 1. OxlO5M-1S-1,甲羥戊酸的 Km 值為 622 士 167 μ Μ, ATP 的 Km 值為 246. 7 士49. 5 μ Μ， 證明克隆的小麥酶基因具有天然生物學活性。本發(fā)明為進一步構(gòu)建甲羥戊酸激酶基因的真核生物基因表達載體并轉(zhuǎn)化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討甲羥戊酸激酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產(chǎn)物、籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對甲羥戊酸激酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標記提供重要技術(shù)儲備。本發(fā)明所提供的小麥甲羥戊酸激酶基因TaMVK編碼區(qū)基因序列如kq ID No:l所示，其編碼的氨基酸序列如ID No:2所示。上述的小麥甲羥戊酸激酶基因TaMVK是從小麥品種玉麥中獲得的，該基因的cDNA 長度為1306bP，編碼區(qū)長度為1167bp，編碼一條包含388aa的多肽，分子量約為46kDa ；發(fā)明人經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn)小麥育成品種濟南13和玉麥中甲羥戊酸激酶氨基酸序列存在6個氨基酸殘基的差別，有2處出現(xiàn)在保守區(qū)1和保守區(qū)2中，即第25位和154位氨基酸殘基在濟南13中分別為丙氨酸和纈氨酸，而在玉麥中則分別變?yōu)槔i氨酸和丙氨酸。 另有4處氨基酸殘基性質(zhì)出現(xiàn)明顯的差異，如第38位氨基酸殘基在濟南13中為帶正電荷的組氨酸，而在玉麥中則變?yōu)橹行缘牧涟彼幔坏?8位氨基酸殘基在濟南13中為帶羥基的絲氨酸，而在玉麥中則變?yōu)樘砑右粋€甲基的蘇氨酸；第75位氨基酸殘基在濟南13中為中性的纈氨酸，而在玉麥中則變?yōu)閹ж撾姾傻墓劝彼?；?60位氨基酸殘基在濟南13中為帶正電荷的精氨酸，而在玉麥中則變?yōu)閹Яu基的絲氨酸，從小麥育成品種濟南13和玉麥中獲得的甲羥戊酸激酶經(jīng)克隆獲得的小麥甲羥戊酸激酶基因具有天然生物學活性。發(fā)明人進一步公開了該基因的分離克隆、編碼蛋白酶的原核基因表達、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學參數(shù)測定的技術(shù)，具體如下具體的分離克隆方法為1.小麥葉片RNA的分離提取根據(jù)TaKaRa廣譜型total RNA提取試劑盒(Takara RNAisoTm Plus)的說明書進行。獲得的RNA保存在DEPC水中備用。2. cDNA第一條鏈的合成按照PrimeScriptTm 1st Strand cDNA Synthesis kit 的說明書進行合成。3.基因中間序列擴增、連接與轉(zhuǎn)化根據(jù)已知部分小麥MVK的EST序列，用ft~imer5. 0引物設計軟件和DNAMAN軟件設計引物，上游引物為WmvkF :5' GTTGGCGGAACGGAGTGGCA 3'，基因序列如kq ID No :3所示；下游引物為WmvkR :5' CGACTTTGAAGCAGCGGAAACCAT3‘，基因序列如 kq ID No :4 所示。進行 PCR，利用 DNA 膠回收試劑盒 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2. 0 回收特異條帶。將回收的DNA片段和pGEM-T Easy Vector進行連接。利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH 5 α，挑取陽性克隆，制備質(zhì)粒DNA并進行DNA測序，通過NCBI比對獲得目的基因片段。4.利用RACE技術(shù)快速獲得基因末端序列4. IRACE 引物設計通過DNAMAN比對所獲得的目的基因中間序列，以及橡膠(AB29469!3)、擬南芥 (X77793、NM_12^27. 4)、褐家鼠(NM_031063)、小家鼠(匪_02；3556)、玉米(BT062051. 1)、水稻(ΝΜ001070895)、高粱(XM 002453136. 1)的基因序列，尋找最保守的區(qū)域，用DNAMAN手工設計引物序列為5' RACE 引物5' CCATGCACTGGAGCAAACCTTGG 3'，基因序列如 kq ID No :5 所不；3' RACE 引物；5' TGGTAGGAACACCAAGGCTCTGGT 3‘，基因序列如 kq ID No :6 所示；4. 2基因末端序列快速擴增根據(jù)Clontech Laboratories INC 的 SMARTTm RACE cDNA Amplification kit 的方法快速擴增基因的5'和3'末端，篩選重組子，并測序。4. 3基因中間序列和RACE序列使用Contig Express 9. 1拼接全長序列，然后對所得的contig序列進行人工校對。5基因全長序列的擴增5.1基因全長引物的設計根據(jù)中間序列和RACE序列contig結(jié)果，設計全長擴增引物。上游引物序列為WfsmvkF:5' ATGGAGATCCGCGCCCGCGCGCCCGGCAAGA 3'，基因序列如kqlD No 7所示下游引物序列為MVKfslR:5' GACTGGCAAACTCGCTTATT3 ‘，基因序列如 kq ID No 8所示；5. 2全長基因的PCR擴增以第一鏈cDNA為模板擴增全長目的基因，進行全長基因PCR產(chǎn)物的膠回收、連接、 轉(zhuǎn)化、PCR重組子檢測、質(zhì)粒提取和測序。6基因的原核表達6. 1基因原核表達引物設計根據(jù)所得的全長序列測序結(jié)果，利用DNAMAN軟件把所得的基因序列翻譯成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物甲羥戊酸激酶氨基酸序列進行比對來確定小麥甲羥戊酸激酶基因的0RF，設計連入pLMl表達載體的引物。在基因的5'端，設計帶有核糖體結(jié)合位點 (AGGAGGA)、限制性內(nèi)切酶BamHI酶切位點(GGATCC)、起始密碼子、6個組氨酸密碼子以及含有甲羥戊酸激酶基因中編碼6個氨基酸的正向引物5 ‘ CGCGCGGATCCAGGAGGAATTTAAAATGA GAGGATCGCATCATCACCACCATCAC GAG ATC CGC GCC CGC GCGC 3'，基因序列如義。ID No 9 所示；在基因的3'端，設計具有限制性內(nèi)切酶MlI酶切位點(GTCGAC)、終止密碼子(TTA) 以及含有編碼9個氨基酸的反向引物5' CTGCAGGTCGACTTA TCCTTG GTG AAT CTG AAG ACC TTG 3'，基因序列如kq ID No :10所示。6. 2基因原核表達載體的構(gòu)建包括基因原核表達序列PCR擴增產(chǎn)物的酶切、酶切產(chǎn)物與載體的連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆重組子PCR鑒定、酶切鑒定、質(zhì)粒DNA提取、DNA測序驗證。6. 3甲羥戊酸激酶基因表達首先進行甲羥戊酸激酶蛋白表達條件的優(yōu)化，包括IPTG濃度、誘導溫度的優(yōu)化等。根據(jù)確定的優(yōu)化條件，進行甲羥戊酸激酶蛋白的大量表達。7甲羥戊酸激酶蛋白的純化利用離子交換柱分離純化甲羥戊酸激酶蛋白。過柱純化的蛋白質(zhì)，裝于透析袋中在一定溶液中透析去鹽，純化的蛋白質(zhì)于_86°C保存?zhèn)溆谩?采用丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶偶聯(lián)反應的方法測定甲羥戊酸激酶活性檢測
測得自小麥品種玉麥甲羥戊酸激酶的Vmax為56. 5士5. eymol/min/mg，Kcat為 65.3 士 6. 5S-1，Kcat/KM 為 1. OxlO5M^S"1,甲羥戊酸的 Km 值為 622 士 167μΜ，ATP 的 Km 值為 246. 7士49. 5 μ Μ，證明克隆的酶基因具有天然生物學活性。本發(fā)明為進一步構(gòu)建甲羥戊酸激酶基因的真核生物基因表達載體并轉(zhuǎn)化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討甲羥戊酸激酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產(chǎn)物、籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量， 以及對甲羥戊酸激酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標記提供重要技術(shù)儲備。


圖1為小麥三葉期葉片RNA電泳圖譜，圖中1為DNA Marker I ;2為0. 2 μ L小麥濟南13的RNA樣品；3為0. 2 μ L中國春小麥RNA樣品；4為0. 2 μ L小麥地方品種玉麥RNA樣品；圖2為小麥甲羥戊酸激酶基因中間序列PCR產(chǎn)物電泳圖譜，圖中1為IOObp DNA maker ；2-3為小麥濟南13甲羥戊酸激酶基因中間序列的PCR 產(chǎn)物；4-5為小麥地方品種玉麥甲羥戊酸激酶基因中間序列的PCR產(chǎn)物；6-7為中國春小麥甲羥戊酸激酶基因中間序列的PCR產(chǎn)物；圖3為玉麥TaMVK氨基酸序列與小麥品種“濟南13” TaMVK氨基酸序列比較圖，圖中A為玉麥TaMVK氨基酸序列示意圖，B為小麥品種“濟南13” TaMVK氨基酸序列示意圖；圖4為原核基因表達載體pLMl結(jié)構(gòu)示意圖，圖中Ampcilin表示氨芐青霉素抗性，T7promoter為啟動子，poly linker為多克隆位點，EcoRI和Hind III為多克隆位點邊緣的限制性內(nèi)切酶；圖5為純化的小麥地方品種玉麥甲羥戊酸激酶蛋白SDS-PAGE電泳圖，圖中1為!^rmentas預染蛋白marker ；2為純化的第一管蛋白；3為純化的第二管蛋白；4為純化的第三管蛋白；圖6為丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶偶聯(lián)反應檢測小麥甲羥戊酸激酶活性示意圖。
具體實施例方式實施例1 (小麥葉片RNA提取)(1)用蛭石于恒溫培養(yǎng)箱)培養(yǎng)小麥品種玉麥長至三葉期。(2)液氮中將葉片研磨至粉末狀，移到DEPC處理的EP管中。(3)加入適量 RNAiso Plus。(4)室溫下靜置5min。(5)加入l/5RNAiso Plus體積的氯仿。振蕩至乳白狀。(6)室溫下靜置5Hiin。(7) 12000g，4°C 離心 15min。(8)上清移到新的DEPC處理的EP管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻。室溫下靜置lOmin。
6
(9) 12000g，4°C離心 lOmin。(10)向沉淀中加入ImL用DEPC水配制的75%乙醇。I2OOOg 4°C離心5min。(11)保留沉淀，通風櫥中干燥至無色。(12)加入40 μ L DEPC水溶解。半小時后分裝并電泳檢測。取0. 5 μ L和0. 8 μ L RNA樣品，1. 0%瓊脂糖非變性凝膠電泳，電壓140V，電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照紀錄，如圖1所示。實施例2 (cDNA第一條鏈的合成)(1)在DEPC處理的PCR管中依次加入
Oligo dT Primer (5. Oum) 1 μ L dNTP mixture (IOmM) 1 μ L Rnase free water5 μ L
Total RNA3 μ (2)在PCR儀上運行；65°C 5min然后冰上急冷。(3)在PCR管中加入
5 χ Primerscriptlni Bf4 μ L
RNase inhibitor (40U/ μ )0. 5 μ LPrimerscriptlni Rtase ( 200U/ μ L ) 1 μ L
Rnase free water4. 5 μ L
上述退火反應液_10 μ
20 μ (4)在 PCR 儀上進行42°C 60min, 70°C 15min實施例3 (中間序列擴增)1中間序列的引物設計用ft~imer5. 0引物設計軟件和DNAMAN軟件，根據(jù)部分小麥甲羥戊酸激酶EST序列設計引物。上游引物為WmvkF:5' GTTGGCGGAACGGAGTGGCA 3‘ (Seq ID No 3)下游引物為WmvkR:5' CGACTTTGAAGCAGCGGAAACCAT3 ‘ (Seq ID No 4)PCR 體系為water 9. 3 μ L、IOx PCR buffer 1· 5 μ L、dNTP 0· 7 μ L、ΡΙΟ. 6 μ L、Ρ2 0. 6 μ L> LATag 0· 3μ L0PCR 程序為94°C 5min、94°C 45s、68°C 45s,72°C 90s,72°C lOmin，32cycles。2中間序列的PCR結(jié)果檢測取8 μ L PCR擴增產(chǎn)物與IyL溴酚藍混勻，點入1.5%瓊脂糖凝膠中，在120V電壓下電泳45min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相，如圖2所示，以檢查是否擴到目的片段，以便進行連接和測序。3擴增片段的回收PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠(TaKaRa Agarose, 1. 5 %濃度)電泳，在紫外燈(波長302nm)下觀察，割取目的DNA條帶。以DNA膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer2. 0，大連寶生物產(chǎn)品)回收特異條帶。(1)在紫外燈下用干凈、無菌手術(shù)刀片切除含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體，此時應注意盡量切除不含有目的DNA部分的凝膠。(2)向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer。(3)混勻后75°C加熱融化膠塊，此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化(約6 IOmin)。(4)加入DR-I Buffer 體積量的DR-II Buffer，吹吸混勻，當分離400bp左右的DNA片段時，在上述溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。(5)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)將上述操作的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm，離心lmin，棄濾液。將濾液再加入Spin Column中，離心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(9)重復(8) —次。(10)將Spin Column安置于新的1. 5mL離心管上，在Spin Column膜中央處加入 25 μ L 60°C預熱的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置lmin。(11) 12000rpm 離心 lmin，洗脫 DNA，-20°C保存 DNA 備用。4回收產(chǎn)物的電泳檢測取5μ L回收的中間序列PCR產(chǎn)物，用1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測回收效率。5PCR產(chǎn)物的連接根據(jù)回收片段的濃度確定產(chǎn)物和pGEM-T Easy Vector之間的比例。連接步驟如下(1)加入 DNA 3. 75 μ L，T 載體 0.25 μ L，輕輕混勻。(2)45°C水浴5min，立即轉(zhuǎn)入冰上5min。(3)再加入 T4 DNA 連接酶 0. 5 μ L 和 h Rapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于 PCR儀上16°C連接16h以上。6轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)(1)將5μ L連接液加入含50μ L感受態(tài)細胞的離心管中，吹吸混勻，冰上放置 30mino(》42°C水浴熱激90s，立即冰浴anin。(3)加入950yL LB液體培養(yǎng)基，置于37°C搖床，230rpm振蕩培養(yǎng)lh，使細胞復蘇并表達抗性。(4)3000rmp離心3min。于超凈工作臺中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固體培養(yǎng)基上，剩余30 μ L涂布在另外一個LB 固體培養(yǎng)基上。37°C倒置培養(yǎng)12 16h，直至出現(xiàn)菌落。7陽性重組子鑒定用滅菌槍頭挑取單個白斑菌落于4mL含有100μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中， 230rpm，37°C過夜振蕩培養(yǎng)。以菌液為模板，用PCR方法對含有插入片段的克隆進行篩選。 菌液PCR反應體系和反應程序參照以上方法。取2.5yL PCR反應產(chǎn)物，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。8質(zhì)粒DNA提取
(1)取1500μL菌液加入Eppendorf管中，12000rpm，離心lmin，棄上清，浙干殘液。(2)加250yL solution I，置于渦旋振蕩器上振蕩，充分懸浮菌體。(3)加250 μ L solution II，輕輕顛倒混勻4_6次，室溫下lmin。整個過程不要超過 5min。(4)加 350 μ L solution III，輕輕混勻，室溫下放置 5min。(5) 12000rmp，離心 lOmin。(6)取上清液，移入柱中。8000rmp離心anin。(7)去廢液，力口入 500 μ L washing solutions, lOOOOrmp，lmin。(8)重復(7)。(9)去廢液，柱子于lOOOOrmp離心anin。(10)柱子室溫下放置lOmin。(11)將柱子套到新的Eppendorf管中，加入50 μ L Elution Buffer。室溫下放置 2min, lOOOOrmp 離心 2min。(Elution Buffer 預熱到 60°C效果最好)(12)-20°C 保存?zhèn)溆谩?質(zhì)粒DNA濃度檢測和測序取2. 5 μ L質(zhì)粒于1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測濃度。取15個陽性質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。10DNA序列分析通過DNAMAN和NCBI比對分析，即可發(fā)現(xiàn)小麥甲羥戊酸激酶基因序列。實施例4 (通過RACE技術(shù)快速獲得末端序列)RACE是基于PCR技術(shù)基礎上由已知一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。該方法同篩庫法相比較，有許多優(yōu)點首先RACE技術(shù)是通過 PCR技術(shù)實現(xiàn)的，無需建立cDNA文庫，可以在很短的時間內(nèi)獲得有價值的信息。其次，只要引物設計正確，在初級產(chǎn)物基礎上就可以獲得感興趣基因的全長。再次，該技術(shù)節(jié)約了實驗時間和經(jīng)費。IRACE引物的設計通過DNAMAN比對所獲得的中間序列，以及NCBI甲羥戊酸激酶基因(橡膠 AB294693,擬南芥 X77793，NM_122627. 4，褐家鼠 NM_031063，小家鼠匪_02；3556 加上玉米 BT062051. 1，水稻ΝΜ001070895，高粱XM 002453136. 1)的序列，尋找最保守的區(qū)域。然后用 DNAMAN手工設計引物。引物序列為5' RACE 引物5' CCATGCACTGGAGCAAACCTTGG3‘ (Seq ID No 5)3' RACE 引物；5' TGGTAGGAACACCAAGGCTCTGGT3‘ (Seq ID No 6)2第一鏈cDNA合成(1)①對于 5' -RACE-ReadycDNARNA2 |a L
5'-CDS primer A 1 |a L SMART II A oligo 1 |a L DEPC water1 |a L②對于3' -RACE-Ready cDNARNA2u L3' -CDS primer A 1 U LDEPC water2 U L(2)微離心。(3)在 PCR 儀上進行 70 °C anin。(4)冰上放置anin，微離心。(5)向上管中分別加入
權(quán)利要求
1.一種小麥甲羥戊酸激酶基因TaMVK編碼區(qū)基因序列如kq IDNo 1所示，其編碼的氨基酸序列如ID No 2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的小麥甲羥戊酸激酶基因TaMVK在構(gòu)建甲羥戊酸激酶基因的真核生物基因表達載體并轉(zhuǎn)化相應作物上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種從小麥品種玉麥中獲得的，參與小麥葉綠素、類胡蘿卜素、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素、長萜醇、類萜、輔酶Q、甾醇和植物毒素等類異戊二烯物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶基因甲羥戊酸激酶基因TaMVK的分離克隆、酶蛋白的原核表達、酶蛋白的分離純化及其酶活性的體外檢測技術(shù)。為進一步構(gòu)建甲羥戊酸激酶基因的真核生物基因表達載體并轉(zhuǎn)化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討甲羥戊酸激酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產(chǎn)物、籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對甲羥戊酸激酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標記提供重要技術(shù)儲備。
文檔編號A01H5/00GK102392032SQ201110383599
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者劉愛峰, 李永波, 李玉蓮, 楚秀生, 樊慶琦, 王寶蓮, 隋新霞, 高潔, 黃承彥 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所