專利名稱：東亞砂蘚配子體再生體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種東亞砂蘚配子體再生體系的建立方法。
技術(shù)背景
東亞砂 W^Racomitrium japonicum)屬紫萼蘚科(Grimmiace)砂蘚屬 GfeCO iiri )，生于低海拔地區(qū)的巖面、巖面薄土和沙土上。廣泛分布于中國(guó)的黑龍江、吉林、遼寧、河南、江西等南北各省，日本、朝鮮、俄羅斯(西伯利亞?wèn)|南)、越南、澳大利亞等地也有分布。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化歷程中，紫萼蘚科中的大多數(shù)種類(lèi)在群落、莖葉以及假根結(jié)構(gòu)和生理上都產(chǎn)生了對(duì)旱生環(huán)境適應(yīng)的特征。目前，在國(guó)外，苔蘚植物中的小立碗蘚已成為研究植物分子生物學(xué)的理想實(shí)驗(yàn)材料，是研究基因功能的模式植物；土生墻蘚也已成為研究耐旱蘚類(lèi)生理生態(tài)和抗旱機(jī)理的研究模型。而有關(guān)于紫萼蘚科植物的研究報(bào)道在國(guó)內(nèi)外卻少之又少。若能從該科植物中找到抗旱相關(guān)基因，對(duì)于研究其耐旱機(jī)制、培育耐旱新品種， 在理論和實(shí)踐上都具有重要價(jià)值。東亞砂蘚為紫萼蘚科中的典型的小型耐旱蘚類(lèi)，久旱而不喪失生活力，是較好的抗旱基因的資源。野外生長(zhǎng)的材料是否來(lái)源于同一母本不能確定， 為了獲得均一、優(yōu)質(zhì)化的材料，更好的研究其耐旱機(jī)制，建立東亞砂蘚配子體的再生體系具有重大意義，而且目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有通過(guò)組織培養(yǎng)成功獲得東亞砂蘚配子體的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種東亞砂蘚配子體再生體系的建立方法，實(shí)現(xiàn)為苔蘚植物抗旱基因的篩選提供均一材料的目的。該方法不僅操作程序簡(jiǎn)單，而且培養(yǎng)成本也很低。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下(1)取適度培養(yǎng)后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段進(jìn)行表面消毒，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度30001UX，培養(yǎng)溫度20士2°C ；(2)將步驟(1)得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件光照時(shí)間10-14h，光照度3000-60001UX，培養(yǎng)溫度20士2°C ；(3)將步驟(2)得到的原絲體轉(zhuǎn)移到原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000 lux，培養(yǎng)溫度15-280C ；(4)將步驟(3)得到的原絲體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)70天，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000 lux，培養(yǎng)溫度20士2°C。
上述步驟(1)、(2)、(3)、(4)可以全部采用，或部分步驟單獨(dú)采用常規(guī)1^ + 0-40g/ L蔗糖作為培養(yǎng)基。
上述步驟(1)、(3)、(4)可以全部采用，或者部分步驟單獨(dú)采用改良Beneck + 0-40g/L蔗糖作為培養(yǎng)基。
上述步驟(1)、(3)、(4)可以全部采用或者部分步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤作為培養(yǎng)基。
上述步驟(1)、(2)可以全部采用或某一步驟單獨(dú)采用改良Knop + 0_40g/L蔗糖作為培養(yǎng)基。
上述步驟(2)、(3)可以全部采用或者某一步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L 蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸作為培養(yǎng)基。
上述步驟(3)、(4)可以全部采用或者某一步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L 蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤作為培養(yǎng)基。
上述步驟(3)中的原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)基還可以為常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 萘乙酸。
上述步驟(4)中的誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生培養(yǎng)基還可以為改良Beneck培養(yǎng)基+ 0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤。
上述步驟(4)中的誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生培養(yǎng)基還可以為改良Beneck培養(yǎng)基+ 0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤。
上述的常規(guī)MS 培養(yǎng)基成分為:KN03 1 900mg/L, NH4NO3 1650 mg/L，MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 170 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 30 mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/L, H3BO3 6. 2 mg/L, KI 0. 83 mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L，CoCl2 ·6Η20 0.025 mg/L, Na2-EDTA 37.25 mg/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 27.85 mg/L，甘氨酸 2.0 mg/L,鹽酸硫胺素0. 4mg/L,鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,煙酸0. 4mg/L,肌醇100mg/L。
上述的改良Knop 培養(yǎng)基成分為Ca (NO3) 2 · 4H20 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, MgSO4· 7H20 250mg/L, KCl 250mg/L, FeSO4· 7H20 12.5mg/L。
上述的改良Knop 培養(yǎng)基成分為Ca (NO3) 2 · 4H20 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, MgSO4· 7H20 250mg/L, KCl 250mg/L, FeSO4· 7H20 12.5mg/L。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，成本低，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)繁東亞砂蘚配子體的目的，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功。通過(guò)本方法能夠獲得遺傳特性相同的材料，用于抗旱基因的篩選，為研究苔蘚植物抗旱分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。因而具有十分重要的意義。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取培養(yǎng)一段時(shí)間后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成0. 5-lcm的小段，用洲洗潔精溶液浸泡IOmin后，用0. 02%的升汞處理45s，進(jìn)行表面消毒；消毒后接種到常規(guī)MS + 0-40 g/L蔗糖、改良Beneck + 0-40 g/L蔗糖、改良Knop + 0-40 g/L蔗糖培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000lux，培養(yǎng)溫度20 士 2°C。
培養(yǎng)結(jié)果如下改良Beneck + 0-40 g/L蔗糖、改良Knop + 0-40 g/L蔗糖這幾種培養(yǎng)基上，配子體染菌率特別高，主要是青霉和根霉，在此基礎(chǔ)上加大消毒液的濃度和消毒時(shí)間，也得到同樣結(jié)果，若消毒時(shí)間和濃度太高則配子體基本死亡，故以改良Beneck、Knop為基礎(chǔ)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基不適合東亞砂蘚無(wú)菌配子體的篩選。對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)基MS而言，MS培養(yǎng)基+ 0-40 g/ L蔗糖上染菌率低，含有40g/L蔗糖的培養(yǎng)基上配子體開(kāi)始褐化，其余情況對(duì)配子體生長(zhǎng)影響不大。故最終選擇常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L蔗糖作為無(wú)菌外植體篩選的最佳培養(yǎng)基。
實(shí)施例2將實(shí)例1篩選得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng) 20天左右，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000lux，培養(yǎng)溫度20 士 2°C。
制備誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的培養(yǎng)基，配方組成為以下3種①常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖；②常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤；③常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸。
常規(guī)MS 培養(yǎng)基成分為:KN03 1 900mg/L, NH4NO3 1650 mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 170 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 30 mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/ L, H3BO3 6. 2 mg/L, KI 0. 83 mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025 mg/L, Na2-EDTA 37. 25 mg/L, FeSO4 · 7H20 27. 85 mg/L,甘氨酸 2. 0 mg/ L,鹽酸硫胺素0. 4mg/L,鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,煙酸0. 4mg/L,肌醇100mg/L結(jié)果如下①常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，90%的配子體在刀切處會(huì)產(chǎn)生大量鮮綠色原絲體， 向四周呈匍匐狀生長(zhǎng)，接近為圓形，平均直徑為0. 94cm，平均長(zhǎng)度為0. 66cm。
②常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 0. 1_1. 5mg/L 6_芐基氨基嘌呤培養(yǎng)基中，在刀切處會(huì)產(chǎn)生很多量的鮮綠色原絲體，向四周呈匍匐狀生長(zhǎng)，接近為圓形，濃度為1. 5mg/L時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，平均直徑為0. 81cm，平均長(zhǎng)度為0. 54cm ；在部分葉腋處會(huì)產(chǎn)生新的芽體，隨著6-芐基氨基嘌呤濃度的增加產(chǎn)生新芽體數(shù)量增加，但總體來(lái)說(shuō)量較少，長(zhǎng)勢(shì)較弱。
③常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸培養(yǎng)基中，在刀切處會(huì)產(chǎn)生大量鮮綠色原絲體，向四周呈匍匐狀生長(zhǎng)，接近為圓形，濃度為1. Omg/L時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，平均直徑為0. 96cm，平均長(zhǎng)度為0. 71cm。
比較上述結(jié)果可以看出，常規(guī)MS培養(yǎng)基中不添加激素也能誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體，長(zhǎng)勢(shì)較好；添加不同濃度6-芐基氨基嘌呤的培養(yǎng)基中雖也能誘導(dǎo)形成原絲體，但長(zhǎng)勢(shì)并不如常規(guī)MS培養(yǎng)基；添加不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基中也能誘導(dǎo)形成原絲體， 長(zhǎng)勢(shì)與常規(guī)MS培養(yǎng)基中的差不多，但最終確定常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖培養(yǎng)基為誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的最佳培養(yǎng)基。
實(shí)施例3將實(shí)施例1篩選得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的常規(guī)MS + 30 g/L 蔗糖培養(yǎng)基上，按照以下4種培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)①培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間IOh;②培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間12h;③培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間14h;④培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度6000lux，光照時(shí)間12h。
結(jié)果如下在這4種培養(yǎng)條件下，接種在常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上的無(wú)菌外植體所產(chǎn)生的原絲體在平均直徑、平均長(zhǎng)度上差別不大，說(shuō)明光照強(qiáng)度、光照時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體影響很小。故最終確定誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度3000 lux，光照時(shí)間12h。
實(shí)施例4將實(shí)施例2、3得到的原絲體轉(zhuǎn)移到原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)50天左右，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度30001UX，培養(yǎng)溫度(20- ) 士2°C。
制備原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)的培養(yǎng)基，配方組成為以下7種①改良Knop培養(yǎng)基+0、30 g/L蔗糖；②改良Beneck培養(yǎng)基+0、30 g/L蔗糖；③常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖；④常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤；⑤常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 1. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸；⑥常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤；⑦常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 0. l-1.5mg/L萘乙酸。
結(jié)果如下①改良Knop培養(yǎng)基上原絲體生長(zhǎng)緩慢，一段時(shí)間后開(kāi)始發(fā)黃、逐漸褐變死亡，故其不適合于原絲體的生長(zhǎng)。
②改良Beneck培養(yǎng)基上原絲體成團(tuán)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快，顏色鮮綠，培養(yǎng)50天左右， 平均直徑為1. 71cm。
③常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上原絲體生長(zhǎng)旺盛，較快，顏色鮮綠，培養(yǎng)50天左右，平均直徑為2. 38cm。若培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，原絲體慢慢變黃，繼代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)會(huì)長(zhǎng)出鮮綠的新鮮原絲體。
④常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 1. 5mg/L 6_芐基氨基嘌呤培養(yǎng)基上，原絲體生長(zhǎng)稍慢，顏色鮮綠，50天左右平均直徑為1. 85cm，但能分化出大量小的芽體，生長(zhǎng)50天左右芽體數(shù)量增加。
⑤常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 1. Omg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸培養(yǎng)基上，原絲體成團(tuán)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快，顏色鮮綠，培養(yǎng)50天左右，平均直徑為2. 96cm。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，原絲體也會(huì)慢慢變黃，繼代培養(yǎng)會(huì)長(zhǎng)出鮮綠的新鮮原絲體。
⑥常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 0. 1_1. 5mg/L 6_糖基氨基嘌呤培養(yǎng)基上，原絲體長(zhǎng)勢(shì)與添加6-芐基氨基嘌呤的培養(yǎng)基上差不多，在濃度為1. 5mg/L時(shí)分化出的芽體數(shù)量非常^^ ο
⑦常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L萘乙酸培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20天左右發(fā)現(xiàn)原絲體頂端變?yōu)榧t黃色，長(zhǎng)勢(shì)較慢，繼續(xù)培養(yǎng)慢慢褐化死亡。
比較以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)MS +30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上，添加激素種類(lèi)對(duì)原絲體生長(zhǎng)有一定的影響，當(dāng)2，4- 二氯苯氧乙酸為1. Omg/L有助于原絲體的生長(zhǎng)，故最終將常規(guī)MS + 30 g/L蔗糖+ 1. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸培養(yǎng)基作為原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。
實(shí)施例5實(shí)施例2、3得到的原絲體轉(zhuǎn)移到原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)基常規(guī)MS基+ 30g/L蔗糖+ 1. Omg/ L 2，4- 二氯苯氧乙酸上，按照以下4種培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)①培養(yǎng)溫度17士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間12h ；②培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間12h;③培養(yǎng)溫度23士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間12h;④培養(yǎng)溫度沈士2°C，光照強(qiáng)度3000lux，光照時(shí)間12h。
結(jié)果如下在這4種培養(yǎng)條件下，當(dāng)溫度為時(shí)，原絲體團(tuán)從外圍開(kāi)始褐化，生長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)，培養(yǎng)一段時(shí)間基本死亡；當(dāng)溫度為23 士 2°C時(shí)，原絲體團(tuán)小部分開(kāi)始從外圍褐化，部分進(jìn)行正常生長(zhǎng)，但是緩慢，培養(yǎng)50天后平均直徑為1. 98cm ；當(dāng)溫度為20士2°C時(shí)，原絲體無(wú)褐化現(xiàn)象，長(zhǎng)勢(shì)較好，培養(yǎng)50天后平均直徑為2. 96cm ；當(dāng)溫度為17士2°C時(shí)，原絲體無(wú)褐化現(xiàn)象，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)50天后平均直徑為2. 22cm?？梢?jiàn)，溫度對(duì)原絲體的生長(zhǎng)影響較大， 高溫不適合于東亞砂蘚原絲體的生長(zhǎng)。故最終確定培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度30001UX， 光照時(shí)間1 為其最佳培養(yǎng)條件。
實(shí)施例6將實(shí)施例4、5得到的原絲體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000 lux，培養(yǎng)溫度20 士 2°C。
制備誘導(dǎo)原絲體產(chǎn)生配子體的培養(yǎng)基，配方組成為以下6種①改良Beneck培養(yǎng)基+0_30g/L蔗糖；②常規(guī)MS培養(yǎng)基+0、30g/L蔗糖；③改良Beneck培養(yǎng)基+0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤；④改良Beneck培養(yǎng)基+0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤；⑤常規(guī)MS培養(yǎng)基+0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤；⑥常規(guī)MS培養(yǎng)基+0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤。
結(jié)果如下①改良Beneck培養(yǎng)基上原絲體經(jīng)過(guò)30天左右的時(shí)間能分化出小的芽體，芽體繼續(xù)生長(zhǎng)40天左右能長(zhǎng)成平均長(zhǎng)度為2. 15cm的配子體。配子體在部分葉腋處會(huì)繼續(xù)分化出新的配子體，最終成簇生長(zhǎng)，較粗壯。在Beneck培養(yǎng)基上添加不同濃度的蔗糖發(fā)現(xiàn)，原絲體只進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生殖。分析可能原因是在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中蔗糖對(duì)芽體的生長(zhǎng)有抑制作用。
②在添加30g/L蔗糖蔗糖和不添加蔗糖的常規(guī)MS培養(yǎng)基中，原絲體一直保持營(yíng)養(yǎng)生殖，經(jīng)過(guò)大約6個(gè)月的生長(zhǎng)，部分能分化出小的芽體，將芽體繼代培養(yǎng)，約20天左右能長(zhǎng)成配子體，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。
③在添加激素的MS和Beneck培養(yǎng)基中，大約60天后6_BA和KT能誘導(dǎo)原絲體分化出小的芽體(濃度為1. 5mg/L時(shí)所產(chǎn)生的芽體最多)，將芽體繼代培養(yǎng)，約20天左右能長(zhǎng)成平均長(zhǎng)度為2. IOcm配子體，但所長(zhǎng)配子體與不添加激素的Beneck培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的配子體相比較細(xì)弱。
比較上述結(jié)果可以看出，不添加任何激素和蔗糖的改良Beneck培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)就能誘導(dǎo)處較長(zhǎng)較粗壯的配子體，故最終將改良Beneck培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)原絲體產(chǎn)生配子體的最佳培養(yǎng)基。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20士2°C，光照強(qiáng)度3000 lux，光照時(shí)間 12h。
權(quán)利要求
1.一種東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)取適度培養(yǎng)后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段進(jìn)行表面消毒，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度30001UX，培養(yǎng)溫度20士2°C ；(2)將步驟(1)得到的無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件光照時(shí)間10-14h，光照度3000-60001UX，培養(yǎng)溫度20士2°C ；(3)將步驟(2)得到的原絲體轉(zhuǎn)移到原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000 lux，培養(yǎng)溫度15-280C ；(4)將步驟(3)得到的原絲體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)70天，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12h，光照度3000 lux，培養(yǎng)溫度20士2°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(1)、(2)、(3)、(4)全部采用，或部分步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS + 0-40g/L蔗糖作為培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(1)、(3)、(4)全部采用，或者部分步驟單獨(dú)采用改良Beneck + 0_40g/L蔗糖作為培養(yǎng)基；其中的改良 Beneck 培養(yǎng)基成分為=NH4NO3 200 mg/L，KH2PO4 100 mg/L，MgSO4 · 7H20100 mg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 微量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(1)、(3)、(4)全部采用或者部分步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤作為培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(1)、(2)全部采用或某一步驟單獨(dú)采用改良Knop + 0-40g/L蔗糖作為培養(yǎng)基；其中的改良 Knop 培養(yǎng)基成分為=Ca(NO3)2 · 4H20 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, MgSO4 · 7H20 250mg/L, KCl 250mg/L, FeSO4 · 7H20 12. 5mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(2)、(3)全部采用或者某一步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸作為培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述述步驟(3)、(4)全部采用或者某一步驟單獨(dú)采用常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L蔗糖+ 0. 1-1. 5mg/ L 6-糖基氨基嘌呤作為培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(3)中的原絲體擴(kuò)繁培養(yǎng)基為常規(guī)MS培養(yǎng)基+ 30 g/L蔗糖+ 0. l-1.5mg/L萘乙酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(4)中的誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生培養(yǎng)基為改良Beneck培養(yǎng)基+ 0. 1-1. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤；其中改良Beneck培養(yǎng)基與權(quán)利要求3中的相同。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，其特征在于所述步驟(4)中的誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生培養(yǎng)基為改良Beneck培養(yǎng)基+ 0. 1-1. 5mg/L 6-糖基氨基嘌呤；其中改良Beneck培養(yǎng)基與權(quán)利要求3中的相同。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種東亞砂蘚配子體再生體系建立的方法，包括以下順序步驟取經(jīng)過(guò)適度培養(yǎng)后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段進(jìn)行表面消毒，接種到常規(guī)MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選得到無(wú)菌外植體；將無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)移到常規(guī)MS+30g/L蔗糖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生原絲體；將產(chǎn)生的原絲體轉(zhuǎn)移到擴(kuò)繁培養(yǎng)基上培養(yǎng)50天，再將原絲體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)產(chǎn)生配子體的培養(yǎng)基上培養(yǎng)70天。本發(fā)明首次建立了東亞砂蘚配子體再生體系的方法，方法簡(jiǎn)單，成本低，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)繁東亞砂蘚配子體的目的，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102511393SQ20111041034
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者張梅娟, 沙偉 申請(qǐng)人:齊齊哈爾大學(xué)