專(zhuān)利名稱(chēng)：一株用于防治蘇門(mén)白酒草的小孢莖點(diǎn)霉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)雜草的生物控制技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用對(duì)農(nóng)業(yè)雜草有很強(qiáng)致病作用和控制效果的病原微生物作為環(huán)境友好型生物除草劑，具體是一株用于防治蘇門(mén)白酒草的小孢莖點(diǎn)霉。
背景技術(shù)：
蘇門(mén)白酒草原產(chǎn)于南美洲，19世紀(jì)中期引入中國(guó)，近年來(lái)蘇門(mén)白酒草生長(zhǎng)迅速， 繁殖速度快，產(chǎn)生大量的種子，分布廣泛(特別是長(zhǎng)江沿岸地區(qū))，在它們生長(zhǎng)的周?chē)?，幾乎看不到本地植物生長(zhǎng)，特別是“破土”的地方，由于原有的植被受到破壞，這種植物乘虛而入，搶先生長(zhǎng)，形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，不僅造成大田糧食作物大量減產(chǎn)，影響經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)和社會(huì)穩(wěn)定， 而且由于其大量生長(zhǎng)在長(zhǎng)江流域一帶，很容易引發(fā)生態(tài)安全，造成嚴(yán)重的后果，是典型的惡草，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)對(duì)蘇門(mén)白酒草的研究較少，主要集中于對(duì)其形態(tài)特征、發(fā)生特點(diǎn)與危害等生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性及防除對(duì)策等方面，而國(guó)外對(duì)蘇門(mén)白酒草的研究多集中于黃菊屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化、生殖繁育特征和光合生理特性及遺傳學(xué)等方面。我國(guó)防除蘇門(mén)白酒草的措施主要是人工拔除和使用草甘膦等化學(xué)除草劑，人工除草費(fèi)工費(fèi)時(shí)且難以達(dá)到理想的效果， 而過(guò)多地使用化學(xué)除草劑會(huì)造成環(huán)境污染和殘留問(wèn)題(婁遠(yuǎn)來(lái)等，2002)。蘇門(mén)白酒草在我國(guó)的發(fā)生區(qū)域仍然在不斷擴(kuò)大，危害和造成的經(jīng)濟(jì)損失越來(lái)越嚴(yán)重。因此，尋求對(duì)這種惡性雜草有強(qiáng)致病性和生防控制作用的病原微生物，由此進(jìn)一步研制無(wú)殘留、不污染環(huán)境的生物除草劑，將不僅能安全有效地控制蘇門(mén)白酒草的為害，以避免由此造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且具有重要的商業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株用于防治蘇門(mén)白酒草的小孢莖點(diǎn)霉，該真菌菌株對(duì)蘇門(mén)白酒草有很強(qiáng)的致病作用和控制效果。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和基于“內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)”基因(ITS) 的分子生物技術(shù)將其鑒定為小孢莖點(diǎn)霉(Photm icr05770ra)，通過(guò)生物學(xué)特性試驗(yàn)測(cè)定確定了它生長(zhǎng)產(chǎn)孢和侵染致病的最適條件，并對(duì)其構(gòu)建了系統(tǒng)親緣性進(jìn)化樹(shù)，研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)產(chǎn)生毒素使雜草植株發(fā)病死亡的致病機(jī)理，分析了病菌及其毒素的寄主專(zhuān)化性。1.小孢莖點(diǎn)霉SMBC22菌株分離純化和篩選在重慶不同季節(jié)多次采集蘇門(mén)白酒草自然發(fā)病植株，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，經(jīng)室內(nèi)組織培養(yǎng)和純化得到不同類(lèi)型的真菌，用柯赫氏證病方法確定其中的致病菌，最后經(jīng)過(guò)致病性試驗(yàn)比較篩選獲得這種對(duì)蘇門(mén)白酒草具有很強(qiáng)致病作用的殺草病原真菌(SMBC022菌株)。2.SMBC022致病菌株的形態(tài)特征(圖1)鑒定將分離得到的強(qiáng)致病性病原菌 smbc022接種到PDA平板上培養(yǎng)，長(zhǎng)成的菌落呈圓形或近圓形，邊緣整齊，輪紋狀生長(zhǎng)，后期同心輪紋隆起較明顯。表面菌絲白色，菌落較薄，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，絨狀，3天內(nèi)菌落基部為白色，3天后部分逐漸轉(zhuǎn)變成黑褐色，最終基部形成黑灰相間的綸紋狀。菌落適宜生長(zhǎng)溫度為15-30°C，最適生長(zhǎng)溫度為^°C。菌絲無(wú)色，分枝，具隔，寬3. 1-4. 6 μ m，菌落在PDA培養(yǎng)基上光暗12h/12h下培養(yǎng)12d左右產(chǎn)孢。分生孢子器黑色，散生、埋生或半埋生于培養(yǎng)基中， 球型或近球形，直徑72 140 μ m，頂端有孔，產(chǎn)孢方式為瓶梗式。分生孢子橢圓形或卵形， 無(wú)色，單胞，部分細(xì)胞中部有溢縮，大小為(4. 5 5.8) μ mX (1. 6 2. 1) μ m，有1_2個(gè)油球。根據(jù)Sutton (1980)和Boerema et al. (2004)的分類(lèi)系統(tǒng)，參考相關(guān)的資料將該病原菌初步鑒定為小孢莖點(diǎn)霉。3. SMBC022致病菌株分子技術(shù)鑒定通過(guò)氯仿/異戊醇法抽提得到SMBC022 的因組DNA，將所提取的樣品基因組DNA溶液分別稀釋作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用 rDNA ITS 區(qū)段通用引物 ITS4 和 ITS5。ITS4:5 ‘ -CCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘ , ITS5 5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，，將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收并測(cè)序后，得到此真菌的rDNA ITS區(qū)段基因序列，其長(zhǎng)度為524bp，在Genbank的登錄號(hào)為HQ645974。將獲得的菌株序列登陸NCBI網(wǎng)站，通過(guò)BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，smbc-022ITS區(qū)段序列與NCBI GenBank中已登錄的DQ474092序列相似性為99 %，且具有唯一性。去掉18s和28s將病原菌SMBC022與Genbank中選取同源性較高的相似種屬的ITS序列用分析軟件進(jìn)行精確比對(duì)，另外使用序列分析軟件采用Neighbor-joining法將所得序列與相近序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征最終鑒定該菌為小孢莖點(diǎn)霄。其拉丁名是microspora,其屬于真菌界i(rcoia，半知菌門(mén)Deuteromycota,月空胞綱Coelowcetes,球殼孢目^MaeroAsiWel5中的莖點(diǎn)霉屬/7Ao a，中文名稱(chēng)為小孢莖點(diǎn)霄。該菌種的活體純培養(yǎng)已于2010年12月08日保藏于‘中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心’，保藏號(hào)CGMCC No. 4417。4.蘇門(mén)白酒草莖點(diǎn)霉的最佳培養(yǎng)和接種侵染條件該真菌菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)生分生孢子的最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，最適溫度^°C，最適酸堿度為pH7. 2，在這些條件下，菌落生長(zhǎng)快，產(chǎn)生分生孢子器和大量分生孢子；光照對(duì)真菌生長(zhǎng)產(chǎn)孢無(wú)明顯影響。病菌侵染致病的最佳條件是接種濃度在IO5個(gè)/mL數(shù)量級(jí)或更高，接種后保濕和暗光 24h,并在整個(gè)侵染期保持溫度23 。5.蘇門(mén)白酒草莖點(diǎn)霉的致病性和專(zhuān)化性蘇門(mén)白酒草莖點(diǎn)霉對(duì)蘇門(mén)白酒草有良好的致病作用。主要侵染植株葉片和莖稈。在室內(nèi)用病菌的分生孢子懸浮液直接噴霧接種后，3天即可發(fā)病，病植株率達(dá)100%，葉片失水變黑；接種7天后葉片枯死，其對(duì)蘇門(mén)白酒草的控制效果與草甘膦相當(dāng)。在田間接種后效果顯現(xiàn)稍延遲，第5天植株頂部全部黃化，2周后萎蔫死亡。在適宜條件下用高濃度分生孢子懸浮液(IO8個(gè)/mL)接種試驗(yàn)結(jié)果表明，該真菌對(duì)水稻、小麥、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在內(nèi)的6科13種水、旱作物都不致病，也不影響它們的種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)，這說(shuō)明蘇門(mén)白酒草莖點(diǎn)霉是蘇門(mén)白酒草的專(zhuān)性致病菌，若用于研制蘇門(mén)白酒草除草劑，可以保證生境中其它植物的安全。6.蘇門(mén)白酒草粗毒素用真菌的培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸發(fā)得到致病粗毒素。用該毒素的水液分別浸漬蘇門(mén)白酒草葉片和莖稈后Mh內(nèi)即表現(xiàn)毒性癥狀，7 內(nèi)葉片成浸漬狀變黑。用此粗毒素溶液處理前述13種植物的種子和植株后未觀察到毒性癥狀，說(shuō)明這種毒素也是高度專(zhuān)化的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是從自然生長(zhǎng)的蘇門(mén)白酒草上分離獲得的小孢莖點(diǎn)霉SMBC022菌株，是首次發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)新菌株，其分生孢子接種體對(duì)我國(guó)的重要外來(lái)入侵雜草——蘇門(mén)白酒草(C. sumatrensis)具有很強(qiáng)的致病控制作用，它產(chǎn)生的毒素對(duì)這種雜草也具有很強(qiáng)的毒性致死功效。病菌的菌劑和毒素對(duì)重要作物及環(huán)境中其它植物都沒(méi)有不良影響，表現(xiàn)出針對(duì)蘇門(mén)白酒草的高度專(zhuān)化殺草活性，可通過(guò)發(fā)酵菌體或仿生合成技術(shù)生產(chǎn)無(wú)殘留的環(huán)保型真菌性除草劑，在對(duì)蘇門(mén)白酒草的生物防治實(shí)踐中具有潛在的商業(yè)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。


圖1小孢莖點(diǎn)霉菌落的形態(tài)特征A為菌落；B為菌絲；C為分生孢子器；D為分生孢子
圖2小孢莖點(diǎn)霉菌對(duì)蘇門(mén)白酒草的室內(nèi)和室外致病性效果A室外接種SMBC022后蘇門(mén)白酒草葉發(fā)病情況對(duì)照?qǐng)D(al=ld，a2=3d, a3=7d) ；B.室內(nèi)接種smbc022后蘇門(mén)白酒草葉的發(fā)病情況對(duì)照?qǐng)D(bl=ld，b2=3d, b3=8d) ；C.室內(nèi)離體接種與CK對(duì)照?qǐng)D(cl=ld，c2=3d, c3=6d)
圖3小孢莖點(diǎn)霉菌毒素對(duì)蘇門(mén)白酒草的致病效果A和B為對(duì)照，A為無(wú)菌水處理的葉片B.為用乙酸乙酯提取的粗毒素稀釋液處理的葉片
圖4小孢莖點(diǎn)霉、P. microspora )根據(jù)同源性分析建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖5小孢莖點(diǎn)霉菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔基因ITS序列。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1.小孢莖點(diǎn)霉的分離純化與篩選
1. 1真菌分離培養(yǎng)用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，其配方是去皮的新鮮馬鈴薯200g， 葡萄糖和瓊脂各20g，加自來(lái)水至1000mL。先加水將馬鈴薯煮爛，雙層紗布過(guò)濾后加入蔗糖和瓊脂，補(bǔ)充適量的水至IOOOmL,充分?jǐn)嚭途鶆蚝笱b入三角瓶中，放入消毒器中滅菌后放置。使用前加熱熔融，倒入滅菌培養(yǎng)皿或試管中制成平板或斜面培養(yǎng)基，供真菌分離培養(yǎng)或菌種保存用。1.2分離培養(yǎng)和純化從自然條件下采集具有典型病害癥狀的蘇門(mén)白酒草植株樣品，漂洗干凈后剪取葉片病斑與健康部分交界的組織小塊兒O mm)，放入5%次氯酸鈉溶液中表面消毒以后用滅菌水漂洗3次，置于PDA平板中，在25°C溫箱中培養(yǎng)并每天觀察，待不同菌落長(zhǎng)出后，轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)成純的菌落，再轉(zhuǎn)移到PDA試管斜面培養(yǎng)基上，并編號(hào)標(biāo)明菌株，保存?zhèn)溆谩?. 3強(qiáng)致病菌篩選根據(jù)柯赫氏證病律步驟確定病原菌。用病葉組織分離純化后獲得各種真菌給健康蘇門(mén)白酒草植株葉片涂抹或針刺點(diǎn)滴接種，保證避光保濕Mh，在下生長(zhǎng)，觀察發(fā)病情況。引起接種葉片發(fā)病，表現(xiàn)相同癥狀的真菌即可確定為病原菌。將上述試驗(yàn)確定所有病原菌以相同的方法(涂抹霧或針刺點(diǎn)滴)給蘇門(mén)白酒草植株接種，并在相同而適宜條件下培養(yǎng)觀察接種植株上葉片病害的嚴(yán)重程度，比較篩選出引起蘇門(mén)白酒草發(fā)病嚴(yán)重的菌株，由此，本發(fā)明中篩選獲得了蘇門(mén)白酒草莖點(diǎn)霉菌。1. 4強(qiáng)致病菌株SMBC022的田間控制效果田間實(shí)驗(yàn)在西南大學(xué)南區(qū)后山一片主
5要生長(zhǎng)蘇門(mén)白酒草植株的(沒(méi)有噴施任何農(nóng)藥，蘇門(mén)白酒草長(zhǎng)勢(shì)基本一致)試驗(yàn)地進(jìn)行。將試驗(yàn)地隨機(jī)劃分為不同的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)選取蘇門(mén)白酒草10株。將配好的smbc022和其他致病菌菌落孢子懸浮液分別裝于手動(dòng)噴霧器中，噴于植株葉片表面，以無(wú)菌水為對(duì)照試驗(yàn)， 每個(gè)菌株和對(duì)照處理三個(gè)小區(qū)，定時(shí)檢查蘇門(mén)白酒草植株受害程度。菌落噴施后氣溫持續(xù)在25-35 °C，一周內(nèi)沒(méi)有降雨。從噴灑菌落日起，每天調(diào)查一次，每個(gè)小區(qū)隨意選取5株蘇門(mén)明白酒草，記錄每株蘇門(mén)白酒草植株受害程度，依據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算防治效果，連續(xù)調(diào)查 10 do1.5病原菌的鑒定(1)形態(tài)學(xué)觀察與鑒定.在PDA平板上培養(yǎng)病原菌，適時(shí)觀察菌落形態(tài)、分生孢子器和分生孢子的顯微特征；(2)分子生物學(xué)鑒定.根據(jù)Geiser建立的技術(shù)，提取菌株的基因組DNA，用真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITS4 5‘ -CCTCCGCTTATTGATATGC-3‘ ；ITS5 5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 做 PCR 擴(kuò)增得到此真菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因序列，測(cè)序，并將序列登錄到Genbank中；對(duì)該序列做Blast 分析，對(duì)比相似度最高的序列名稱(chēng)。另外使用序列分析軟件Mega4. LClustal等程序，采用 Neighbor-joining法將所得序列與相近序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并以自展(bootstrap)做可信度分析(重復(fù)1000次)。確定該病菌的分類(lèi)地位。實(shí)施例2.小孢莖點(diǎn)霉菌的培養(yǎng)和接種條件試驗(yàn)
2. 1溫度試驗(yàn)在培養(yǎng)5d的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板上用打孔器取直徑為 0. 5cm的SMBC22菌株的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，分別設(shè)10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、 35°C和40°C 8個(gè)溫度處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于7個(gè)預(yù)先設(shè)定好所需溫度的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用垂直十字法逐日測(cè)量菌落大小，每24h測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量5次，記錄數(shù)據(jù)。 PDA培養(yǎng)基的酸堿度約為pH7. 0。由此確定小孢莖點(diǎn)霉的最適生長(zhǎng)溫度。2. 2酸堿度實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基，共設(shè)置11個(gè)酸堿度處理。分別用1. 0 mol/ L的NaOH和HCl溶液將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)到4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0、 10. 0、11. 0和12. 0 (用電子pH計(jì)測(cè)定)，每個(gè)處理重復(fù)5次；病菌接種和生長(zhǎng)測(cè)量方法同 2.1。接菌處理后置于25°C下培養(yǎng)，每24h測(cè)量一次菌落直徑，連續(xù)測(cè)量6次。由此確定小孢莖點(diǎn)霉菌生長(zhǎng)的最佳PH值。2. 3培養(yǎng)基種類(lèi)的篩選實(shí)驗(yàn)共比較了 6種培養(yǎng)基對(duì)小孢莖點(diǎn)霉菌菌落生長(zhǎng)的影響，除了馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)外，另外五種培養(yǎng)基分別是1)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基 (PSA)水1000mL、馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂粉20g ；2)清水洋菜培養(yǎng)基(WA)水 1000 mL及瓊脂粉20g ；3)胡蘿卜培養(yǎng)基(CAA)水1000mL、胡蘿卜200g、瓊脂粉20g ；4)蘇門(mén)白酒草根莖煎汁培養(yǎng)基(ARS)水1000 mL、蘇門(mén)白酒草根莖200g及瓊脂粉20g;5)蘇門(mén)白酒草葉片煎汁培養(yǎng)基(ALA)水1000 mL、蘇門(mén)白酒草葉片200g和瓊脂粉20g。在配制 PDA、CAA、ARS及ALA時(shí)，先將所需量的馬鈴薯、胡蘿卜、雜草根莖或葉片切碎并放入水中煮爛(約煮沸30分鐘)，而后過(guò)濾除掉殘?jiān)⒍ㄈ葜?000 mL,最后再加入所需量的化學(xué)物質(zhì)成分，攪拌均勻，分別盛入三角瓶中濕熱滅菌后備用。各種培養(yǎng)基的PH值約為6. 8-7. 0，培養(yǎng)溫度25°C。由此確定病菌培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。2. 4光照試驗(yàn)的影響在培養(yǎng)5d的PDA平板上用打孔器取直徑為0. 5cm的SMBC022 菌株的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，光照梯度設(shè)置為在1500LUX下分別照射0、6、12、18和 24h0每個(gè)光照梯度做5次重復(fù)，用垂直十字法逐日測(cè)量菌落大小，每24h測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量5次。由此分析致病菌的在不同光照下生長(zhǎng)狀況。實(shí)施例3.病原菌粗毒素分離
3.1病菌培養(yǎng)濾液的準(zhǔn)備在500mL三角瓶中分別倒入250 mL馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)液，滅菌后待用。選取培養(yǎng)6-7d長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落，用打孔器取Φ6 mm大小的菌餅，接種到裝有250mL PS培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶接種8片，在25°C培養(yǎng)箱中12h光照/天條件下靜止培養(yǎng)15天。在超凈工作臺(tái)上，用定性濾紙(中速)過(guò)濾，即可得到培養(yǎng)濾液。由此準(zhǔn)備足夠的病菌培養(yǎng)濾液供毒素分離提取之用。3. 2毒素的萃取及活性試驗(yàn)有機(jī)溶劑萃取用乙酸乙酯對(duì)培養(yǎng)濾液進(jìn)行萃取，每一體積的培養(yǎng)濾液用等體積的乙酸乙脂萃取3次，每次用1/3體積的乙酸乙脂，然后合并有機(jī)相，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑后即可得到濃縮物。將乙酸乙酯萃取獲得粗毒素分別用水溶解后用作對(duì)水葫蘆葉片浸漬處理，測(cè)定其活性。結(jié)果提取物對(duì)蘇門(mén)白酒草葉片都表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒性。實(shí)施例4.病原菌及其毒素的安全(專(zhuān)化)性測(cè)定
4.1供測(cè)試的作物選擇了 6個(gè)科的13種重要水旱作物，包括禾本科的水稻、小麥、玉米，茄科的番茄、辣椒和煙草，葫蘆科的黃瓜和西瓜、絲瓜、冬瓜，十字花科的蘿卜、甘藍(lán)、油菜和白菜，豆科的花生、豌豆、蠶豆、大豆和綠豆，以及錦葵科的棉花。4. 2種子萌發(fā)試驗(yàn)選擇前述13種作物的健康種子，分別用菌絲和孢子懸浮液、病菌粗毒素溶液和清水(對(duì)照)浸泡12 36h (小粒種子處理時(shí)間短，大粒種子處理時(shí)間長(zhǎng))， 放置在濕濾紙上，在25°C生長(zhǎng)箱中萌發(fā)后記載種子萌發(fā)率。結(jié)果表明所測(cè)試的作物種子萌發(fā)率與對(duì)照都沒(méi)有顯著差異。4. 3作物植株生長(zhǎng)試驗(yàn)用溫水浸泡12 36h (根據(jù)種子大小而定)，放置在濕濾紙上，在25°C生長(zhǎng)箱中催芽。待胚芽露出后播種到盆栽缽中。缽內(nèi)加入經(jīng)過(guò)水洗和高溫烘干的沙土，然后加入一定量營(yíng)養(yǎng)液(水中加入適量的尿素、硫酸銨和磷酸鉀)。播種后在溫室條件下生長(zhǎng)，待植株長(zhǎng)到20厘米高時(shí)，分別用菌絲和孢子懸浮液、病菌粗毒素溶液和清水(對(duì)照)噴霧處理，同時(shí)以處理蘇門(mén)白酒草為發(fā)病對(duì)照。處理后每天觀察記錄各種植物的病變情況，到第15d時(shí)收獲植株，測(cè)定不同處理的生長(zhǎng)量。結(jié)果表明，用小孢莖點(diǎn)霉菌菌液和毒素液處理后蘇門(mén)白酒草分別在處理后第3天和第2天即表現(xiàn)出明顯的病害和毒素癥狀，而所有13種作物植株在處理15天后也沒(méi)有任何病變，用菌液和毒素液處理后的植株生長(zhǎng)量與清水對(duì)照植株的生長(zhǎng)量之間沒(méi)有顯著差異。這說(shuō)明病菌及其毒素對(duì)供試作物無(wú)任何不良影響。
權(quán)利要求
1. 一株用于防治蘇門(mén)白酒草的小孢莖點(diǎn)霉(Photm icr05770ra)，是從自然環(huán)境中生長(zhǎng)的蘇門(mén)白酒草(JConyza sumatrensis)發(fā)病葉片上分離純化而獲得的，其分生孢子和菌體提取的毒素對(duì)蘇門(mén)白酒草都有很強(qiáng)的致病作用和控制效果，其特征在于，菌株為SMBC022， 該菌株的保藏號(hào)為CGMCC NO. 4417。
全文摘要
一株對(duì)蘇門(mén)白酒草具有生防活性的小孢莖點(diǎn)霉菌株SMBC022，屬農(nóng)業(yè)雜草生物防治領(lǐng)域。此菌從自然環(huán)境寄主上分離獲得，根據(jù)形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定為小孢莖點(diǎn)霉。該菌生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，最適溫度28℃，最適pH7.2。用真菌培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取可得到致病粗毒素。該菌體懸浮液及其毒素液對(duì)水稻等13種重要作物都沒(méi)有不良影響。SMBC022菌體制劑和毒素液對(duì)惡性雜蘇門(mén)白酒草具有很強(qiáng)致病殺草作用，經(jīng)發(fā)酵菌體或毒素仿生合成技術(shù)可生產(chǎn)環(huán)保型真菌除草劑，具有重要的商業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01P13/02GK102382776SQ20111040955
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者劉佳, 譚萬(wàn)忠 申請(qǐng)人:西南大學(xué)