專利名稱：⁶⁰Co-γ輻射法選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于小麥輻射育種的方法，具體的說是6tlCo-Y輻射法選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系。
背景技術(shù)：
小麥種子儲(chǔ)藏蛋白是一種重要的食用植物蛋白，其產(chǎn)量占所有谷類作物食用植物蛋白的1/3。小麥儲(chǔ)藏蛋白由70%的醇溶蛋白和30%的谷蛋白組成。谷蛋白主要以谷蛋白大聚合體GMP的形式存在，GMP由高分子量谷蛋白亞基HMW-GS和低分子量谷蛋白亞基 LMW-GS通過二硫鍵S-S連接并聚合而成。谷蛋白大聚合體GMP的含量和性質(zhì)與小麥面粉的品質(zhì)密切相關(guān)，高分子量谷蛋白亞基HMW-GS的組成及質(zhì)量影響GMP的形成，進(jìn)而影響面粉的品質(zhì)。高分子量谷蛋白亞基HMW-GS由位于小麥第一同源染色體組(1A、1B和1D)的3個(gè) Glu-I位點(diǎn)編碼，每個(gè)位點(diǎn)編碼2個(gè)緊密連鎖的基因。由于等位基因變異和基因沉默，大多數(shù)六倍體小麥具有3-5個(gè)高分子量谷蛋白亞基。雖然高分子量谷蛋白大約只占小麥胚乳儲(chǔ)存蛋白的10%，但它對(duì)小麥的加工品質(zhì)至關(guān)重要。研究表明，高分子量谷蛋白亞基的等位變異與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)，各位點(diǎn)對(duì)品質(zhì)的影響大小依次為Glu-Dl > Glu-Al > Glu-Bl。 Glu-Dl位點(diǎn)表達(dá)的5+10，Glu-Al位點(diǎn)表達(dá)的1和2*，Glu-Bl位點(diǎn)表達(dá)的7+8、13+16、14+15 和17+18等亞基對(duì)小麥加工品質(zhì)的正向效應(yīng)明顯，被稱為優(yōu)質(zhì)亞基。高分子量谷蛋白亞基被作為衡量面包小麥的重要指標(biāo)，可作為小麥品質(zhì)育種早代選擇的指標(biāo)，廣泛用于小麥品質(zhì)育種。HMW-GS對(duì)小麥品質(zhì)的作用主要表現(xiàn)在兩方面其一，HMW-GS亞基含量和數(shù)目不同，對(duì)小麥烘烤品質(zhì)的貢獻(xiàn)明顯不同；其二，不同位點(diǎn)上等位基因的變異對(duì)烘烤品質(zhì)的效應(yīng)不同。不同小麥品種面包烘焙品質(zhì)變異的主要原因由HMW-GS組成變化引起。在Glu-Al、 Glu-Bl和Glu-Dl三個(gè)基因位點(diǎn)中，Glu-Dl的效應(yīng)明顯高于Glu-Al和Glu-Bl的作用。小麥染色體ID上Glu-Dl位點(diǎn)編碼的HMW-GS 1Dx5和IDylO亞基對(duì)面粉筋力的影響最大。較好的亞基成分為 Glu-lD5+10、Glu-lAl，2、Glu-lB17+18，7+8。而有些亞基，如 Null,2+12 等， 則與較差的品質(zhì)相關(guān)。根據(jù)單個(gè)亞基或亞基對(duì)與SDS十二烷基硫酸鈉沉淀值的關(guān)系提出了 HMW-GS的品質(zhì)評(píng)分系統(tǒng)，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依次為5+10 (得分4分)> 1 = 2* = 17+18 = 7+8 = 13+16 (3 分)> 7+9 = 2+12 = 3+12 O 分)>7 = 6+8 = 4+12 = Null (1 分)。高分子量谷蛋白亞基HMW-GS含量低是我國面包小麥整體面筋強(qiáng)度較低的主要原因。我國小麥具有優(yōu)質(zhì)HMW-GS及其組合lDx5+lDylO、lA2*、lBxl7+lByl8的品種較少，而具有l(wèi)Dx2+lDyl2等劣質(zhì)亞基的品種則較多。例如美國的硬紅冬麥Dx5+Dyl0的基因攜帶率為62%，硬紅春小麥Dx5+Dyl0的基因攜帶率為91% ；加拿大小麥Dx5+Dyl0的基因攜帶率為80%;而我國小麥Dx5+Dyl0的基因攜帶率僅為11.9%。因此選育具有Dx5+Dyl0等優(yōu)質(zhì) HMW-GS亞基基因的小麥品種已成為當(dāng)前國內(nèi)小麥品質(zhì)改良的主要途徑之一。輻射誘變是選育小麥種質(zhì)的重要手段。6tlCo- Y射線是放射性金屬鈷60放射發(fā)出的高能光線，是最常見、應(yīng)用最廣的植物誘變?cè)矗墒剐←溔旧w發(fā)生重組，打破基因連鎖，促進(jìn)基因重組，突變率高，突變譜寬闊，且所誘致的有價(jià)值的突變性狀遺傳穩(wěn)定，育種年限短，是選育優(yōu)異種質(zhì)的重要途徑。聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，世界利用Y射線輻射育成品種占輻射育種的比例為52. 12%;我國則占85.4%。6tlCo-Y射線具有產(chǎn)生小麥品質(zhì)突變的特點(diǎn)，據(jù)此許多國家育成了高蛋、高質(zhì)賴氨酸含量等營養(yǎng)品質(zhì)好的小麥品種。但是未見6tlCo-γ 射線用于小麥加工品質(zhì)，特別是通過選育高分子量谷蛋白亞基HMW-GS突變新品系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)加工品質(zhì)育種的報(bào)道。用6tlCo-γ射線輻射選育HMW-GS突變新品系是改良我國小麥加工品質(zhì)的種質(zhì)基礎(chǔ)，并為小麥品質(zhì)育種提供了新的方法和途徑，因此，這項(xiàng)發(fā)明意義重大。經(jīng)廣泛查詢專利文獻(xiàn)及世界各國出版物，均未見有使用6tlCo-Y輻射選育小麥高分子量谷蛋白亞基HMW-GS突變新品系的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是1.提供6tlCo-Y輻射選育小麥高分子量谷蛋白亞基HMW-GS突變新品系的方法； 2.提高小麥品質(zhì)育種的效率；3.縮短小麥品質(zhì)育種年限。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種6tlCo-Y輻射法選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系，方法如下(1)將干燥小麥種子置于6tlCo-γ射線下，劑量率為200Gy能級(jí)，輻射10分鐘；放置48小時(shí)；產(chǎn)生小麥誘變1代M1 ；(2)種植M1代種子溝播，溝深15厘米，行距20厘米，株距10厘米；混合收獲成熟種子，生產(chǎn)誘變2代M2種子群體；(3)種植M2代種子，溝播，溝深15厘米，行距20厘米，株距10厘米，成熟后單株收獲，每株隨機(jī)取5粒；(4)半粒法提取M2代小麥谷蛋白；(5)M2蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳；(6)取谷蛋白亞基突變種質(zhì)有胚端的半粒種子種植，方法同步驟0)，成熟后單株收獲誘變3代M3種子，每株隨機(jī)抽取5粒；(7)用半粒法提取M3代小麥谷蛋白；(S)M3蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳；(9)確定小麥高分子量谷蛋白質(zhì)亞基突變新品系與對(duì)照比對(duì)亞基條帶的數(shù)量和位置，數(shù)量不等或上下位置不同的為突變新品系。步驟(4)半粒法提取小麥M2谷蛋白和步驟(7)半粒法提取M3代小麥谷蛋白的方法為(1)配制50%異丙醇取50ml異丙醇，加50ml蒸餾水，混均；(2)樣品提取液的配制取0. 5克巰基乙醇；pH6. 8的0. 5M的Tris-Hcl三羥甲基氨基烷-鹽酸溶液6. 25ml ；25ml異丙醇；蒸餾水18. 75ml，共50ml，按順序加入，混均；(3)樣品緩沖液的配制取0. 5克巰基乙醇；pH6. 8的0. 5M的Tris-Hcl三羥甲基氨基烷-鹽酸溶液6. 25ml，2克SDS十二烷基硫酸鈉，甘油12. 5ml，水33. 75ml，定容至50ml，稱取0. 001克溴酚蘭加入其中，混均；(4)取無胚端半粒小麥，破碎，放入1. 5ml離心管中；加0. 5ml的50%異丙醇，放置于60°C汽浴恒溫振蕩箱中30分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/ 分，離心1分鐘，棄上清液，留沉淀；(5)在步驟(4)的離心管中加0. 5ml的50%異丙醇，置于60°C汽浴恒溫振蕩箱中 30分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘，棄上清液， 留沉淀；(6)在步驟(5)的離心管中加0. 5ml的50%異丙醇，放置于60°C汽浴恒溫振蕩箱中30分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘，棄上清液，留沉淀；(7)在有沉淀的離心管中加0. 2ml樣品提取液，60°C汽浴恒溫振蕩箱中60分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，留上清，吸120 μ L ；(8)在上清液中加120 μ L的樣品緩沖液，混勻后制成小麥谷蛋白液； 步驟(5) M2蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳和步驟⑶M3 蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳的方法為(1)配制電極緩沖液在IOOOml的燒杯中加800ml水，加甘氨酸14. 4克，Tris三羥甲基氨基烷3. 03克，SDS十二烷基硫酸鈉1克，用IM的NaOH氫氧化鈉調(diào)pH至8. 3，定容至 IOOOml ；(2)配制pH6. 8的0. 5M的Tris-HcL三羥甲基氨基烷-鹽酸溶液6. 05克Tris三羥甲基氨基烷溶于80ml水中，用IM的Hcl鹽酸調(diào)pH至6. 8，定容至IOOml ；(3)3M Tris-Hcl三羥甲基氨基烷-鹽酸pH8. 5溶液的配制36. 395克1Tris三羥甲基氨基烷，溶于60ml水中，用IM的Hcl鹽酸調(diào)pH至8. 5，定容至IOOml ；(4) 10% SDS十二烷基硫酸鈉溶液的配制5克SDS十二烷基硫酸鈉，加水定容至 50ml ；(5) 1. 5%過硫酸銨溶液的配制0. 15克過硫酸銨加水定容至10ml，現(xiàn)配現(xiàn)用；(6)30% Acr-0. 8% Bis30%丙烯酰胺-0. 8N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺溶液的配制 30克丙烯酰銨，溶于小于60ml的水中，然后加0.8克N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺，定容至 IOOml ；(7)濃縮膠的組分和配制方法
權(quán)利要求
1.一種6tlCo-Y輻射法選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系，方法如下(1)將干燥小麥種子置于6tlCo-Y射線下，劑量率為200Gy能級(jí)，輻射10分鐘；放置48 小時(shí)；產(chǎn)生小麥誘變1代M1;(2)種植M1代種子溝播，溝深15厘米，行距20厘米，株距10厘米；混合收獲成熟種子，生產(chǎn)誘變2代M2種子群體；(3)種植M2代種子，溝播，溝深15厘米，行距20厘米，株距10厘米，成熟后單株收獲， 每株隨機(jī)取5粒；(4)半粒法提取M2代小麥谷蛋白；(5)M2蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳；(6)取谷蛋白亞基突變種子有胚端的半粒種子種植，方法同步驟O)，成熟后單株收獲誘變3代M3種子，每株隨機(jī)抽取5粒；(7)用半粒法提取M3代小麥谷蛋白；(S)M3蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳；(9)確定小麥高分子量谷蛋白亞基突變新品系與親本比對(duì)亞基條帶的數(shù)量和位置， 數(shù)量不等或上下位置不同的為突變新品系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的6tlCo-γ輻射選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系，其特征在于步驟(4)半粒法提取小麥禮谷蛋白和步驟(7)用半粒法提取M3代小麥谷蛋白的方法為(1)配制50%異丙醇取50ml異丙醇，加50ml蒸餾水，混均；(2)樣品提取液的配制取0.5克巰基乙醇；pH6. 8的0. 5M的Tris-Hcl三羥甲基氨基烷-鹽酸溶液6. 25ml ；25ml異丙醇；蒸餾水18. 75ml，共50ml，按順序加入，混均；(3)樣品緩沖液的配制取0.5克巰基乙醇；pH6. 8的0. 5M的Tris-Hcl三羥甲基氨基烷-鹽酸溶液6. 25ml，2克SDS十二烷基硫酸鈉，甘油12. 5ml，水33. 75ml，定容至50ml，稱取0. 001克溴酚蘭加入其中，混均；(4)取無胚端半粒小麥，破碎，放入1.5ml離心管中；加0. 5ml的50%異丙醇，放置于 60°C汽浴恒溫振蕩箱中30分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分， 離心1分鐘，棄上清液，留沉淀；(5)在步驟(4)的離心管中加0.5ml的50%異丙醇，置于60°C汽浴恒溫振蕩箱中30分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘，棄上清液，留沉淀；(6)在步驟(5)的離心管中加0.5ml的50%異丙醇，放置于60°C汽浴恒溫振蕩箱中30 分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘，棄上清液，留沉淀；(7)在有沉淀的離心管中加0.2ml樣品提取液，60°C汽浴恒溫振蕩箱中60分鐘，振蕩速度每分鐘60次，轉(zhuǎn)入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，留上清，吸120yL ；(8)在上清液中加120μ L的樣品緩沖液，混勻后制成小麥谷蛋白液；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的6tlCo-γ輻射法選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系，其特征在于步驟(5)M2蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳和步驟(S)M3 蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳的方法為(1)配制電極緩沖液在IOOOml的燒杯中加800ml水，加甘氨酸14.4克，Tris三羥甲基氨基烷3. 03克，SDS十二烷基硫酸鈉1克，用IM的NaOH氫氧化鈉調(diào)pH至8. 3，定容至 IOOOml ；(2)配制pH6.8的0. 5M的Tris-HcL三羥甲基氨基烷-鹽酸溶液6. 05克1Tris三羥甲基氨基烷溶于80ml水中，用IM的Hcl鹽酸調(diào)pH至6. 8，定容至IOOml ；(3)3MTris-Hcl三羥甲基氨基烷-鹽酸pH8. 5溶液的配制36. 395克1Tris三羥甲基氨基烷，溶于60ml水中，用IM的Hcl鹽酸調(diào)pH至8. 5，定容至IOOml ；(4)10% SDS十二烷基硫酸鈉溶液的配制5克SDS十二烷基硫酸鈉，加水定容至50ml ；(5)1. 5%過硫酸銨溶液的配制0. 15克過硫酸銨加水定容至10ml，現(xiàn)配現(xiàn)用；(6)30%Acr-0. 8% Bis 30%丙烯酰胺-0. 8N, N，-亞甲基雙丙烯酰胺溶液的配制30 克丙烯酰銨，溶于小于60ml的水中，然后加0. 8克N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺，定容至IOOml ；(7)濃縮膠的組分和配制方法序號(hào)溶液用量130%Acr-0. 8°/。Bis30%丙烯酰胺-0. 8N, N’-亞甲基雙丙烯酰胺Iml20. 5M Tris-Hcl三羥甲基氨2 ml基烷-鹽酸、pH6. 8310%SDS十二烷基硫酸鈉80μ14雙蒸水4. 5 ml5TEMED四甲基乙二胺6.5 μ 61. 5%過硫酸銨0. 4 ml總體積8 ml配制方法按順序加入以上溶液，混合均勻； (8)分離膠的組分和配制方法
全文摘要
本發(fā)明屬于小麥輻射育種的方法，60Co-γ輻射法選育小麥高分子量谷蛋白亞基新品系?，F(xiàn)有技術(shù)未見60Co-γ射線選育小麥高分子量谷蛋白亞基突變新品系的報(bào)道。本發(fā)明方法為小麥種子用60Co-γ射線輻射10分鐘，劑量率200Gy；產(chǎn)生誘變1代；生產(chǎn)誘變2代種子；種植M2代單株收獲；半粒法提取M2代小麥谷蛋白，蛋白質(zhì)電泳；半粒種子種植收獲誘變3代；提取M3代小麥谷蛋白；M3蛋白質(zhì)電泳；與親本比對(duì)，高分子量谷蛋白亞基條帶數(shù)量或位置不同的為突變新品系。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是60Co-γ射線輻射與電泳檢測相結(jié)合、田間種植和室內(nèi)電泳篩選結(jié)合選育小麥高分子量谷蛋白亞基突變新品系；結(jié)果精確、科學(xué)、可靠。
文檔編號(hào)A01H1/06GK102511386SQ20111038841
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者劉純利, 崔廣榮, 張從宇, 張怡婷, 林平, 王敏 申請(qǐng)人:張從宇