專利名稱：脊椎動物用飼料組合物的制作方法
脊椎動物用飼料組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種養(yǎng)殖方法，具體而言，涉及ー種脊椎動物用飼料組合物。
現(xiàn)有技術(shù)隨著世界人ロ快速成長，以及可耕地面積的減少，可利用的糧食資源漸趨短缺，提升單一面積生產(chǎn)量以及增加附加營養(yǎng)價值是世界糧食生產(chǎn)的趨勢。針對漁業(yè)而言，因海上捕撈所得的漁獲量已幾近飽和，且動物蛋白市場對漁類產(chǎn)品的需求日益成長，由水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以彌補捕撈漁業(yè)產(chǎn)品供應(yīng)量的不足已是勢在必行。石斑魚(Epinephelus spp.)物種分類屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、魚盧行目(Perciforms)、鯧科(Serranidae)、石斑亞科(Epinephelinae)、石斑屬(Epinephelus),為暖水性魚類，廣布全世界熱帶與亞熱帶海域，為養(yǎng)殖界公認亞太地區(qū)最重要的經(jīng)濟魚種。臺 灣主要養(yǎng)殖瑪拉巴石斑、點帶石斑、龍膽石斑和青點石斑。一般石斑魚養(yǎng)殖至少需八至十二個月才達上市體型，但最后的收成率都不高。除了早期稚魚易遭受病毒及細菌感染而死亡夕卜，養(yǎng)殖期間的天候因素、水質(zhì)污染問題、餌料生物的選擇與管理方面都會增加業(yè)者的風險。因此如何提高養(yǎng)殖魚類的養(yǎng)成速度，縮短上市的時間，降低飼料轉(zhuǎn)換率(飼料投喂重量/魚只體重増加重量)及養(yǎng)殖期間可能發(fā)生的風險，是值得努力研究的方向。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic andrich incysteine, SPARC),又稱骨結(jié)合素(osteonectin)、BM40,其蛋白大小約35_45kDa,主要分布于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)之中，是一種細胞基質(zhì)蛋白(matricelluarprotein),亦為ー種具有與細胞外基質(zhì)結(jié)合亦可與細胞結(jié)合特性的具有多功能的糖蛋白(glycoprotein)。雖然SPARC主要分布于細胞外基質(zhì)之中，但其功用卻不同于一般基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)性蛋白所負責的細胞結(jié)構(gòu)組成、支持作用；相反的，SPARC專司細胞與細胞外基質(zhì)之間的溝通橋梁，屬于調(diào)控性的蛋白質(zhì)，能調(diào)節(jié)數(shù)種細胞基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生及儲存堆積(Bradshaw及Sage,2001,J Clin Invest 107 ; 1049-1054 ;Lane 及 Sage，1994，F(xiàn)ASEB J 8;163_173)。而SPARC主要表現(xiàn)于胚胎發(fā)育過程，對細胞分化、組織的鈣化生成、骨骼發(fā)育、型態(tài)及器官發(fā)育有極大影響，當于生物成體時此蛋白的表現(xiàn)量有降低的趨勢，主要是當皮膚或是組織受傷時的修復(fù)及重組過程會有較明顯的表現(xiàn)(Lane及Sage, 1994)。SPARC主要可以分成三個功能區(qū)(Hohenester等人，I"7，EMBO J 16 ；3778-3786) :1、酸性區(qū)(Acidic domain):位于蛋白質(zhì)N端，此區(qū)可與5 8個I丐離子形成弱親和カ的結(jié)合，具有抑制細胞延展及調(diào)控細胞外基質(zhì)生產(chǎn)的功能；2、類卵泡抑制素區(qū)(Follistatin like domain):此區(qū)包含多個半胱氨酸,且有類似卵泡抑制素的功能,能夠抑制細胞增生，此區(qū)還包含另ー個特別的序列-銅離子結(jié)合序列(K) GHK (Iruela-Arispe等人，1995，Mol Biol Cell 6 ;327_343)，具有促進血管的增生的功能；3、細胞外鈣離子結(jié)合區(qū)(ECdomain):為SPARC的C端，具有兩個EF-手型結(jié)構(gòu)域(EF-handmotif)可與I丐離子形成高親和カ的結(jié)合，能與細胞或某些膠原蛋白結(jié)合，亦具有抑制細胞增生及延展的效果(Maurer 等人，1995，J Mol Biol 253 ;347_357)。目前對SPARC生物功能性的研究探討已有ー些發(fā)現(xiàn)，于活體外的老鼠內(nèi)皮細胞培養(yǎng)觀察中可以發(fā)現(xiàn)到幾個特性(一)SPARC的表現(xiàn)可以抑制細胞型態(tài)的延展，使細胞趨于圓形(Murphy-Ullrich 等人，1991，J Cell Biol 115 ;1127_1136);調(diào)控細胞外基質(zhì)的組成及其中某些細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，進而調(diào)節(jié)細胞與外基質(zhì)之間的結(jié)合狀況從而改變細胞型態(tài)及遷徙的能力(Hasselaar 等人，1991，J Biol Chem 266 ;13178_13184 ;Tremble 等人，1993，J Cell Biol 121 ； 1433-1444) ; (ニ)抑制細胞周期的進行，主要使周期停于中Gl期，故有抑制細胞生長的功能(Yan 及 Sage，1999，JHistochem Cytochem 47 ; 1495-1506)；(三)于血管細胞培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)其具有促進血管增生的性質(zhì)(Funk及Sage，1991，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88 ;2648_2652);而在活體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，去除SPARC基因的老鼠在出生不久后即有白內(nèi)障的現(xiàn)象，推測SPARC對于眼睛晶狀體的發(fā)育為必需的蛋白(Yan及Sage，1999);而研究中也發(fā)現(xiàn)在spare基因敲除的老鼠中，可以觀察到皮膚組成發(fā)生異常改變，脂肪層有增厚的現(xiàn)象，且其脂肪細胞有體積變大及數(shù)目增多的現(xiàn)象，血液中由脂肪細胞所分泌的瘦蛋白濃度也有上升的情形，因此推測SPARC蛋白可能和體內(nèi)調(diào)控脂肪量變化有相關(guān)關(guān)系(Bradshaw 等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 ;6045_6050)。 肌肉倍增基因(myostatin),亦稱為第八號生長分化因子(growth anddifferentiation factor-8,⑶F_8),為轉(zhuǎn)化生長因子TGF-0家族中的成員。肌肉倍增基因可負向調(diào)控肌肉的生長分化。在牛及人體的研究中皆可發(fā)現(xiàn)當肌肉倍増基因失去功能吋，因無法執(zhí)行負向調(diào)控肌肉之生長分化，造成肌肉倍増的表現(xiàn)型出現(xiàn)(McPherron及 Lee,1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,12457-12461 ；Schuelke 等人，2004, TheNewEngland Journal of Medicine 350,2682-2688)。在哺乳動物研究方面，將小鼠的肌肉倍增基因敲除(McPherron 及 Lee，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 ; 12457-12461)、在小鼠肌肉中大量表現(xiàn)肌肉倍増抑制蛋白(如Follistatin)或是讓其訊息傳遞所需的受體蛋白ActRIIB 失去功能(Lee 及 McPherron，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 ;9306_9311)，都會導(dǎo)致肌肉倍増的結(jié)果出現(xiàn)。而在硬骨魚類研究方面，使用反義嗎啉敲除(Antisensemorpholinoknock-down)技術(shù)抑制斑馬魚胚胎中的肌肉倍增蛋白-I的mRNA,可使胚胎生長速度變快(Amali 等人,2004, Developmental Dynamics 229 ;847_856);或利用 RNAi 技術(shù)使斑馬魚肌肉倍增基因-I默化，出現(xiàn)巨大斑馬魚的特征(Acosta等人，2005，Journal ofBiotechnology 119 ;324_331),進ー步以組織切片去探討研究這些肌肉細胞,發(fā)現(xiàn)肌肉細胞體積變大(Hypertrophy)及肌肉細胞數(shù)目增生(Hyperplasia),可能是導(dǎo)致肌肉倍增的原因。另ー方面，體外細胞株研究結(jié)果指出，若在C2C12肌肉母細胞株內(nèi)大量表現(xiàn)肌肉倍増蛋白質(zhì)，可抑制肌肉母細胞的增生，使細胞停留在細胞周期當中的Gl至S期(Thomas等人，2000, The Journal of Biological Chemistry 275 ;40235_40243)。另一方面，若在肌肉星狀細胞內(nèi)大量表現(xiàn)肌肉倍増蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其可抑制肌肉星狀細胞活化及自我更新(self-renewal) (McCroskery, 2003, The Journal of CellBiology 162 ;1135_1147),亦證明肌肉倍増蛋白質(zhì)在肌肉發(fā)育過程當中，的確扮演負向調(diào)控的角色。除了其本身會在肌肉細胞內(nèi)進行調(diào)控之外，其它文獻指出其有抑制脂肪新生的功能存在(Rebbapragada等人，2003，Molecular and CellularBiology 23 ;7230_7242)，也有研究指出其有抑制肌肉母細胞調(diào)亡的功倉泛(Rios等人,2001,Biochemical and BiophysicalResearch Communications280 ；561-566)。然而關(guān)于肌肉倍增蛋白質(zhì)及SPARC的研究中，并無關(guān)于飼料轉(zhuǎn)換率(飼料投喂重量/體重增加重量)的報導(dǎo)，于養(yǎng)殖業(yè)中，除了肌肉增加外，飼料轉(zhuǎn)換率亦是成本控制之重要關(guān)鍵，再者，現(xiàn)今針對免疫抑制脊椎動物的方法為采用注射抗原性片段，耗時耗力，且易造成脊椎動物受傷，業(yè)界仍需要開發(fā)可降低飼料轉(zhuǎn)換率的飼料組合物，以提高養(yǎng)殖的養(yǎng)成速度。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種脊椎動物用飼料組合物，其可提高養(yǎng)殖的養(yǎng)成速度，縮短上市的時間，降低飼料轉(zhuǎn)換率及養(yǎng)殖期間可能發(fā)生的風險。本發(fā)明提供一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物進一步包含肌肉倍增蛋白質(zhì)、肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體。

圖I為石斑魚經(jīng)免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的血清抗體效價圖。圖2為石斑魚經(jīng)免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的體重變化圖。圖3為石斑魚經(jīng)免疫抑制肌肉倍增蛋白質(zhì)的血清抗體效價圖。
具體實施方式本發(fā)明提供一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物通過抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的功能，可在脊椎動物體中降低飼料轉(zhuǎn)換率，其中飼料轉(zhuǎn)換率被定義為(飼料投喂重量)/(體重增加重量)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物進一步包含肌肉倍增蛋白質(zhì)、肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體。根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物可適用于各種脊椎動物體中；優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物適用于魚體；更優(yōu)選地，該魚體為硬骨魚綱(Osteichthyes),目前已選殖出包括斑馬魚、大西洋鮭魚、莫桑比克吳郭魚、條紋鱸魚、金頭鯛魚、虹鱒、河鱒、河鯰、點帶石斑魚及日本真鱸的肌肉倍增基因，且其氨基酸序列具有高度保守性，推測應(yīng)具有相同的功能；尤其優(yōu)選地，該魚體為硬骨魚綱鱸行目(Perciforms);尤其優(yōu)選地，該魚體為硬骨魚綱S盧行目鯧科(Serranidae);尤其優(yōu)選地,該魚體為硬骨魚綱S盧行目鯧科石斑亞科(Epinephelinae);尤其優(yōu)選地，該魚體為硬骨魚綱硬骨魚綱鱸行目鯧科石斑亞科石斑屬(Epinephelus);最佳地,該魚體為點帶石斑魚(Epinephelus coioides)。根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物利用抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)的功能以提高脊椎動物的飼料轉(zhuǎn)換率，其可針對基因、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、翻譯反應(yīng)、蛋白質(zhì)活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑等各階段以抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)的功能，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具通常知識者可選擇適當?shù)牟僮饕砸种聘缓腚装彼岬乃嵝苑置诘鞍缀?或肌肉倍増蛋白質(zhì)的功能，例如利用基因敲除方法去除基因體中的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増基因、抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)本身的活性或是抑制受體蛋白的作用。優(yōu)選地，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)的功能是通過免疫抑制法而抑制，其利用抑制蛋白質(zhì)活性的方式抑制其功能，可對脊椎動物產(chǎn)生較小的系統(tǒng)性副作用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施例中，免疫抑制法為給予脊椎動物富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)或其片段的抗體。優(yōu)選地，該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)的片段為抗原性片段。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具通常知識者可克隆得編碼富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)的基因，表達該蛋白或其抗原性片段，并將其免疫至動物體內(nèi)，而得到該抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)的抗體或其抗原性片段的抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體可通過將富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)或其抗原性片段 免疫其它動物，并純化出抗體而得，或是直接將富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質(zhì)或其抗原性片段免疫脊椎動物體，使該脊椎動物體本身產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選地，該抗體為多克隆抗體。本發(fā)明所述的“抗原性片段”是指蛋白質(zhì)抗原中，可引起免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗原的片段，其可經(jīng)由結(jié)構(gòu)預(yù)測或是選取蛋白質(zhì)片段觀察免疫動物的免疫反應(yīng)而得該片段。肌肉倍増蛋白質(zhì)在序列上與其它TGF-P家族成員具高相似度，包括三個部分
(I)N端疏水區(qū)域，作為蛋白分泌釋出的信號；(2)具高度保守性的蛋白切割位置RXRR(序列辨識編號2) ； (3)半胱氨酸豐富的C端活性區(qū)域(Sharma等人’ 1999, Journal ofcellular physiology 180;1_9)。許多報告證實,脊椎動物的肌肉倍增蛋白質(zhì)的氨基酸序列在C端活性區(qū)域具有高度保守性(McPherron等人，1997, Nature 387 ;83_90)。目前針對肌肉倍增蛋白質(zhì)的研究中(Whittemore等人,2003, Biochemical and BiophysicalResearchCommunications 300 ;965_971),發(fā)現(xiàn)一對肌肉倍增蛋白質(zhì)具高度專一性的單克隆抗體JA16，分析與肌肉倍増蛋白質(zhì)結(jié)合位置，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合位置是位于小鼠肌肉倍増蛋白質(zhì)C端的15個氨基酸DFGLDCDH1STESRC(SEQ ID No : I)，可知該C端區(qū)域為抗原性片段，故優(yōu)選地，該肌肉倍増蛋白質(zhì)的抗原性片段為肌肉倍増蛋白質(zhì)的C端區(qū)域；更佳地，該肌肉倍增蛋白質(zhì)的C端區(qū)域具有如SEQ ID NO :1所不的序列。另ー方面，由于抗原性片段為小片段勝肽，若直接將此小片段的抗原免疫動物時，免疫反應(yīng)可能不令人滿意，優(yōu)選地，建構(gòu)含有多個重復(fù)數(shù)的線性重復(fù)排列抗原(Lineararrayepitopes, LAE),以提高免疫反應(yīng)。此外,亦可利用細菌毒素以幫助輸送抗原,將已去除毒素活性的毒素作為運載系統(tǒng)，利用該毒素的特性，提升整體的免疫效果。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的線性重復(fù)排列抗原與綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A, PE)區(qū)域Ia融合。綠膿桿菌外毒素的分子量為66kDa，含有613個氨基酸，其蛋白結(jié)構(gòu)主要有三個區(qū)域，其中的區(qū)域Ia(氨基酸1-252)為受體結(jié)合區(qū)，負責和哺乳動物細胞膜上的a 2-巨型球蛋白/低密度脂蛋白細胞受體(a 2-macroglobulin/low density lipoprotein receptor,LDLR)結(jié)合后，再經(jīng)由細胞內(nèi)吞作用(Receptor-mediatedendocytosis)進入細胞的內(nèi)膜體中，利用綠膿桿菌外毒素已證實能有效增強誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(Donnelly等人，1993, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 ;3530_3534)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施例中，該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體生物包埋于豐年蝦體中。豐年蝦經(jīng)常作為飼料而容易施予至魚體中。優(yōu)選地，該豐年蝦為豐年蝦幼蟲；更優(yōu)選地，該豐年蝦幼蟲被冷凍干燥為粉末。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的具體實施例中，該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體表達于微生物中，該微生物可直接添加于飼料成分中，例如包埋于豐年蝦體中。優(yōu)選地，該微生物的培養(yǎng)液被冷凍干燥為粉末。另一方面，該微生物優(yōu)選為大腸桿菌。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施例中，與對照組比較，以免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白功能可有效降低飼料轉(zhuǎn)換率超過約5% ;更優(yōu)選地為從約8%至約40%。茲以下列實施例來詳細說明本發(fā)明，但并不意味本發(fā)明僅局限于這些實施例所揭示的內(nèi)容。實施例實施例I :免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白抗原制備對照組及實驗組共48只點帶石斑魚，重量平均70± 10g、長度平均五到六時，實驗過程約五個月。設(shè)計的抗原主要是由使用引物I (SEQ ID NO 3)及引物2(SEQ ID NO 4)擴增spare基因。建立35L發(fā)酵培養(yǎng)制程，將含有抗原性片段的大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養(yǎng)于50L發(fā)酵槽。將4管5mL經(jīng)LB/氨芐青霉素(Ampicillin)培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)隔夜，并將培養(yǎng)菌株分別接種至0. 2L的LB/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，共1L，于37°C振蕩培養(yǎng)至00_約0. 3，再加A 35L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每隔I小時取樣測定其OD6tltl監(jiān)測其生長曲線變化情形。進一步依其生長曲線變化選出適當?shù)臅r間點，加入最終濃度0. ImMIPTG以誘導(dǎo)大腸桿菌大量表達融合蛋白，并于37°C振蕩培養(yǎng)3小時后離心收集菌體。融合蛋白的表達情況則經(jīng)由SDS-PAGE及西式印跡法(western blotting)確認，以確認優(yōu)選的35L發(fā)酵條件。制備豐年蝦生物包埋口服疫苗豐年蝦的孵化稱取4克的豐年蝦干燥卵，置于250mL燒杯中，加入150mL淡水浸泡約半小時。以網(wǎng)篩過濾豐年蝦耐久卵并以適量淡水沖洗干凈。將豐年蝦耐久卵加入5升孵化液中，均勻散布。將打氣石置入并開始打氣，調(diào)節(jié)進氣體積約為每分鐘500立方厘米(維持溶氧大于2ppm)。打開照明設(shè)備，室溫及水溫保持在26至28°C之間。24小時后關(guān)掉打氣并將照明移至容器底部，將豐年蝦幼蟲利用趨旋光性誘引至容器底部，靜置5分鐘，此時未孵化卵及孵化的空卵殼會漂浮至水面，利用虹吸管原理或其它可吸水的器具將上浮卵殼吸除。將孵化的一齡幼蟲以網(wǎng)篩(孔徑120微米ym)輕柔過濾，以海水輕輕沖洗后更換2升新的孵化液。輕柔攪拌孵化液使豐年蝦幼蟲均勻散布，吸取一毫升孵化液滴入I毫升方格計數(shù)盤中，為避免幼蟲的擾動，可以放置在50°C加熱盤上加熱十分鐘殺死幼蟲，方便計數(shù)。計數(shù)時將計數(shù)盤置于解剖顯微鏡下，放大倍率設(shè)為60 100倍觀察。此計數(shù)盤上有劃線1000小格，計算方式可隨機選取10X 10小格(0. I毫升幼蟲數(shù))計算幼蟲只數(shù)，以同樣方法重復(fù)計算盤上其它位置數(shù)量后取平均數(shù)，再乘以10倍即為每毫升幼蟲數(shù)，或是可以將盤上所有幼蟲全部計數(shù)亦可。根據(jù)計算結(jié)果，調(diào)整豐年蝦密度至每毫升約為500只。將打氣石置入并開始打氣，調(diào)節(jié)進氣體積約為每分鐘300至400立方厘米(維持溶氧大于2ppm)。室溫及水溫保持在26 28°C之間，培養(yǎng)12至18小時后，豐年蝦將會進行第一次脫殼而長成ニ齡幼蟲，此時即可以進行生物包埋步驟。生物包埋將大腸桿菌以IOOOXg離心沉降。倒除多余的培養(yǎng)基，并用等量的PBS將菌體重新懸浮，洗去菌體上多余培養(yǎng)基。再以1000Xg離心一次，用適量的PBS重新懸浮菌體，制備成濃度為I X 101(lCfu/mL的菌液。殺菌方法為加熱殺菌法，將菌液置于65°C水浴槽中加熱10分鐘，殺菌完畢后置于冰上10分鐘。將豐年蝦ニ齡幼蟲分裝為所需要的體積，接著將準備好的菌液加入其中，使大腸桿菌終濃度約為lX101(lCfu/mL，適度打氣2小吋。
包埋結(jié)果確認采樣前先將打氣關(guān)掉，吸取2毫升豐年蝦包埋液至小網(wǎng)篩上并以大量清水沖洗。將豐年蝦幼蟲吸出移入離心管中。將微量離心管置于-20度冰箱10分鐘將豐年蝦幼蟲凍死后取出，倒在九厘米培養(yǎng)皿中并加入少許無菌水將豐年蝦幼蟲均勻散布，接著以微量吸管吸取500只ニ齡幼蟲至微量離心管中，以3000rpm離心使幼蟲集中在離心管底部并將離心管中的水分吸除，再吸取IOOy L無菌水加入離心管中。以微量研磨棒將豐年蝦幼蟲于微量離心管中小心并仔細磨碎。并進行SDS-PAGE及西式印跡法分析。含豐年蝦飼料的制作將已經(jīng)濾食或未濾食的ニ齡豐年蝦的水分盡量去除，利用冷凍干燥機將其凍干成粉末，豐年蝦粉末與一般粉碎飼料以i : 1000比例進行混合再重新制粒。飼料制作將菌液濃縮，利用冷凍干燥機將其凍干成粉末，菌粉與一般粉碎飼料進行混合，混合比例為Ig飼料混3. 3 X IO9Cfu大腸桿菌粉，再重新制粒。動物實驗實驗動物共分為四組實驗組PEIa-抗原性片段組，對照組分別為喂飼一般飼料、喂飼含豐年蝦飼料及喂飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料三組，共80只點帶石斑魚，重量平均約52. 36克、長度平均五到六吋，實驗過程約四個月。每個星期一、ニ、三喂食含抗原飼料，四、五、六喂食一般飼料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫后每ニ個星期，搜集魚血液，血液經(jīng)過靜置20 40分鐘后凝固，利用離心法處理后取其血液上清液以進行酵素免疫分析，測驗血液中對抗內(nèi)生性蛋白抗體的カ價。酵素免疫分析法利用抗原抗體專ー性結(jié)合的原理，首先將Iy g(100ii USPARC-His重組蛋白片段與附著緩沖液混合均勻，并加入96孔Nunc-Immuno 盤(NUNC )底部于4°C靜置隔夜，使蛋白結(jié)合至底盤，以PBST洗滌3次后，加入100 u L、含有5%脫脂牛奶的TBST溶液中于室溫下反應(yīng)I小時，再以PBST洗滌至少3次，將以PBST稀釋的待測血清作為ー級抗體，加入后于室溫靜置約2 3小吋，以PBST洗滌至少3次，接著加入ニ級抗體的老鼠抗石斑魚血清100 u L靜置室溫下I小時，以PBST洗滌至少3次，最后加入100 u L后方接有堿性磷酸酶的羊抗鼠血清作為三級抗體，于室溫靜置I小時后以PBST洗滌，最后每孔各加入50 y L受質(zhì)溶液p-硝基苯磷酸鹽(p-Nitrophenyl Phosphate)錠于室溫下靜置30分鐘(視呈色情況而定)，再以酵素細胞分析儀中讀取OD4tl5的吸光值。結(jié)果豐年蝦組首先抽取石斑魚血液，分離出血清之后利用酵素 免疫分析法，檢測喂飼含有肌肉抑制素抗原性片段的重組融合蛋白后，各時期的石斑魚血清對于抗重組石斑魚肌肉倍增蛋白質(zhì)C端抗原活性區(qū)域的抗體效價。抗體效價于免疫后第十周開始被偵測到，持續(xù)上升至第二十二周，其中PEIa-抗原性片段組的抗體效價較三組對照組喂飼一般飼料、喂飼含豐年蝦飼料及喂飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料為高，抗體效價達到超過400。(如圖I)計算二十四周內(nèi)的動物實驗期間的總飼料消耗量、體重變化(如圖2)以及飼料轉(zhuǎn)換率，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)PEIa-抗原性片段組與其它三組對照組于二十四周內(nèi)消耗總飼料量大約相等，PEIa-抗原性片段組平均飼料轉(zhuǎn)換率為I. 46，喂飼一般飼料、喂飼含豐年蝦飼料及喂飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料分別為2. 67，2. 58以及2. 81，即喂飼肌肉倍增蛋白質(zhì)抗原性片段的實驗組，在上市前的養(yǎng)成過程可花費較少的飼料得到肉質(zhì)較豐腴的石斑魚(如表I所示)。表I :
對照豐年豐年蝦豐年蝦及 組蝦及PEIaPEIa-抗原性片段
FCR 2.672.582.811.46實施例2 :免疫抑制肌肉倍增蛋白質(zhì)制備表達肌肉倍增蛋白質(zhì)抗原性片段重組蛋白的大腸桿菌建立35L發(fā)酵培養(yǎng)制程，將含有抗原性片段的大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養(yǎng)于50L發(fā)酵槽。將4管5mL經(jīng)LB/氨芐青霉素(Ampicillin)培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)隔夜，并將培養(yǎng)菌株分別接種至0. 2L的LB/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，共1L，于37°C振蕩培養(yǎng)至00_約0. 3，再加A 35L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每隔I小時取樣測定其OD6tltl監(jiān)測其生長曲線變化情形。進一步依其生長曲線變化選出適當?shù)臅r間點，加入最終濃度0. ImMIPTG以誘導(dǎo)大腸桿菌大量表達融合蛋白，并于37°C振蕩培養(yǎng)3小時后離心收集菌體。融合蛋白的表達情況則經(jīng)由SDS-PAGE及西式印跡法(western blotting)確認，以確認優(yōu)選的35L發(fā)酵條件。制備豐年蝦生物包埋口服疫苗豐年蝦的孵化稱取4克的豐年蝦干燥卵，置于250mL燒杯中，加入150mL淡水浸泡約半小時。以網(wǎng)篩過濾豐年蝦耐久卵并以適量淡水沖洗干凈。將豐年蝦耐久卵加入5升孵化液中，均勻散布。將打氣石置入并開始打氣，調(diào)節(jié)進氣體積約為每分鐘500立方厘米(維持溶氧大于2ppm)。打開照明設(shè)備，室溫及水溫保持在26至28°C之間。24小時后關(guān)掉打氣并將照明移至容器底部，將豐年蝦幼蟲利用趨旋光性誘引至容器底部，靜置5分鐘，此時未孵化卵及孵化的空卵殼會漂浮至水面，利用虹吸管原理或其它可吸水的器具將上浮卵殼吸除。將孵化的ー齡幼蟲以網(wǎng)篩(孔徑120微米ym)輕柔過濾，以海水輕輕沖洗后更換2公升新的孵化液。輕柔攪拌孵化液使豐年蝦幼蟲均勻散布，吸取一毫升孵化液滴入I毫升方格計數(shù)盤中，為避免幼蟲的擾動，可以放置在50°C加熱盤上加熱十分鐘殺死幼蟲，方便計數(shù)。計數(shù)時將計數(shù)盤置于解剖顯微鏡下，放大倍率設(shè)為60 100倍觀察。此計數(shù)盤上有劃線1000小格，計算方式可隨機選取10X 10小格(0. I毫升幼蟲數(shù))計算幼蟲只數(shù)，以同樣方法重復(fù)計算盤上其它位置數(shù)量后取平均數(shù)，再乘以10倍即為每毫升幼蟲數(shù)，或是可以將盤上所有幼蟲全部計數(shù)亦可。根據(jù)計算結(jié)果，調(diào)整豐年蝦密度至每毫升約為500只。將打氣石置入并開始打氣，調(diào)節(jié)進氣體積約為每分鐘300至400立方厘米(維持溶氧大于2ppm)。室溫及水溫保持在26 28°C之間，培養(yǎng)12至18小時后，豐年蝦將會進行第一次脫殼而長成ニ齡幼蟲，此時即可以進行生物包埋步驟。生物包埋將大腸桿菌以IOOOXg離心沉降。倒除多余的培養(yǎng)基，并用等量的PBS將菌體重新懸浮，洗去菌體上多余培養(yǎng)基。再以1000Xg離心一次，用適量的PBS重新懸浮菌體，制備成濃度為I X 101(lCfu/mL的菌液。殺菌方法為加熱殺菌法，將菌液置于65°C水浴槽中加熱10分鐘，殺菌完畢后置于冰上10分鐘。將豐年蝦ニ齡幼蟲分裝為所需要的體積，接著將準備好的菌液加入其中，使大腸桿菌終濃度約為lX101(lCfu/mL，適度打氣2小吋。 包埋結(jié)果確認采樣前先將打氣關(guān)掉，吸取2毫升豐年蝦包埋液至小網(wǎng)篩上并以大量清水沖洗。將豐年蝦幼蟲吸出移入離心管中。將微量離心管置于-20度冰箱10分鐘將豐年蝦幼蟲凍死后取出，倒在九厘米培養(yǎng)皿中并加入少許無菌水將豐年蝦幼蟲均勻散布，接著以微量吸管吸取500只ニ齡幼蟲至微量離心管中，以3000rpm離心使幼蟲集中在離心管底部并將離心管中的水分吸除，再吸取IOOy L無菌水加入離心管中。以微量研磨棒將豐年蝦幼蟲于微量離心管中小心并仔細磨碎。并進行SDS-PAGE及西式印跡法分析。動物實驗實驗動物共分為四組實驗組PEIa-抗原性片段組，對照組分別為喂飼一般飼料、喂飼含豐年蝦飼料及喂飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料三組，共40只點帶石斑魚，重量平均約157g、長度平均五到六吋，實驗過程約四個月。每個星期一、ニ、三喂食含抗原飼料，四、五、六喂食一般飼料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫后每ニ個星期，搜集魚血液，血液經(jīng)過靜置20 40分鐘后凝固，利用離心法處理后取其血液上清液以進行酵素免疫分析，測驗血液中對抗內(nèi)生性蛋白抗體的カ價。含豐年蝦飼料的制作將已經(jīng)濾食或未濾食的ニ齡豐年蝦的水分盡量去除，利用冷凍干燥機將其凍干成粉末，豐年蝦粉末與一般粉碎飼料以i : 1000比例進行混合再重新制粒。飼料制作將菌液濃縮，利用冷凍干燥機將其凍干成粉末，菌粉與一般粉碎飼料進行混合，混核比例為Ig飼料混3. 3 X IO9Cfu大腸桿菌粉，再重新制粒。結(jié)果豐年蝦組首先抽取石斑魚血液，分離出血清之后利用酵素免疫分析法，檢測喂飼含有肌肉抑制素抗原性片段的重組融合蛋白后，各時期的石斑魚血清對于抗重組石斑魚肌肉倍增蛋白質(zhì)C端抗原活性區(qū)域的抗體效價。抗體效價于免疫后第十周開始被偵測到，持續(xù)上升至第十六周，其中PEIa-抗原性片段組的抗體效價較三組對照組喂飼一般飼料、喂飼含豐年蝦飼料及喂飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料為高，抗體效價達到大約920。(如圖3)計算四個月的動物實驗期間的總飼料消耗量以及飼料轉(zhuǎn)換率，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)PEIa-抗原性片段組與其它三組對照組于四個月內(nèi)消耗總飼料量大約相等，PEIa-抗原性片段組平均飼料轉(zhuǎn)換率為I. 35，喂飼一般飼料、喂飼含豐年蝦飼料及喂飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料分別為I. 72,1. 76以及I. 82，即喂飼肌肉倍增蛋白質(zhì)抗原性片段的實驗組，在上市前的養(yǎng)成過程可花費較少的飼料得到肉質(zhì)較豐腴的石斑魚(如表2所示)。表2:
權(quán)利要求
1.一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的飼料組合物，其中該脊椎動物為魚。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的飼料組合物，進一步包含肌肉倍增蛋白質(zhì)、肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體、肌肉倍增蛋白質(zhì)、肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體生物包埋于豐年蝦體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體、肌肉倍增蛋白質(zhì)、肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段或抗肌肉倍增蛋白質(zhì)或其片段的抗體表達于微生物中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的飼料組合物，其中該微生物為大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段融合至綠膿桿菌外毒素區(qū)域la。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段為抗原性片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段位于融合蛋白上。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質(zhì)的片段線性重復(fù)排列于該融合蛋白中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。
文檔編號A23K1/18GK102793079SQ20111040805
公開日2012年11月28日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者陳宗岳, 黃意菱 申請人:陳宗岳