專利名稱：Kctd10基因剔除小鼠模型、構(gòu)建方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種KctdlO基因剔除小鼠模型、構(gòu)建方法及其應用。
背景技術(shù)：
鉀離子通道蛋白KctdlO是一個ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域蛋白，ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域最初在許多鋅指蛋白、離子通道和其它功能蛋白中發(fā)現(xiàn)，它位于這些蛋白的N端介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用。在許多蛋白中，ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域參與蛋白同源寡聚體的形成，或形成異源寡聚體。在許多轉(zhuǎn)錄因子中，ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域與一些蛋白相互作用以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。最近的研究表明，該結(jié)構(gòu)域參與蛋白的泛素化水解。至今，在人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有300多個ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域蛋白， 本領(lǐng)域迫切需要提供一種ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域蛋白敲除小鼠模型，它可以幫助研究者深入了解以KctdlO基因為代表的ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域蛋白的生物學功能提供有效的研究途徑和方法，并由此提供其應用。小鼠已成為研究人類疾病的一種重要模式生物。Cre-IoxP系統(tǒng)，已經(jīng)能夠較為容易地實現(xiàn)基因敲除從而構(gòu)建基因剔除小鼠模型。動物行為學及組織化學的迅速發(fā)展，以及實驗室高新技術(shù)手段給予了我們從一個生物整體的角度研究基因功能的良好平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種鉀離子通道蛋白KctdlO基因剔除小鼠模型，為研究ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域蛋白的生物學功能提供研究模型。本發(fā)明的目的之二在于提供該模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該模型在篩選促進胚胎發(fā)育中的應用。本發(fā)明的目的之四在于提供該模型在篩選促進血管生成中的應用。本發(fā)明的目的之五在于提供該模型在篩選促進心臟發(fā)育中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種與心臟、血管發(fā)育密切相關(guān)的鉀離子通道蛋白KctdlO基因剔除小鼠模型。一種構(gòu)建上述的鉀離子通道蛋白KctdlO基因剔除動物模型的方法，該方法的具體步驟為利用Cre-IoxP系統(tǒng)，將打靶載體電擊轉(zhuǎn)化胚胎干細胞，使其與基因組發(fā)生同源重組。再將陽性胚胎干細胞移植入胚胎，產(chǎn)生在KctdlO基因的兩側(cè)帶有IoxP位點的后代， 將這些后代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，就會產(chǎn)生KctdlO基因剔除小鼠模型。上述KctdlO基因剔除小鼠模型在篩選治療早期胚胎發(fā)育滯后藥物中的應用。上述KctdlO基因剔除小鼠模型在篩選治療早期胚胎血管發(fā)生受阻藥物中的應用。上述KctdlO基因剔除小鼠模型在篩選治療早期胚胎心臟發(fā)育缺陷藥物中的應用。本發(fā)明通過Cre-IoxP系統(tǒng)，構(gòu)建了確為可靠的KctdlO基因剔除小鼠模型。然后通過組織胚胎學實驗，采用多種組織胚胎學及分子生物學手段，發(fā)現(xiàn)KctdlO基因剔除會導
3致小鼠胚胎發(fā)育滯后，血管生成受阻，心臟發(fā)育缺陷，證明該基因的作用。


圖1，鉀離子通道蛋白KctdlO基因打靶載體示意圖。圖2，通過基因型鑒定的方法篩選KctdlO基因缺陷型小鼠。圖3，通過Wfestern免疫印跡和RT-PCR分析確認KCTDlO蛋白缺失。圖4，KctdlO基因缺陷型小鼠在胚胎發(fā)育早期發(fā)育滯后。圖5，KctdlO基因缺陷型小鼠血管發(fā)育障礙。圖6，KctdlO基因缺陷型小鼠心包膜異常擴大，心肌壁較薄，房室瓣缺失。圖7，免疫組化結(jié)果顯示KctdlO基因在早期胚胎發(fā)育中的心臟內(nèi)皮表達較高。
具體實施例方式實施例一鉀離子通道蛋白KctdlO基因敲除動物模型的構(gòu)建
KctdlO基因的剔除可以利用Cre-IoxP系統(tǒng)來實現(xiàn)，將打靶載體電擊轉(zhuǎn)化胚胎干細胞， 使其與基因組發(fā)生同源重組。再將陽性胚胎干細胞移植入胚胎，產(chǎn)生在KctdlO基因的兩側(cè)帶有IoxP位點的后代，將這些后代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，產(chǎn)生KctdlO基因剔除小鼠模型。通過基因型鑒定，RT-PCR，免疫印跡等實驗，本發(fā)明驗證了此模型中確實發(fā)生了 KctdlO基因的缺失，結(jié)果如圖1，圖2，圖3所示。實施例2鉀離子通道蛋白KctdlO基因敲除小鼠的表型分析
在實施例1中獲得的KctdlO基因缺陷小鼠早期胚胎發(fā)育過程中跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)KctdlO 基因缺陷小鼠在早期胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)發(fā)育滯后現(xiàn)象(圖4)、血管發(fā)育障礙(圖5)、心臟發(fā)育缺陷，心外包膜異常擴大，心肌壁相對較薄，房室瓣缺失(圖6)，免疫組化結(jié)果顯示 KctdlO基因在早期胚胎中的心臟內(nèi)皮中高表達(圖7)，顯示KctdlO在心臟的早期發(fā)育中具有很重要的作用。
權(quán)利要求
1.一種與心臟、血管發(fā)育密切相關(guān)的鉀離子通道蛋白KctdlO基因剔除小鼠模型。
2.—種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型的方法，其特征在于該方法的具體步驟為利用Cre-LoxP系統(tǒng)，將打靶載體電擊轉(zhuǎn)化胚胎干細胞，使其與基因組發(fā)生同源重組，再將陽性胚胎干細胞移植入胚胎，產(chǎn)生KctdlO基因的兩側(cè)帶有LoxP位點的后代，將這些后代與表達Cre重組酶的小鼠雜交，從而獲得KctdlO基因剔除小鼠模型。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型在篩選促進生長發(fā)育的藥物中的應用。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型在篩選促進血管生成的藥物中的應用。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型在篩選促進心臟發(fā)育的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與心臟、血管發(fā)育密切相關(guān)的鉀離子通道蛋白Kctd10基因敲除小鼠模型及其應用。通過同源重組和胚胎干細胞移植以及Cre-LoxP系統(tǒng)，得到Kctd10基因剔除小鼠模型，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)Kctd10基因缺陷小鼠在早期胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)發(fā)育滯后現(xiàn)象，并出現(xiàn)血管發(fā)育障礙、心臟發(fā)育缺陷，免疫組化結(jié)果顯示Kctd10基因在早期胚胎中的心臟內(nèi)皮中高表達，顯示Kctd10在心臟的早期發(fā)育中具有很重要的作用。
文檔編號A01K67/027GK102492686SQ201110411059
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者任凱群, 向雙林, 周建林, 張健, 胡翔 申請人:湖南師范大學